Summary
Aquí presentamos una combinación de perfusión Doppler laser imaging (LDPI) y Láser Doppler perfusión monitorización (LDPM) para medir espinal cordón flujos de sangre local y saturación de oxígeno (SO2), así como un procedimiento estandarizado para la introducción de la médula espinal trauma en rata.
Abstract
Flujometría Doppler láser (LDF) es un método no invasivo para la medición de flujo (BF) de sangre, que hace que sea preferible para medir micro circulatorio alteraciones de la médula espinal. En este artículo, nuestro objetivo era utilizar imágenes de láser Doppler y monitoreo para analizar el cambio de BF después de lesión de la médula espinal. El escáner de imagen Doppler laser y el punta de prueba/monitor se emplearon para obtener en cada lectura. Los datos de LDPI proporcionan una distribución local de BF, que dio un panorama de perfusión alrededor del sitio de lesión y había hecho accesible para el análisis comparativo de BF entre diferentes ubicaciones. Midiendo intensamente la zona de sondeo sobre un período de tiempo, una sonda combinada fue utilizada para medir simultáneamente la saturación BF y el oxígeno de la médula espinal, mostrando el total de la médula espinal de la perfusión y suministro de oxígeno. LDF tiene algunas limitaciones, tales como flujo relativa, sensibilidad al movimiento y el cero biológico de la señal. Sin embargo, la tecnología ha sido aplicada en el estudio clínico y experimental debido a su configuración simple y rápida medición de BF.
Introduction
El tejido de la médula espinal es altamente vascularizado y extremadamente sensible a la hipoxia inducida por la lesión de la médula espinal (SCI). Nuestros estudios anteriores demostraron que el flujo de sangre de la médula espinal fue disminuyó significativamente después de conmoción cerebral lesión1,2, que podría estar relacionado con el déficit de la función motora. Estudios recientes han demostrado que la integridad de los vasos sanguíneos después de SCI es bien correlacionada con la mejoría de la función motora sensorial3. Se ha divulgado que vascularidad mejorada podría rescatar de la materia blanca, indirectamente conduce a mejor función4. Por lo tanto, el mantenimiento de la perfusión de la lesión de la médula espinal parece ser de primordial importancia para preservar la viabilidad y funcionalidad.
Los efectos de varios tratamientos en perfusión después de SCI han sido examinados por numerosos investigadores usando una variedad de técnicas en modelos experimentales de SCI5,6,7. Láser Doppler, como una técnica bien establecida, fue sin duda un método útil para la cuantificación de la perfusión en varios estudios animales y humanos8,9,10,11. La técnica se basa en medir el desplazamiento Doppler12 inducido mediante el movimiento de células de sangre rojas a la luz iluminar. Desde la comercialización de la técnica en la década de 1980, grandes progresos en la tecnología láser, fibra óptica y procesamiento de señales para medición de la perfusión por láser Doppler instrumentos13, que hizo LDF en una tecnología fiable.
En el presente estudio, se aplicaron ambos métodos de láser Doppler medición para evaluar el flujo de sangre (BF) en las médulas espinales de ratas conmoción. Debido a la naturaleza no invasiva de la tecnología y su configuración simple, el protocolo proporciona un método sensible, rápido y confiable para la medición de la BF de la médula espinal. Más importante aún, este método permite el estudio longitudinal de SCI post conmoción BF sin sacrificio de animales en cada momento.
Debido a la capacidad de evaluar la BF de los tejidos y los cambios rápidos de perfusión durante la estimulación, es posible aplicar este protocolo para evaluar cerebral BF14,15 , así como medir otros tejidos como hígado16, 17,18,de piel19e intestino20. En un modelo de rata de oclusión transitoria de la arteria cerebral media, las lecturas de Doppler láser se utilizaron para asegurar la correcta reducción de la tasa BF a niveles que se espera en la penumbra isquémica14. En las ratas que han sido sometidos a inducción de isquemia (CLI) de crítica, de escaneo Doppler láser se aplicó para observar extremidades BF antes y después del procedimiento CLI y durante diferentes períodos después de tratamiento21. Además, la biodisponibilidad y la separación metabólica de algunos fármacos dependieron de BF hepática, que fue detectado por LDF16. Por lo tanto, LDF podía ser ampliamente utilizado en la evaluación de un modelo experimental, farmacodinámicas y farmacocinéticas.
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Protocol
Protocolos animales que involucran animales de experimentación siguieron las pautas establecidas por los institutos nacionales de salud (NIH) y fueron aprobados por el cuidado Animal y uso Comité Capital médica de la Universidad de.
Los procedimientos de introducción de SCI y medición BF de la médula espinal mediante láser Doppler equipo se describen a continuación fueron utilizados en un estudio publicado1.
1. preparación para la cirugía
- Preparar solución 3% (p/v) de pentobarbital sódico en solución salina y administrar a la dosis de 35 mg/kg.
PRECAUCIÓN: pentobarbital sódico es una sustancia controlada. Deben mantenerse registros detallados y soluciones almacenan en un lugar seguro y bajo llave. - Esterilizar equipo y preparar el área de cirugía.
- Limpie el equipo de cirugía con los siguientes pasos: limpieza, autoclave a 121 ° C durante 30 minutos, luego secar en un horno de 60 ° C durante la noche del etanol del 75%. Esterilizar el área de cirugía con alcohol al 75%.
2. preparación de rata para la cirugía
- Anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (35 mg/kg). Todo el procedimiento debe tomar 30-40 min, incluyendo cirugía, mediciones de BF y suturas.
- Afeite la zona dorsal de la rata de la zona lumbar hasta el cuello. Se cortan el pelo tan corto como sea posible. Colocar la rata en a 40 ° C calefacción almohadilla para mantener una temperatura corporal constante.
3. laminectomía y la conmoción cerebral a la médula espinal
Nota: Para realizar laminectomía sólo para el grupo sham, siga los pasos 3.1 a 3.6.
- Coloque el animal dorsal hacia arriba. Esterilizar la parte depilada con yodo seguido de alcohol del 75% con bolas de algodón estériles. Hacer una incisión en la piel (4 cm) con el bisturí sobre el sitio de laminectomía cubierta torácicas vértebras T7 a T11.
- Cortar los músculos conectados a ambos lados de T8 a T10 para exponer las apófisis espinosas, las láminas y las articulaciones facetarias.
- Utilizar el bisturí para hacer incisiones que desconexión al cruce entre T10 y T11. Además exponer a la ensambladura por cuidadosamente por disección de la capa muscular para exponer el hueso.
- Utilice las tijeras para borrar más músculo de la lámina y en el pedículo con unas tijeras pequeñas. Se abrirá un pequeño espacio entre las vértebras en T10 y T11 (figura 1A). Lenta y delicadamente Inserte una pinza hemostática de esta brecha y romper el pedículo (figura 1B). Asegúrese de que la curvatura de las pinzas siempre se coloca lateralmente, lejos de la cuerda. Repita en el otro lado.
- Exponer la médula espinal (figura 1) y levante y romper la lámina. Asegúrese de no dejar cualquier fragmento de hueso libre o irregulares.
- Repita el proceso para quitar más láminas T9 y T8.
- Mover el animal a la tabla de equipo del impactador y utilizar el par de pinzas de Adson agarradas a la mesa para estabilizar la columna vertebral del animal por fijación de la Apófisis espinosa de T7 y T11, luego ajustar la pinza para enderezar la columna vertebral (figura 1).
- Poner al animal bajo el impactador, apunte la barra de ataque al centro de la médula espinal expuesta y baje la varilla para dentro de 3-5 mm de la superficie de la médula espinal.
- Configurar los parámetros de impacto como la fuerza de impacto (160 KD) y tiempo (1 s)
- Induce el Lic haciendo clic en el botón "Iniciar el experimento" en la interfaz del software, después, haga clic en "sí" en la siguiente interfaz para iniciar automáticamente el impacto. Después del impacto, el software muestra los datos reales del impacto junto a los parámetros establecidos, verificar los datos para asegurarse de que estaba cerca del punto de ajuste (Figura 1E).
Nota: Un signo típico para el éxito del experimento fue un período corto del movimiento de swing y extremidades cola involuntario después del impacto. Podrían hacerse también estímulos a la cola para comprobar para la reflexión de la extremidad. Sin embargo, es necesario para determinar la efectividad de la lesión inducida evaluación aparato locomotor como Basso, Beattie y Bresnahan (BBB) escala locomotor22,23 .
- Induce el Lic haciendo clic en el botón "Iniciar el experimento" en la interfaz del software, después, haga clic en "sí" en la siguiente interfaz para iniciar automáticamente el impacto. Después del impacto, el software muestra los datos reales del impacto junto a los parámetros establecidos, verificar los datos para asegurarse de que estaba cerca del punto de ajuste (Figura 1E).
4. Láser Doppler análisis
- Vea la Tabla de materiales para el información del escáner Doppler láser utilizado en este estudio. Para analizar la médula espinal expuesta, coloque el lado dorsal de la rata hacia arriba sobre un fondo negro, no-reflexiva.
- Configurar los parámetros de exploración: Abra el software de escaneado, haga clic en "Medida" para entrar a la interfaz gráfica de usuario de medida y haga clic en el botón "Configuración del explorador" para abrir la interfaz de configuración del escáner. Para analizar las áreas pequeñas, como en este experimento, seleccionar "Alta resolución" bajo el "Scan tamaño y opciones de visualización" para un modo de digitalización fino con mayor resolución (256 × 256 puntos de cubierta 4 × 10 cm2) (figura 2A). Haga clic en la opción "Explorar imagen" para determinar los perímetros de exploración (figura 2B).
- Haga clic en la opción "Distancia y vídeo" para ver la imagen en video directo. Coloque el escáner 10-13 cm por encima de la ventana quirúrgica y mover el fondo con el animal al centro de la médula espinal expuesta en la ventana de análisis (figura 2).
- Utilice la función "auto distante" bien ajustar la altura del análisis, tenga en cuenta que la altura de exploración debe mantenerse constante a través de todas las medidas en el experimento 2 de la figura.
- Utilizar una cubierta perdió la capacidad reflectora con una ventana para exponer solamente el área quirúrgico para minimizar el fondo y marcar la dirección del animal.
- En la "repetición de Scan", establece el número de análisis (en este caso usamos análisis de repetición 8) haga clic en "Aceptar" para abrir la interfaz de exploración de la repetición. Haga clic en el botón start para iniciar la exploración y todo el proceso tomará aproximadamente 3-4 min (Figura 2D).
5. Láser Doppler control
- Utilizamos a un monitor escáner con VP3 embotado sonda de aguja final entrega a monitor BF y SO2 en el tiempo. Conecte la sonda Doppler de láser perpendicular a un instrumento estereotáctica para configurar el equipo de monitoreo.
- Poner la rata en el lado dorsal del aparato estereotáxicas, arpillera al animal con un pequeño trozo de espuma de poliestireno cuando sea necesario a nivel de la médula espinal expuesta.
- Baje la sonda a la médula espinal al monitor BF.
Nota: Paso 5.3 es crucial para la reproducibilidad de la medición como las lecturas de datos son sensibles a la presión aplicada a la sonda, por lo tanto PRECAUCIÓN se requiere para no sobre - o debajo - position la sonda.- Examinar la incisión y retire cualquier exceso líquido o sangre usando un disco de algodón estéril.
- Use ejes X e Y de los aparatos para localizar la sonda a rostral al punto central de la médula espinal expuesta de 2 mm o punto de lesión y evitar la vena central.
- Use el eje Z para bajar lentamente la sonda hasta el nivel apenas tocando la superficie de la médula espinal. La sonda sólo debe tocar la superficie de la médula espinal pero no tan floja para permitir cualquier luz brillante escapar del lado del punto de contacto.
-
Registro de datos
- Abra el software de adquisición de datos, haga clic en el botón "nuevo experimento" para abrir la interfaz de configuración. Bajo la opción "General" Compruebe la configuración del sistema y haga clic en "Siguiente" (Figura 3A), en la configuración de la pantalla Seleccione el canal de BF y SO2 y haga clic en "Siguiente" (figura 3B).
- Información de archivo de entrada y haga clic en "Next" (figura 3) para entrar en la interfaz de grabación de datos, haga clic en el botón de triángulo verde para iniciar la grabación de datos de la sonda (figura 3D).
- Una vez que la señal es estables, de registros de datos durante 8 min consecutivos. Luego levante la punta de prueba y saque el animal aparato estereotáctica a suturar la incisión y poner el animal en cuidados postoperatorios.
6. suturas y cuidado después de la operación
- Sutura de la incisión: Inserte una aguja de sutura en el músculo a ambos lados de la incisión. Tire del hilo a través de, reunir a los tejidos, lo que cubre la médula espinal expuesta en el sitio de láminas quitados. Usando el sostenedor de la aguja, tire del hilo todo a través de, forma tres nudos cuadrados y recorte el hilo como cerca de los nudos posibles.
- Suturar la piel con 3-4 nudos cuadrados en la misma forma que la sutura de la incisión, luego recorte lo hilos aproximadamente 1 cm de los nudos.
- Colocar la rata en su lado en su jaula, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y el fondo de la jaula. Jaulas deben colocarse sobre las almohadillas de calefacción.
- Vigilar el animal hasta que despierta de la anestesia para asegurar que no hay sangrado después de la cirugía y que las suturas quedan cerradas.
- Inyectar por vía subcutánea bencil penicilina sodio en rata durante 3 días después de la cirugía, 120 mg/kg / día. Inyectar por vía intraperitoneal buprenorfina (0,05 mg/kg) inmediatamente después de la cirugía y después de la cirugía de cada 6 horas durante 1 día.
- Para asegurarse de que los animales tienen acceso a suficiente comida y agua, caben botellas de agua con caños extendidos y poner los alimentos cerca de los animales en la jaula.
Nota: Realizamos escala de calificación de BBB para evaluar la función de aparato locomotor miembro posterior de lo animales 24 h posterior a la lesión para excluir a los animales con una calificación de BBB sobre 0, por lo tanto, garantizar que el animal estaba paralizado por la lesión inducida. - Después de la cirugía, proporcionar vacío manual de vejiga urinaria aplicando suavemente la presión en el abdomen dos veces al día, si es necesario.
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Representative Results
LDPI fue utilizado para medir el BF en la médula espinal, que a lo largo del eje rostral caudal de la médula espinal se cuantificó mediante la extracción de perfiles lineales (figura 4). Figura 5A y figura 5B representan la proyección de imagen del flujo de la médula espinal del grupo sham y grupo SCI, respectivamente. Figura 5 y figura 5 representan el BF alterar el eje rostral caudal de la médula espinal de grupo sham y SCI, respectivamente. Una comparación de la figura 5A y figura 5B demuestra que SCI induce reducción de BF, y BF del epicentro fue menor que el cable de rostral y caudal.
LDPM mostró la señal de LD de dominio de tiempo y por lo tanto2 y figura 6 ilustraron la adquisición y procesamiento de los datos LDPM. Después de que los datos fueron registrados, un tramo de 8 min de datos continuos de la región de interés (ROI) fue seleccionado, que luego fue filtrada por un filtro incorporado para reducir al mínimo cualquier señal no biológicos. Posteriormente, el ROI se analizaron estadísticamente y los resultados fueron exportados en un formato de datos raw. Figura 7 registró la variación periódica de BF y SO2 en el tiempo en el grupo sham y SCI. Como se muestra en la Figura 7A, médula espinal BF del grupo SCI disminuida significativamente en comparación con el grupo sham. Simultáneamente, el SO2 de la médula espinal fue notablemente menor tras conmoción cerebral de la médula espinal (figura 7B), que era constante con el cambio de BF después de lesión. Para reducir el disturbio, se tomaron medidas repetidas veces y los datos se normalizaron.
Figura 1. Laminectomía y la conmoción a la columna vertebral. (A) desconecte a la unión entre T10 y T11. (B) Inserte las pinzas para romper el pedículo. (C) rotura de la lámina y exponer la médula espinal. (bosquejo esquemático de la anatomía) (D) estabilizar la columna en la tabla del experimento. (E) impacto inicial utilizando el software y comprobar los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Configuración de escaneo Doppler láser paso a paso. (A) configuración General para el análisis. (B) configuración de interfaz para los parámetros de análisis de imagen. (C) configuración de interfaz para video y distancia. (D) configuración de interfaz para la exploración de la repetición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Paso a paso de instalación de monitoreo Doppler láser. (A) inicie un nuevo experimento. (B) seleccione Visualización de canales. (C) de entrada de datos de objeto. (D) para empezar la grabación de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Proceso de la proyección de imagen de perfusión Doppler laser. (A) 8 continua exploraciones derivadas mediante la exploración de las ratas en el grupo sham. (B) la imagen promedio de análisis continuo. (C, D) Región de interés (ROI) fue seleccionado basado en la imagen infrarroja para extraer el perfil de intensidad a lo largo del eje central de la columna vertebral. El cuadro de inserción muestra el resultado perfilado del ROI. La barra de color indica unidades de perfusión medición por láser Doppler scanner donde azul representa el valor más bajo y el rojo representa el valor más alto. El instrumento detecta el valor relativo de la perfusión, es decir, "flujo". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. BF de la médula espinal fue detectada usando proyección de imagen de perfusión Doppler laser. (A, B) Una ROI de 5 mm fue dibujado en el mapa de flujo sobre el eje de la columna vertebral de la rostral a la médula caudal. (C, D) El perfil de intensidad de cada retorno de la inversión a lo largo de una línea centrada en el eje de la médula espinal se extrajo para la cuantificación.
Figura 6. Proceso de supervisión de perfusión Doppler laser. (A) la grabación de datos donde el marcador de tiempo indica el punto de partida. (B) selección de un ROI de 8 minutos. (C) los datos seleccionados fueron luego filtrados por un filtro integrado. (D) análisis estadístico de ROI. (E) exportación de los datos en bruto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Perfusión de la médula espinal se evaluó mediante láser Doppler perfusión monitorización. (A) s de 15 de una muestra de la salida de flujo de sangre cruda de grupo sham y grupo SCI. Muestra (B) A 15 s de la salida de la saturación de oxígeno crudo del grupo sham y grupo SCI. La sonda Doppler de láser fue colocada 2 mm rostral hasta el punto medio en el nivel justo encima de la superficie de la médula espinal en el lado derecho de la vena central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Algunos detalles deben ser notados al realizar este protocolo. En primer lugar, el proceso de anestesia y la cirugía debe llevarse a cabo más rápida y elegante como sea posible para reducir al mínimo la tensión introducida al animal. Para reducir el disturbio a los resultados, mantener el animal en un estado relativamente Pacífico y estable. En segundo lugar, debe prestarse más atención al sangrado durante la medición con equipos de láser Doppler, ya que sangre potencialmente puede interferir con la lectura. Por último, durante la grabación de datos, deben tener animales en un ambiente de temperatura controlada para evitar resultados inconsistentes causados por variación de temperatura.
Hay varios factores importantes, los investigadores deben considerar cuando se utiliza el sistema de escaneo Doppler láser. Como se menciona en el protocolo, la distancia de la exploración debe mantenerse constante durante todo el experimento para obtener resultados comparables. Para áreas pequeñas, sugerimos para producir datos confiables de la BF de alta resolución con múltiples exploraciones. Además, se recomienda colocar una gasa estéril con la dirección marcada del animal que cubre el área quirúrgico con una pequeña ventana solo exponer la columna vertebral para minimizar aún más el fondo.
Colocación de sonda es la consideración crítica en la adaptación y aplicación del Protocolo de monitoreo. La sonda debe ser perpendicular a la superficie medida y debe evitarse la presión excesiva. Para lograr este objetivo, la espina dorsal de la rata debe ser enderezada y nivelada por apoyo al animal con espuma de poliestireno si es necesario, la sonda debe colocarse el aparato y las coordenadas para hacer las medidas que se toman de aproximadamente la misma área.
Como comentamos en nuestro anterior artículo1, existen algunas limitaciones a esta tecnología, como la incapacidad de calibración de flujo absoluto y sensibilidad al movimiento artefacto24. Otra limitación bien notado es el biológico cero señal – es decir, la presencia de señal sin BF25,26. Para minimizar la influencia de estas limitaciones los resultados, las medidas deben tomarse repetidamente y normalización se recomienda para reducir el disturbio.
Se han desarrollado otras técnicas como la técnica de microesferas radiactivas y técnica de la ecografía Doppler para medición de BF. Sin embargo, el primero no es en tiempo real ya que debe ser inyectada una sustancia radiactiva en la sangre y el tejido debe ser suprimido para la medición de27. En cuanto a la tecnología de contraste realzado ultrasonido proyección de imagen, aunque es no-invasiva como LDF, agente de contraste (microburbujas) debe ser inyectado por vía intravenosa y cateterización de la yugular o femoral es necesaria que la infusión constante de microburbujas 28. en comparación con estas técnicas, LDF es capaz de medir de forma no invasiva el flujo microcirculatorio del tejido.
LDF señales consisten en diferentes características de tiempo y frecuencia. Para capturar estas características, se han aplicado métodos de análisis de fourier y análisis con ondículas para revelar las fluctuaciones de frecuencia periódica29,30. Estas oscilaciones manifiestan la influencia del corazón ritmo, respiración, actividad miógena intrínseca del músculo liso vascular, actividad neurogénica de la pared vascular y endotelial actividad metabólica31,32. En aplicaciones clínicas e investigación fundamental, LDF no sólo puede obtener la señal de BF, pero también la evaluación de BF microvascular puede proporcionar una plataforma investigar el deterioro microvascular y, en general, la patogenia de la enfermedad microvascular.
En el presente estudio, se aplicaron ambos métodos de LDF para evaluar BF en la médula espinal. Los datos de LDPI proporcionan una distribución geográfica de BF, que dio un resumen de la perfusión en la zona y permitió realizar análisis comparativo de BF en diferentes lugares. Midiendo intensamente la zona que con el tiempo, los datos derivados de la supervisión de LD proporcionan una descripción más detallada del flujo sanguíneo local, permitiendo análisis profundo, como espectro y análisis wavelet, para ganar una comprensión más profunda de la BF en el área , que es un tema de investigación futuro prometedor.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laser Doppler Line Scanner | Moor Instruments | moorLDLS2 | |
| Laser Doppler Monitor | Moor Instruments | moorVMS-LDF | |
| Probe for Monitor | Moor Instruments | VP3 | Blunt needle end delivery probe |
| Impactor | Precision Systems and Instrumentation | IH-0400 | |
| Phenobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Buprenorphine | Sigma-Aldrich | B-908 | |
| Syringe | Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd | 300841 | |
| Surgical suture needles with thread | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | 18T0329 (batch number) /4-0 | |
| Scalpel | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J11030 4# | |
| Scalpel blade | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J12130 20# | |
| Ophthalmic forceps | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | JD1040 | |
| Hemostatic forceps | Operation instrument factory of Shanghai Medical Instrument Co., Ltd. | J31050 | |
| Benzyl penicillin sodium | North China Pharmaceutical Co., Ltd | F6072116 (batch number) | |
| 75% alcohol | Dezhou Anjie Gaoke disinfection products Co., Ltd | 150421R (batch number) | |
| Iodine | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd | 20170102 (batch number) | |
| Rat | Laboratory Animal Center, The Academy of Millitery Medical Sciences | Sprague-Dawly (rat strain) |
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