Dette manuskriptet beskriver en generisk tilnærming for skreddersydd design av mikrobielle dyrking media. Dette er aktivert av en iterativ arbeidsflyt kombinerer Kriging-baserte eksperimentell design og microbioreactor teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, som støttes av lab robotikk å øke pålitelighet og hastighet i væske håndtering media forberedelse.
En kjernevirksomhet i industrielle bioteknologi bruker mikrobiell produksjon celle fabrikker er gjentakelsene av prosessen av belastning engineering og optimalisering av bioprocess. Et viktig aspekt er forbedring av dyrking medium for å gi et optimalt miljø for mikrobiell dannelsen av produktet av interesse. Det er godt akseptert at media sammensetningen kan dramatisk påvirke ytelsen til bioprocess. Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner med mikrobiell systemer og dermed, dette er en givende trinn i bioprocess utvikling. Imidlertid er ofte målestokk media oppskrifter Hentet fra litteratur, siden skreddersydd design av dyrking medium er en langtekkelig oppgave som krever microbioreactor-teknologi for tilstrekkelig dyrking gjennomstrømning, rask produktet analytics, samt støtte håndtering trinnene av lab robotikk aktivere pålitelighet i væske. Videre er avanserte matematiske metoder nødvendig for rasjonelt analyse av måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter som for å oppnå optimal informasjon innhold.
Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av interesse, samt ytterligere bioprocess parametere. Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier. Anvendt Kriging verktøykassen (KriKit) er et generelt verktøy for Design av eksperimenter (DOE) som bidrar til bedre helhetlig bioprocess optimalisering. Den støtter også flere objektive optimalisering som kan være viktig å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser.
Moderne rekombinant genteknologi kan den vide bruken av tekniske enzymer for ulike applikasjoner i farmasøytisk industri, dyrefôr, organisk kjemi, og matfag1,2,3. Produksjon av tekniske enzymer i bulkmengder er et viktig tema for industriell bioteknologi og optimalisert rekombinante proteiner produksjon, og begge belastning og bioprocess engineering er nødvendig. Generasjonen av effektivt utviklet produksjon stammer, forskjellige genetisk biblioteker er tilgjengelig, f.eksbalansert gene expression4 eller økt sekresjon effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum er en stor produsent av aminosyrer i industriell skala6,7 og representerer en attraktiv ikke-konvensjonelle uttrykket vert for sekretoriske produksjon av rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-arginine translokasjon (Tat) veien finnes i C. glutamicum og ble tatt i bruk for rekombinant protein sekresjon10. Erfaring i bioprocess engineering om aminosyre produksjon på industriell skala, samt muligheten til å skille ut proteiner til finans beløp11 og stor robusthet om bioprocess inhomogeneities funnet i stor skala i nærområdet12,13, gjør C. glutamicum en lovende plattform organisme for sekretoriske produksjon av heterologous proteiner i industriell skala.
Ernæring middels optimalisering er kjent for å forbedre rekombinante proteiner produksjon med mikrobiell systemer14,15,16,17 og følgelig justering av medium komposisjon er en givende skritt i bioprocess utvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning på anvendelse av microtiter plater (MTPs) for mikrobiell dyrking22,23,24 banet vei for utvikling og design av MTPs for mikrobiell dyrking25 ,26 og utvikling av MTP-basert microbioreactor (MBR) systemer med avlytting og miljømessige kontrollere27,28. MBRs aktiverer en betydelig økning i eksperimentell dyrking gjennomstrømming. Dessuten er MBR systemer stammer fra andre typer bioreaktorer, f.eks, boble kolonner eller rørt tank reaktorer, tilgjengelig for mikrobiell bioprocess optimalisering29,30,31, 32.
Generelt, nytte optimalisering studier økt eksperimentelle gjennomstrømning, som blir enda kraftigere i kombinasjon med DOE metoder, som vurdere interaksjoner mellom design variabler eller redusere høy-dimensjonale søk på spaces. Følgelig kombinert bruk av MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist seg for å være en kraftig metode i bioteknologi,8,,16,,33,,34,,35.
En protokoll for medier optimalisering presenteres kombinere state-of-the-art lab automatisering, MBR teknologi med elektronisk prosess overvåking og Kriging-basert data analyse/eksperimentell design. Kriging-metode er implementert i en MATLAB verktøykasse (“KriKit”) som kan lastes ned og brukes uten kostnad36. Som eksempel vises maksimering av sekretoriske grønne fluorescent protein (GFP) med C. glutamicum ved å optimalisere sammensetningen av CgXII minimal medium. GFP titer ble valgt som optimalisering målet som det kan kvantifiseres lett og det er mye brukt som modell protein for studier på MBR systemer37,38,39.
Presentert rammene er delt i fire trinn, som er illustrert i figur 1. Trinnene er merket av for rammer og svarer til deler av protokollen. Det første trinnet (figur 1A) er å definere prosjektmålene og å finne de nødvendige metodene. Kombinasjonen av DOE metoder, MBR teknologi og lab automatisering lar en økt eksperimentelle overføringshastighet som krever kraftig databehandling. Det andre trinnet (figur 1B) mål å oppdage følsom design variabler (dvs., mellomstore komponenter) med høy innflytelse på optimalisering målet. Dette fører til et redusert antall design variabler av interesse. Det tredje trinnet (figur 1 c) består av en iterativ optimalisering for en mer detaljert undersøkelse av funksjonelle forholdet mellom gjenstående design variablene og målet med interesse. Bruker suksessivt utvidet datasettet, brukes Kriging tilnærming til å forutsi eksperimentelle utfallet unmeasured steder. Iterativ syklusen stopper så snart Kriging modellen spår en optimal eller platå med tilstrekkelig nøyaktighet. Resultatene er bekreftet i fjerde trinn (figur 1 d), begynner med en ytterligere sensitivitetsanalyse rundt identifiserte optimal. Hvis først ufølsom komponenter er funnet for å være ufølsom også i regionen optimal, er det rimelig å anta at dette gjelder under iterativ optimalisering prosedyren i det tredje trinnet. Etterpå er det anbefales å bekrefte optimalisering resultater ved ortogonale metoder, for eksempel en aktivitet analysen eller SDS-side.
Den generiske typen presentert protokollen tillater enkel tilpasning til ulike laboratorieutstyr, andre uttrykk verter og målet proteiner av valg, i tillegg til ytterligere bioprocess variabler som pH verdien eller dyrking temperatur.Videre kan andre optimalisering mål som protein produksjon rate, bestemt avkastning eller produktkvalitet være valgt for å passe omfanget av andre optimalisering studier.
Figur 1 : Arbeidsflyt optimalisering studium. Fire ramme boksene svarer til deler av protokollen, “Bli gravid the studie og definisjon av metoder” (del 1), “Sensitivitetsanalyse” (del 2), “Iterativ optimalisering” (del 3) og “Validering” (del 4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Den generiske typen presentert protokollen lar ulike tilpasninger, f.eksfor å studere andre mikrobiell uttrykk verter9,47,48,49,50, 51, eller optimalisere andre egenskaper av målet protein, som glykosylering mønster eller disulphide obligasjoner. Protokollen må også tilpasses den tilgjengelige laboratorieutstyr. Integreringen av en MBR-system kan øke eksperimentelle gjennomstrømning, som gjør store besparelser i tid. Men når du erstatter fullstendig instrumenterte og kontrollerbar bioreaktorer MBR systemer, må skalerbarhet resultater vurderes8,37,52,53. Bruk av DOE metoder og matematisk modellering bidrar til å maksimere innhold av måledata når det gjelder de studerte objektive54 ved effektiv eksperimentelle planlegging og modell-basert data tolkning15.
Endringer til metoden
Ved siden av multi-purpose og utvides robot flytende håndteringssystemer som brukes i denne studien, bør det nevnes at det er flere mindre væske håndteringssystemer kommersielt tilgjengelig som er i stand til å utføre denne oppgaven, og kan plasseres innenfor laminær strømning arbeid benker. Hvis ingen automatiserte pipettering systemer er tilgjengelig, kan ulike medier komposisjoner i henhold til DOE planen også realiseres ved manuell pipettering bruker enkelt og/eller flerkanals pipetter. Siden manuell forberedelsene er mer utsatt for feil og krever svært fokusert arbeid for ganske lang tid, anbefales det å forberede et lavere antall forskjellige medier komposisjoner.
Avhengig av funksjonene av næringsdrivende MBR, vil tilsvarende dyrking protokollen variere. For eksempel hvis ingen online måling av biomasse formasjon er tilgjengelig, kan det være tilstrekkelig å måle biomasse konsentrasjon etter ferdigstillelse av vekst eksperimentet. I kombinasjon med avlytting av pH og oppløst oksygen, som er implementert i flere MBR systemer, vekst metning kan bestemmes trygt. I prinsippet kan vekst eksperimenter utføres i MTPs alene plassert inne risting inkubatorer, uten bruk av en MBR-system. I dette tilfellet riktig dyrking forholdene må sikres: (1) oksygen-begrenset i nærområdet kan unngås ved å bruke MTPs med passende geometrier, sammen med riktig risting frekvenser og risting diameter, f.eks, square 96 eller 24 dyp bra plater drives på 1000 rpm på 3 mm kaste eller 250 rpm på 25 mm kaste, henholdsvis. Viktigere, jo lavere overføringshastigheter oppnåelig maksimalt oksygen, jo lavere viktigste karbon kilde bør være konsentrert. Som nevnt ovenfor, til denne studien var 10 g/L glukose egnet til å hindre oksygen-begrensning for næringsdrivende dyrking betingelsene; (2) prøvetaking av MTP kulturer for biomasse og produkt kvantifisering skal reduseres til et minimum. Hver gang MTP fjernes fra risting inkubator, oksygen overføring vil umiddelbart break-ned som kan resultere i ugunstig dyrking forhold; (3) i oppfatning av forfatterne anbefales ikke bruk av MTP lesere som dyrking enheter som disse enhetene ikke er utviklet for dette formålet. For eksempel risting mekanikk ble bygget for sporadiske blanding av microplates etter at reagens og dermed mangler ofte robusthet for lange serier av kontinuerlig risting levetid i dager. Videre kan ikke tilstrekkelig inngang kreves for mikrobiell nærområdet realiseres i disse leserne. Integrering av optisk tetthet i korte tidsintervaller krever stoppe av risting bevegelse, som fører til gjentatte perioder med oksygen-begrensning. Fordampning i slike systemer over lang dyrking perioder vil dessuten forvrenge resultater. Mer om overraskende komplisert tema på ved hjelp av MTPs for mikrobiell nærområdet, kalles leseren sitert litteratur22,23,24,25,26 og referanser der.
Ytterligere vurderinger
Å fremskynde iterativ optimering skritt anbefales det å nøye Velg analytisk for produktet kvantifisering. Raske og enkle metoder bør være foretrukket på bekostning av presisjon og nøyaktighet, som iterativ eksperimentell design strategien tåler eksperimentelle unøyaktighet. Men må de endelige resultatene bekreftes mot tilstrekkelig presise og nøyaktige produktet kvantifisering metoder som kan være mer komplisert. Generelt, nøye vurdering og beslutningsprosesser om studien prosedyrene krever innsats i begynnelsen av studien, men betaler ut i det lange løp, etter at rutinemessig metoder har blitt etablert.
Det anbefales å definere en referanse eksperiment som er i forhold til alle eksperimentene under optimalisering. Dvs er anvendt middels komponent konsentrasjoner samt målt resultatet normalisert via dele referanseverdier. På denne måten hver brukes og målt verdi kan tolkes som x-fold av referanseverdi. Ta i kontoen variasjoner mellom platene, utføres fem referanse eksperimenter på hver plate. Middelverdien av målt resultatet brukes for normalisering.
Det kan vanligvis ikke garanteres at utviklet mediet er også egnet for andre stammer. Men vil forbedret mediet sannsynligvis også være egnet for dyrking uttrykket stammer med små genetiske forskjeller, f.eksnår produsere enzym varianter med enkelt aminosyre erstatninger Hentet fra mutagenese studier ( men selv enkelt punkt mutasjoner har blitt beskrevet effekt cellenes stoffskifte og heterologous uttrykk ytelse55,56). I dette tilfellet, kan presenterte protokollen være et første skritt, etterfulgt av protokoller for høy gjennomstrømming uttrykk screenings57. Hvis protokollen brukes for middels utvikling med påfølgende skalere opp til matet-batch i nærområdet, må optimalisert mediet bekreftes tilsvarende bioprocess forholdene, som klone screening kampanjer på Mikroskala identifisert ulike topp utøvere for ulike fôring strategier og dyrking media52,58. Videre kan de introduserte KriKit36 generelt bidra til bedre helhetlig bioprocess optimalisering.Bare nylig ble verktøyet evnene utvidet til også støtte flere objektive optimalisering40, som kan være viktig for å optimalisere både oppstrøms og nedstrøms prosesser59,60.
The authors have nothing to disclose.
Den vitenskapelige aktiviteten til Bioeconomy Science Center ble økonomisk støttet av departementet for innovasjon, vitenskap og forskning innenfor rammen av NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Forfatterne takker departementet for innovasjon, vitenskap, og forskning av Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine University Düsseldorf for et stipend til Lars Freier i CLIB-Graduate klynge industrielle bioteknologi. Videre midler mottatt fra programmet for aktivering mellomrom “Helmholtz innovasjon Labs” av tyske Helmholtz forening til støtte til “mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz innovasjon Lab”.
BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
MATLAB | Mathworks | 2016b | |
KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |