Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Skyndsam strålning Biodosimetry automatiserade av disentrisk kromosom identifiering (ADCI) och dos uppskattning

doi: 10.3791/56245 Published: September 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Cytogenetiska disentrisk kromosom (DC) analysen kvantifierar exponering för joniserande strålning. Automatiserad disentrisk kromosom identifierare och dos Estimator programvaran uppskattar exakt och snabbt biologiska dosen från DCs i metafas celler. Det skiljer monocentric kromosomer och andra föremål från DCs, och uppskattar biologiska stråldosen från frekvensen av DCs.

Abstract

Biologiska stråldosen kan uppskattas från disentrisk kromosom frekvenser i metafas celler. Utför dessa cytogenetiska disentrisk kromosom testmetoder är traditionellt en manuell, arbetsintensiva process inte väl lämpad för att hantera volymen av prover som kan kräva undersökning i kölvattnet av en massa olycka händelse. Automatiserad disentriska kromosom identifierare och dos Estimator (ADCI) programvara automatiserar processen genom att undersöka bilduppsättningar metafas använder machine learning-baserad avbildning bearbetningsmetoder. De programvara väljer lämpliga bilder för analys genom att ta bort olämpliga bilder, klassificerar varje objekt som en centromer-innehållande kromosom eller icke-kromosom, ytterligare skiljer kromosomer som monocentric kromosomer (MCs) eller disentriska kromosomer (DCs), avgör DC frekvensen inom ett prov, och uppskattar biologiska stråldosen genom att jämföra prov DC frekvens med kalibreringskurvor som beräknats med hjälp av kalibrering prover. Det här protokollet beskriver användningen av ADCI programvara. Normalt importeras både kalibrering (känd dos) och test (okänd dos) uppsättningar av metafas bilder för att utföra korrekt dos uppskattning. Optimala bilder för analys kan hittas automatiskt med hjälp av förinställda bildfilter eller kan också filtreras genom manuell inspektion. Programvaran bearbetar bilder inom varje prov och DC frekvenser beräknas vid olika nivåer av kravnivåer för att ringa DCs, använder en machine learning-strategi. Linjär-kvadratisk kalibreringskurvorna genereras baserat på DC frekvenser i kalibrering prover exponeras för kända fysiska doser. Doser av proverna utsätts för osäkra strålningsnivåer beräknas från DC frekvenser använder dessa kalibreringskurvor. Rapporter kan genereras på begäran och ger Sammanfattning av resultaten av ett eller flera prover, av en eller flera kalibreringskurvorna, eller dos uppskattning.

Introduction

Strålning biodosimetry använder biologiska markörer, mestadels kromosomavvikelser som disentriska kromosomer (DCs) och att mäta stråldoser som individer utsätts för flyttningar av kromosomen. En biologiskt absorberad dos kan vara olika från fysiska dosen mäts av instrument beror på variabiliteten mellan individer. På samma sätt kan strålning av en viss fysisk dos producera olika biologiska exponeringar på grund av underliggande fysiologiska eller miljömässiga förhållanden. Kunskap om den biologiska dosen är av särskild betydelse för både diagnos och behandling.

DC analysen är den gyllene standarden för det vård-organisation för värld (WHO) och internationella atomenergiorganet (IAEA) för bedömning av biologiska strålningsexponering i människor. Det var första analysen rekommenderas av IAEA och som för bedömningen av strålning. DC frekvens är relativt stabil för cirka 4 veckor efter strålning exponering1 och deras kvantitativa korrelation med strålningsdos är korrekt, vilket gör DCs den idealiska biomarkören. Förhållandet mellan stråldos (refereras i Gray [Gy] enheter) och DC frekvens (refereras som antal DCs per cell) kan uttryckas som en linjär-kvadratisk funktion.

Cytogenetiska DC analysen har varit industristandard för ca 55 år2. Det har utförts manuellt, som kräver 1-2 dagar att analysera Mikroskop data från ett enda blodprov. Flera hundra till flera tusen bilder behövs för att korrekt uppskatta beroende på dosen3exponering för strålning. Vid doser överstigande 1 Gy, rekommenderar IAEA minst 100 DCs upptäckas. Undersökning av 250-500 metafas bilder är vanligt i biodosimetry cytogenetiskt laboratorier. För prover med exponeringar < 1 Gy, 3,000-5,000 bilder föreslås på grund av lägre sannolikheterna för DC bildandet. I båda fallen är det en labor-intensiv aktivitet.

Cytogenetiska biodosimetry laboratorier skapa sina egna in vitro- strålning biodosimetry kalibreringskurvorna innan bedömningen av biologiska doser i proverna. Blodprov från normala, kontroll individer utsätts för strålning och lymfocyter sedan odlade och förberett för metafas kromosomanalys. Med hjälp av dessa prover, är biologiska doser fått kalibrerade med kända fysiska doserna som avges av en standard strålkälla. Efter metafas cell bilder bokförs, experter granska bilder, räkna DCs och beräkna DC frekvenser för varje prov. Kalibreringskurvan är byggd genom att montera en linjär-kvadratisk kurva till DC frekvenserna vid alla doser. Sedan kan exponeringar i provet från individer utläsas genom matchande DC frekvenserna med kalibrerad doserna på kurvan eller ange dem i motsvarande linjära kvadratiska formel.

Vi har automatiserat både detektion av DCs och dos beslutsamhet att påskynda proceduren med hjälp av programvara. Automatiserade disentrisk kromosom identifierare och dos Estimator (ADCI) använder machine learning-baserade bildbehandling tekniker att upptäcka och diskriminera disentrisk kromosomer (DCs) från monocentric kromosomer (MCs) och andra objekt och automatiserar strålning dosen uppskattning. Programmet syftar till att avsevärt minska eller eliminera behovet av manuell verifiering av DC räknas och påskynda dos uppskattning genom automatisering. Det har utvecklats i samverkan med biodosimetry referenslaboratorier på hälsa Kanada (HC) och kanadensiska kärntekniska laboratorier (CNL). Deras synpunkter kommer att säkerställa att prestanda kommer att fortsätta att uppfylla IAEA kriterierna för denna analys.

Programvaran utför följande funktioner: 1) filtrering DCs och välja optimala metafas cell bilder för analys, 2) kromosom erkännande, DC upptäckt och DC frekvens beslutsamhet, och 3) beräkna stråldosen från dos-kalibrerad, cytogenetiska strålning data. Denna programvara bearbetar grupper av metafas bilder från samma person (kallas ett prov), räknas antalet DCs i varje med bild bearbetning tekniker och returnerar den uppskatta stråldosen emot av varje prov i enheter av gråtoner (Gy).

Programvaran har utformats för att hantera en rad kromosom strukturer, räkningarna och densiteter. Men fungerar algoritmen optimalt i metafas bilder som innehåller en nära komplett uppsättning väl separerade, linjära kromosomer4. Bilder som innehåller mycket överlappande uppsättningar kromosomer, flera celler, ofullständig metafas celler, Syster kromatida separation, kärnor, icke-kromosomala objekt och andra defekter kan minska riktigheten av algoritmen. Dedikerade bild urval modeller och andra objekt segmentering tröskelvärden kan filtrera ut majoriteten av optimala bilder och falska positiva DCs.

Disentrisk kromosom upptäckt utförs när en bild bearbetas. Algoritmen försöker avgöra vilka objekt i en bild är kromosomer och sedan lokaliserar de två regionerna som är mest sannolikt att vara centromerer på varje kromosom. Sedan, en serie av olika stöd vektor maskin (SVM) lärande modeller skilja kromosomer som DCs eller normal, monocentric kromosomer. SVM modellerna skiljer sig i sensitivitet och specificitet för DC upptäckt (se steg 3.1.4 nedan), vilket kan påverka DC frekvenserna som bestäms i ett prov.

ADCI bearbetar uppsättningar av målat metafas digitala bilder (i TIFF eller JPG-format) för ett eller flera prover Giemsa - (eller DAPI-). Programvaran analyserar DCs både kalibrering prover och prover. De fysiska doserna (i Gy) kalibrering prover är kända och används i framtagningen av en kalibreringskurva. Fysiska och biologiska doserna av individer med okända exponeringar är slutsatsen av programvaran från maskingenererade kalibreringskurvan. Även om laboratorier använder jämförbara tekniker, varierar kalibreringskurvorna från olika laboratorier ofta3. Båda kalibrering kurvan och test prover från samma laboratorium bör behandlas för korrekt dos uppskattning i proverna.

Denna programvara erbjuder hastighet, noggrannhet och skalbarhet vilka adresser som produktivitet krävs för att hantera en händelse där många individer samtidigt måste testas. Det utvecklades från 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Använder senaste hårdvara, detta skrivbordetPC-programvara kan bearbeta och uppskattning stråldos i ett patientprov av 500 metafas genomet motsvarigheter i 10-20 min 4. Koden är baserad på en uppsättning egenutvecklade bild segmentering och maskininlärning algoritmer för kromosomanalys. Expertanalys av varje kromosom utsätts för 3 Gy strålning gav jämförbar exaktheter ADCI. I en uppsättning av 6 prover av okända exponeringar (tidigare används i en internationella färdigheter övning), uppskattade programvaran doser inom 0,5 Gy av de värden som erhålls genom manuell granskning av samma data av HC och CNL, uppfyller IAEA: s krav för triage biodosimetry. Dessutom uppskattar genomför mellan olika laboratorier standardisering och slutligen reproducerbarhet av dos nytta att ha en gemensam, automatiserad DC scoring algoritm. Dock tillåter programvaran anpassning av bild filtrering och urvalskriterierna, så att skillnader i kromosom beredningsmetoder och kalibrering strålkällor som beaktas.

Denna programvara är ett grafiskt användargränssnitt (GUI) - baserat system som analyserar uppsättningar med kromosomen bilder som innehåller Giemsa (eller DAPI) - målat metafas celler för avvikelser som följd av exponering för joniserande strålning. De bild-apparater är digitalt fotograferad med ett ljus (eller epifluorescerande) Mikroskop system och varje uppsättning motsvarar ett olika urval. Programvaran använder tekniker för att upptäcka och diskriminera DCs från MCs och andra föremål för bildbehandling. Empiriskt härledda segmenteringen filter eliminera sedan automatiskt falska positiva DCs utan att påverka sant DCs. Slutligen, programvaran automatiskt filtrerar bort oönskade bilder baserat på olika Bildegenskaper hittade dålig kvalitet metafas bilder med precomputed (eller användardefinierade) bild urval modeller. Dessa bilder är de som innehåller överdrivet eller otillräckliga mängder ”bullriga” objekt, flera överlappande kromosomer, bilder saknas metafas kromosomer, överdrivet antal syster kromatiderna4. Automatiskt kuraterade bilddata används för att generera dos kalibreringskurvan från prover av kända stråldos och används för att uppskatta exponeringen av provföremål utsätts för okända doser.

Produktionen av programvaran kan visas och sparas som: (1) text-baserade utdata visas i konsolen, 2) tomter som kan sparas som bilder och 3) rapporter i HTML-format. Många aspekter av programvaran kan anpassas att passa de särskilda behoven i olika laboratorier. Enskilda laboratorier ge brukar kalibrering och provning prov beredd och samlat baserat på protokollet cytogenetiska validerats i detta laboratorium. Detta upprätthåller enhetlighet för provberedning och kalibreringskurvorna genereras från kalibrering prover tillämpas meningsfullt för att testa prover använder samma protokoll. Kalibreringskurvor kan också skapas från kurvan koefficienter eller DC frekvenser vid definierade doser. De mest exakta dosuppskattningar erhålls genom att filtrera ut lägre kvalitetsbilder och falska positiva DCs (FPs). Val av optimala bild undergrupper inom varje prov sker med hjälp av 'Bild urval modeller' som eliminerar subpar bilder som tenderar att införa FPs. En rad före validerade modeller medföljer programvaran, men ytterligare modeller med anpassade tröskelvärden och filter kan skapas och sparas av användaren.

När programvaran laddar framgångsrikt, det huvudsakliga grafiska användargränssnittet (GUI) presenteras (se figur 1). Från detta gränssnitt, prover, vardera bestående av en mapp med bildfiler för metafas cell, kan väljas och bearbetas för att identifiera DCs kalibreringskurvor kan skapas och jämfört och exponering av prover med stråldos kan bestämmas.

Figure 1
Figur 1: Den stora sektorer av den grafiska användargränssnittet inkluderar: en lista över prover (1), en förteckning över kalibrering kurvor (2), processen kö (3), som övervakar status för DC upptäckt i varje uppsättning bilder av varje prov, en tomt Visa (4), som sammanfattar statistiska eller andra kvantitativa egenskaper av en uppsättning bilder i prover eller kalibreringskurvor och en konsol (5) som innehåller beskrivande text som utgångar av varje åtgärd som utförs av programmet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. import och processen prover

  1. klicka ' prover ' i menyraden och välj ' nya prov '. Bläddra till en lämplig katalog som innehåller en grupp metafas bilder och klicka ' Välj mappen '.
  2. Skriv ett unikt ID för provet inom den ' ange ett unikt ID för det nya provet ' textfält. Detta ID identifierar provet i arbetsytan. Prov-ID måste innehålla alfanumeriska, ' _ ', eller '-' tecken endast. Inkludering av källa laboratorium och fysiska dos (för kalibrering prover) i provet ID är känd.
  3. (Tillval) ger en beskrivning av provet om så önskas inom den ' Beskrivning av provet (valfritt) ' textområdet.
  4. Klicka på ' OK ' att lägga till nya provet till arbetsytan.
  5. Upprepa steg 1.1 genom 1.4 att lägga till ytterligare prover. Skapa ett minimum av 3 kalibrering prover (sju eller fler rekommenderas 3 olika exponeringar) och minst en provet utföra dos uppskattning.
  6. Markera alla prover som skapats i steg 1.1 genom 1,5 i den ' prover ' listan och klicka på ' lägga till provexemplaren till processen kö ' (Graphic 5) ikonen.
  7. Klicka ' behandla alla prover i kön ' (Graphic 6)-ikonen för att behandla alla prover sekventiellt inom kön - en ' ADCI bearbetning ' dialogrutan visas alla prover i kön tillsammans med en progress baren som innehåller
  8. När alla prover har slutfört bearbetning, klicka på den Graphic 9. Spara prover nu, eller klicka på ' Spara ett bearbetat prov på en ADCI exempelfilen ' (Graphic 7)-ikonen för att spara ett bearbetat prov senare.

2. visning och urval av bilder (valfritt, rekommenderas steg)

Obs: detta steg beskriver användningen av metafas Image Viewer och skapandet av en bild val av modell. Vissa validerade bild urval modeller medföljer programvaran som kan användas i kalibrering kurva generation och dos uppskattning. Alltså, det här steget krävs inte, men det kan användas som en guide som beskriver stegen för att göra det om så önskas.

  1. Markera ett prov inom den ' prover ' Klicka på ' prover ' i menyn och välj ' bild Visa ' att öppna den ' metafas Image Viewer ' .
  2. Navigera bland bilderna
    1. Välj en bild från den nedrullningsbara rutan för att visa en viss bild. Klicka på ikonerna vänster och höger piltangenterna för att bläddra igenom bilder.
    2. Välj en SVM Sigma värde från listrutan Visa DC upptäckt resultat vid detta Sigma värde. Välj " obearbetat " från listrutan Visa raw-bilder utan kromosom konturer.
    3. Kolla den ' Invertera ' kryssrutan om du vill invertera färg och ljusstyrka värden för varje pixel i bilden.
  3. Kontrollera den ' bild i bevakningslistan ' kryssrutan så att den synliga bilden till en ' Watch list '. Klicka på ' Spara the Watch List till en textfil ' (Graphic 3)-ikonen för att spara namnen på alla bilder i bevakningslistan till en textfil.
  4. Bild urval modeller
    1. klicka ' Visa alla bilder ' (standardvalet) att inkludera alla bilder i rutan bild dropdown. Observera texten intill ' bilder som ingår ' att upptäcka fraktionen av bilder som valts ut av den för närvarande tillämpad avbildning urvalsmodellen.
    2. Klicka på ' Visa ingår bilder ' att inkludera endast dessa bilder som inte har uteslutits av den bild urvalsmodellen i den nedrullningsbara rutan.
    3. Klicka på ' Visa uteslutna bilder ' att inkludera bilder som har undantagits av tillämpad avbildning urval modell i den nedrullningsbara rutan.
    4. In den ' utesluta ' kryssrutan manuellt utesluta en enda bild.
      Obs: Manuellt undantagna bilder återställs till den valda bilden ställa om en bild urval modell används därefter.
    5. Spara ett urval av bilder genom att klicka på den ' Spara markering ' knappen. Ange ett filnamn för den Spara markeringen när du uppmanas. Klicka på ' Ladda urval ' att tillämpa en tidigare sparad markering.
    6. Klicka på ' tillämpa bildfilter ' att öppna den ' Använd Filter-baserad bild urval modell till nuvarande prov ' dialog, vilket skapar, sparar, eller tillämpar kriterier för att välja metafas bilder i ett prov.
    7. Välj en bild urval modell i listan förkonfigureras. Klicka på ' OK ' att tillämpa den nuvarande modellen.
    8. Ange en beskrivning för en önskad ny modell, definiera ' adressfilter för uteslutning av bild ', definiera ' Image Ranking och integration ', och klicka på ' Spara urval modell ' att skapa en bild Urvalsmodellen.
      Obs: Definitioner av ' Image Ranking och integration ' metoder och varje ' bild Uteslutningsfilter ' kan hittas i programvara online dokumentation 14.

3. Kurva Generation

  1. (Recommended optional step) kurva Calibration Wizard
    1. Se till att minst tre kalibrering prover finns i arbetsytan innan du fortsätter. Klicka på ' guider ' i menyraden och välj ' kurva kalibrering ' att öppna guiden kurva kalibrering.
      Obs: Även om bara tre prover matematiskt krävs att passa och beräkna kalibreringskurvan, sju eller fler prover som spänner över en rad exponeringar mellan 0 och 5 Gy rekommenderas. De ytterligare proverna är nödvändiga för att passa kalibreringskurvan till en linjär-kvadratisk dos-respons, men de optimala Sigma-värdena kan vara lägre för att få kurvor som är användbara för låg dos uppskattning (< 1 Gy); optimal Sigma värdena för doser över denna tröskel är olika (se steg 3.1.4).
    2. Fortsätt genom guiden inledande skärm och placera en bock bredvid varje önskad kalibrering prov. Ange den fysiska dosen för varje kalibrering prov markerad på detta sätt, (i Gy) provet var utsatt till inom dess angränsande textfältet. Fortsätta till nästa guiden skärm.
    3. Välj en bild urval modell om så önskas från listan över modeller som innehåller förinställda bild urval modeller levereras med programvaran förutom några manuellt skapade modeller. Fortsätta till nästa guiden skärm.
    4. Välj en SVM Sigma värde från listrutan. Fortsätta till nästa guiden skärm .
      Obs: En SVM Sigma värde 1.4 eller 1.5 rekommenderas för dos uppskattar > 1 Gy, och ett värde på 1,0 för uppskattningar nedan 1 Gy ( figur 2).
    5. Granska alla tidigare val på Sammanfattning skärmen och klickar ' avsluta ' att slutföra guiden, orsakar en prepopulatEd ' skapa en kurva ' dialogrutan visas.

Figure 2
figur 2: visualisering av effekten av att ändra värdet för SVM-Sigma från algoritmen på sant positiva (TP) och falskt positiva (FP) DC räknas, den positiva prediktiva fiskens (PPV), och sant positiva Betygsätt (TPR). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. skapa en kurva dialog.
    1. (Hoppa över detta steg om guiden användes) Klicka på ' kurvor ' i menyraden och välj ' nya Curve '. Välja ' passande kurva till dos-responsdata ' från listrutan presenteras i dialogrutan och klicka ' OK '.
    2. Ange en unik identitet för kurvan i den ' ange en unik identitet för den nya kurvan ' textrutan inom den ' skapa en kurva ' dialogrutan.
    3. (Valfritt) Skriv en beskrivning för den nya kurvan inom den ' lägga till en kort beskrivning för kurvan skapas ' textruta.
    4. (Hoppa över följande steg om guiden kurva användes för att skapa en kalibreringskurva) inställd kurva värden.
      Obs: Guiden kurva kalibrering som beskrivs i steg 3.1 förkonfigurerar fält i den ' skapa en kurva ' dialogrutan. Anvisningarna nedan beskriver hur du manuellt fylla i dessa fält. Om guiden användes, kan vissa stegen nedan fortfarande följas om så önskas, lägga till eller ta bort ytterligare data.
      1. Välj en SVM Sigma värde från alternativen i den ' SVM ' listrutan - det rekommenderas starkt att Sigma värdet här valt matchar värdet Sigma valt när du använder denna kurva för att utföra dos uppskattning.
      2. (Valfritt) ange en bild urval modell genom att klicka på den ' anger filen ' knappen.
      3. Klicka ' Input ' att lägga till en ny tom post i listan dos-respons under rubriken ' Input svar-dos data för att skapa en kurva '.
      4. Ange dosen av en kalibrering prov i Gy under rubriken ' dos '.
      5. Enter ' svar (DC/Cell) ' dras från utdata i konsolen när ett prov är markerat. Leta upp lämpligt DC/Cell värde för den tidigare valda SVM Sigma värdet inom konsolen eller från motsvarande exempelrapport (steg 5.1, om tillgängligt) och ange den i fältet.
      6. Upprepa föregående tre steg tills alla kalibrering prover har lagts till.
    5. Press ' validera Data ' att säkerställa att innehållet i den svar-dosen lista är korrekt formaterad – kontrollera alla fälten i listan svar-dosen är markerade gröna som visar giltiga data.
    6. Press ' OK ' att slutföra skapandet av kurvan. Spara den nya kurvan i den ' Spara kurva? ' dialogrutan som visas vid akuta ' OK '. Eller klicka på ' Spara kurvan till en ADCI curve fil ' (Graphic 4) markerad inom den ' kurvor ' lista senare.

4. Dos uppskattning

  1. (Recommended optional step) dos uppskattning guiden
    1. klicka ' guider ' i menyraden och välj ' dos uppskattning '.
    2. Fortsätt genom inledande guideskärmen och välj en tidigare skapad kalibreringskurva från den nedrullningsbara rutan - dess egenskaper visas nedan. Fortsätta till nästa guiden skärm.
    3. Placera en bock bredvid prover av okänd exponering att inkludera dem i dos uppskattning. Fortsätta till nästa guiden skärm.
    4. Observera beskrivning och egenskaper hos bilden urvalsmodellen tillämpas under kalibrering kurva generation. Observera att samma bild urval modell tillämpas på valda proven. Fortsätta till nästa guiden skärm.
      Obs: Nedanför beskrivningen av den bild urvalsmodellen, samma modell är förkonfigurerades och kommer att tillämpas på val av proven. Gäller samma bild val av modell för kalibrering och testa prover. Det är möjligt att tillämpa olika bild urval modeller genom att välja en annan modell från rullgardinsmenyn, detta rekommenderas inte.
    5. Välj en SVM Sigma värde från rullgardinsmenyn. Fortsätta till nästa guiden skärm.
      Obs: Det SVM Sigma-värde som används under kalibrering kurva generation är förkonfigurerades. Det rekommenderas att detta värde förblir oförändrat.
    6. Granska föregående valen på sammanfattningsskärmen och klicka på ' avsluta ' att slutföra guiden - en förkonfigureras ' dos kalkylator ' dialogrutan visas.
  2. Dos kalkylator
    1. (hoppa över detta steg om guiden användes) Markera en kalibreringskurva från listan över kurvor under rubriken ' kurvor ', klicka på ' kurvor ' i menyn och välj ' Beräkna dos ' att öppna den ' dos kalkylator ' dialogrutan.
    2. (Hoppa över dessa steg om guiden användes) ange värden för dos uppskattning.
      Obs: Guiden dos uppskattning som beskrivs i steg 4.1 förkonfigurerar fält i den ' dos kalkylator ' dialogrutan. Anvisningarna nedan beskriver hur du manuellt fylla i dessa fält. Om guiden användes, kan vissa stegen nedan fortfarande följas om så önskas, lägga till eller ta bort ytterligare data.
      1. Klicka ' Användning provexemplaren i arbetsytan att fylla DC frekvenser ' (Graphic 8) ikonen och markera prover inom den ' bearbetade prover i ADCI Arbetsytan ' listan lägga till de valda proverna till de ' DC frekvenser för dos uppskattning ' lista.
      2. Välj en SVM Sigma värde och bild val av modell för dessa prover från dropdown lådor.
        Obs: En SVM Sigma värdet matchar Sigma värdet används i kalibrering kurva generation krävs för korrekt dos uppskattning. Den Sigma-värde som associeras med kalibreringskurvan visas längst ned i den ' dosen kalkylator ' dialogrutan.
      3. (valfritt) Lägg till ytterligare prover genom att upprepa de två föregående stegen. Alternativt, lägga till flera prover samtidigt genom att markera flera prover i de ' bearbetade prover i arbetsytan ' listan.
      4. (valfritt) klickar du på den ' ingång en DC frekvensvärde ' (Graphic 1) ikonen manuellt ange en DC frekvens inte är associerade med varje prov om så önskas - nya DC frekvensen kommer att läggas till den ' DC avvikelser för dos uppskattning ' listan.
      5. (tillval) dubbel klick den ' namn ' fält av en manuellt angiven DC frekvens kan ändra dess namn.
      6. (tillval) Markera lämpliga prov och klicka ' ta bort DC frekvens ' (Graphic 2) ikonen Ta bort prover som har lagts till den ' DC Avvikelser för dos uppskattning ' lista fel.
    3. Klicka ' OK ' att stänga den ' dos kalkylator ' och utför dos uppskattning - resultaten är utdata till konsolen.
    4. När dosen uppskattning resultaten visas i konsolen i tabellformat för varje prov, Observera ' DC frekvens ', ' SVM ', ' beräknad dos ' (innehåller den uppskattade biologiska dos av provet i Gy), och ' tillämpas bild urval modell ' fält.

5. Rapportering

Obs: metoden används för att namnge en rapport och välj en katalog där den är sparad är gemensamma för alla rapporttyper. A ' rapportnamn ' måste anges. När en rapport genereras, kommer en katalog som innehåller rapportfiler att skapas med detta namn automatiskt. Denna katalog kommer att placeras inom är de ' rapportmapp '. Som standard, den ' rapportmapp ' är en katalog som heter ' rapporter ' Funna i datakatalogen anges under installationen.

  1. Exempelrapport
    1. klicka ' rapport ' i menyraden och välj ' exempelrapport ' att öppna den ' generera exempelrapport ' dialogrutan.
    2. Ange ett namn för rapporten i den ' rapportnamn ' textfält. Klicka på ' bläddra ' att ändra den ' rapportmapp ' om så önskas.
    3. Välj minst ett bearbetat prov att ta med i rapporten genom att placera en bock bredvid lämpliga prov i den ' Välj prover ' listan.
    4. Anger ett intervall av SVM Sigma värden som du vill generera DC distribution tomter genom att välja värden i ' Min ' och ' Max ' dropdown lådor inom den ' Distribution av DCs i prov ' område. Exkludera DC distribution tomter från rapporten om så önskas vid unchecking den ' inkluderar ' kryssrutan i den ' Distribution av DCs i prov ' område.
    5. Anger vilka tomter som innehåller filtrering statistik att ta med i rapporten genom att placera bockmarkeringar bredvid lämpliga tomter i den ' Välj tomter ' område. Klicka på ' OK ' att generera rapporten.
  2. Kurva rapport
    1. klicka ' rapport ' i menyraden och välj ' kurva rapport ' att öppna den ' generera kurva rapport ' dialogrutan.
    2. Ange ett namn för rapporten i den ' rapportnamn ' textfält. Klicka på ' bläddra ' att ändra den ' rapportmapp ' om så önskas.
    3. Välj minst en kurva för att ta med i rapporten genom att placera en bock bredvid lämplig kurvor i den ' Välj kurvor som ska inkluderas i rapporten ' lista. Klicka på ' OK ' att generera rapporten.
  3. Dos uppskattning rapporten
    1. utför dos uppskattning stegen som beskrivs i avsnitt 4.
      Obs: Dos uppskattning rapporter genereras från de resultat som anges i områdena tomt och konsolen. Således en dos uppskattning tomt måste vara närvarande i ritytan vid en rapport genereras.
    2. Klicka på ' rapport ' i menyraden och välj ' dos uppskattning rapporten ' att öppna den ' skapa dos uppskattning rapport ' dialogrutan.
    3. Ange ett namn för rapporten i den ' rapportnamn ' textfält. Klicka på ' bläddra ' att ändra den ' rapportmapp ' om så önskas.
    4. Klicka på ' OK ' att generera rapporten.

6. Granska funktionerna

Obs: Programvaran registrerar alla operationer som utförs under en session i en loggfil. Programmet ger en tillbehörs program som möjliggör loggfiler för att visas, sökte, används för att bedöma integriteten av analys och i vissa fall, att återställa exempeldata från ofullständig eller för tidigt avslutade sessioner.

  1. Klicka ' hjälp ' i menyraden och välj ' Visa loggar ' att öppna loggen fil viewer kompletterande programvaran.
  2. Se till att loggfiler visas i sidofältet till vänster i fönstret. Om inga filer är synliga, klicka ' fil ', välja ' Välj loggfilskatalog ', och bläddra till en katalog som innehåller loggfilerna.
  3. Dubbelklicka på namnet på en loggfil i sidofältet för att visa loggen filinnehållet i den ' Viewer ' tab.
  4. Välj det ' Search ' fliken och ange söktermer att söka en eller flera loggfiler.
    1. Input sökparametrar om så önskas i den ' från ', ' till ', ' användare ', ' licens ', ' drift ', och ' Parametrar ' fält.
    2. Använd skjutreglaget för att välja de ' Max sökresultat för varje fil '.
      Obs: Vissa sökparametrar, såsom användarnamn, återkommer många resultat i varje matchande loggfil. Den här parametern begränsar antalet sökresultat som visas i varje loggfil.
    3. Placera en bock i den ' Sök endast markerade filer ' checkbox (alla filer genomsöks som standard logg) och markera loggfiler i sidofältet för att söka bara en delmängd av loggfiler.
    4. Kolla den ' utför integritetskontroll ' kryssrutan (aktiverat som standard) att undersöka varje loggfil som är berättigade att vara sökt efter fel som är relaterade till en oväntad programvara uppsägning.
    5. Klicka på ' Sök ' söka loggfiler och iaktta Sök resultat på höger sida av fönstret.
    6. Klicka på den ' Visa loggfil ' knappen intill ett sökresultat att lyfta fram och visa den angivna raden i den ' Viewer ' tab.
  5. Log fil integritetsfrågor
    1. Klicka på den ' integritet ' flik för att visa fel hittas under integritetskontrollen (om kontrollen begärdes).
      Obs: En sökning måste utföras för att undersöka loggfiler för integritetsfrågor. Du utför en integritetskontroll utan att söka loggfiler för eny söktermer, helt enkelt lämna alla Sök Parameterfält svart i den ' Sök ' fliken, se till att den ' utför integritetskontroll ' är markerat och klicka på ' Sök '. Om integritetsfrågor hittas den ' integritet ' fliken bakgrundsfärgen blir red.
    2. Lösa integritet problem (utdata är grupperade efter loggfilen) där så är möjligt.
      Obs: För mer information om stegen för att lösa integritetsfrågor, konsultera den onlinedokumentation 14.

7. Kurva och dos uppskattning statistik alternativ

  1. klicka ' inställningar ' i menyraden och välj ' statistik alternativ ' att öppna den ' statistik alternativ ' dialogrutan.
  2. Välj en kalibreringskurva passande metod (minstakvadratmetoden eller maximalt-sannolikheten) från den nedrullningsbara rutan.
  3. Placera en bock bredvid ' Visa kalibrering kurva 95% CI, om tillämpligt ' Visa 95% konfidensintervall när rita en kalibreringskurva.
  4. Placera en bock bredvid ' dos uppskattningen beräknar 95% CI på grund av Poisson ' att beräkna konfidensintervall 95% på dosuppskattningar baserade på DC avkastning Poisson karaktär.
  5. Placera en bock bredvid ' dos uppskattningen beräknar 95% CI på grund av kurvan, om tillämpligt ' att beräkna konfidensintervall 95% på dosuppskattningar baserat på osäkerhet i samband med kalibreringskurvan.

Representative Results

Testning av programvaran genomfördes med metafas kromosom bilddata från HC och CNL. Blodprov bestrålades av en XRAD-320-enhet (250 kV röntgen, 12,5 mA, 2mm Al filtrering, dosraten: 0.92 eller 1,7 Gy/min) kalibreras med en ion kammare på HC och bearbetas vid båda laboratorierna. Perifera lymfocyter prover var odlade, fast och målat på varje anläggning enligt fastställda protokoll3,15. Metafas bilder från Giemsa-färgade bilder fångades självständigt av varje labb med hjälp av en automatiserad mikroskopi system. Experter i varje laboratorium gjorde DCs i flera av dessa prover manuellt, konstruerat egna kalibreringskurvor och beräknad doser av prover av okända exponeringar. En detaljerad beskrivning av dessa datamängder finns i tabell 1.

Fysiska dos Syfte HC förberedelse CNL förberedelse
Enligt namn # av bilder Enligt namn # av bilder
0 Gy Kalibrering HC0Gy 731 CNL0Gy 798
0.1 Gy Kalibrering HC01Gy 2162 NA NA
0,25 Gy Kalibrering HC025Gy 1826 NA NA
0,5 Gy Kalibrering HC05Gy 1054 CNL05Gy 1532
0.75 Gy Kalibrering HC075Gy 1233 NA NA
1 Gy Kalibrering HC1Gy 1566 CNL1Gy 841
2 Gy Kalibrering HC2Gy 1147 CNL2Gy 996
3 Gy Kalibrering HC3Gy 1212 CNL3Gy 1188
4 Gy Kalibrering HC4Gy 909 CNL4Gy 1635
5 Gy Kalibrering HC5Gy 1019 NA NA
3.1 Gy Test HCS01 540 CNLS01 500
2.3 Gy Test HCS08 637 CNLS08 500
1.4 Gy Test HCS10 708 NA NA
1.8 Gy Test HCS04 600 CNLS04 957
2.8 Gy Test HCS05 1136 CNLS05 1527
3.4 Gy Test HCS07 477 CNLS07 735

Tabell 1: Källor av bilddata som HC och CNL för utvärdering av programvaran.
Fotnot: Modifierad från tabell 1 i Rogan et al., 20164. Endast manuellt förvalda bilder var tidigare tillgänglig till oss från CNL. Ofiltrerade bilder har blivit tillgängliga och uppdaterade bild räknas. Dessutom, nyligen förvärvat HC prover (0.25Gy, 0.75Gy och 5Gy) som presenteras här.

Automatisk bild urval i prover

Bildkvaliteten är kritiska till rätt DC upptäckt i DC analys. Bild urval av cytogenetiska specialister är vanligtvis utförs manuellt i konventionella DC analys. ADCI använder kvantitativ bild kriterier för att automatiskt markera bilder före DC frekvens beräkning16. Användare kan antingen filtrera ut bilder baserat på specifika kromosom morfologier och/eller sortera celler enligt relativa andelar av längder av objekt enligt kända längder av cytogenetiska definierade grupper av kromosomerna i en normal mänsklig karyotyp (kallas den grupp-bin avstånd metod). De tillgängliga morfologiska filter använda skala-invariant trösklar för att avvisa cell bilder med ofullständig kromosom uppsättningar eller med flera metafaser, med metafasen kromosomer, med framstående syster kromatida dissociation, med starkt böjd och vriden kromosomer, med objekt som har mjuka konturer karakteristiska intakt atomkärnor, och de där färre objekt redovisas som kromosomer. Figur 3 (a) och (b) visar exempel på valda bilder, medan figur 3 (c) och (d) är exempel på bilder som filtreras bort av programvaran. Dessa bilder härrör från provet HCS05 (beskrivs i tabell 1) och väljs av de fördefinierade bild urval modell som rangordnar alla bilder av grupp bin avstånd, då väljer de bästa 250 bilderna. Kromosomer i figur 3 (A), (b) är väl avgränsade och uppvisa tillfredsställande morfologi. Figur 3 (c) innehåller alltför många överlappande kromosom kluster. Figur 3 (d) visar allvarliga syster kromatida separation. Syster kromatiderna är helt separerade för minst 8 av kromosomer och de centromeric sammandragningar är tvetydiga i de flesta av de andra kromosomerna.


Figure 3
Figur 3: exempel på metafas bilder i provet HCS05 (förstoring: 63 X), avmarkerad såväl vald av modellen 'Grupp Bin avstånd, Top 250 bilder'. (A) och (B) är valda bilder. (C) och (D) är bilder som har eliminerats genom modellen. (C) uteslöts eftersom det innehöll för många överlappande kromosomer och (D) hade alltför många separerade syster kromatider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Effekterna av att tillämpa dessa bild urval modeller märks genom att undersöka konfidensnivån för DC upptäckt i ett prov. Förekomster av DCs i en population av celler från ett bestrålat prov följer en Poisson-fördelningen. Chi-square godhet-av-fit testet jämför observerade DC frekvensen distributionen till förväntade anpassa till Poisson-fördelningen. Modeller att korrekt filter exempeldata uppvisar DC frekvenser inte avsevärt skiljer sig från den förväntade Poisson härledda värden (vanligen signifikansnivå > 0,01). Figur 4 visar DC förekomster och motsvarande passar Poisson fördelningar för HC4Gy provet i alla bilder vs. endast bilder som valts ut av den ”grupp bin avstånd, toppa 250 bilder” modellen. Figur 4 (b) visar en bättre passform till Poisson-fördelningen. Den p-värdet (0,36) av de filtrerade bilder avsevärt överstiger värdet av den ofiltrerade DC fördelningen i figur 4 a. På antingen 5% eller 1% betydelse nivåer, ofiltrerade provet i figur 4 a är mindre tillförlitliga, eftersom det innehåller lägre kvalitet DC data, som null-hypotesen av en Poisson-fördelningen av DCs avvisas.

Figure 4
Figur 4: Skärmdumpar av proportionella DC frekvenser passar till Poisson Dstributions av provet HC4Gy i programvaran. (A) alla bilder är inkluderade, (B) endast bilder som valts av modell (grupp bin avstånd, top 250 bilder) ingår. Legenden (överst till höger) visar statistiken för anpassa till Poisson-fördelningen (spridning Index, Mu test och Lambda) och Chi-square godhet fit test (p-värde) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Disentrisk kromosom (DC) upptäckt

Korrekt DC upptäckt är kritiska nödvändiga kravet på ADCI. Detekteras korrekt DCs och de missade av programvara definieras respektive som sant positiva (TPs) och falskt negativa (FNs). Objekt som inte är DCs, men felaktigt identifieras som DCs, benämns falska positiva (FPs). FPs är monocentric kromosomer, kromosom fragment, separerade syster kromatider, överlappande kromosom kluster och icke-kromosomala objekt. Figur 5 visar resultaten av DC upptäckt i två metafas bilder. Objekt 1 och 3 är TPs, medan objektet 4 är en FP bestående av två distinkta monocentric kromosomer conjoined längs deras korta armar. I figur 5 (a), objektet 2 var ursprungligen en FP, men därefter korrigeras av FP filter i programvaran. 5-objekt och objekt 6 i figur 5 (b) är sannolikt exempel på FNs.

Figure 5
Figur 5: Skärmdumpar visar metafas kromosom klassificering av potentiella DCs. (A) En bild i prov CNL1Gy (förstoring: 63 X) visar 1 TP, objektet ”1”; och 1 korrigerat FP, objektet ”2”. (B) en bild i prov CNL4Gy (förstoring: 63 X) visar 1 TP, objektet ”3”; 1 FP, objektet ”4”. och 2 potentiella FNs, objekt ”5” och ”6”. TPs, korrigerade FPs, normala monocentric och oklassificerade kromosomer beskrivs respektive med röda, gula, gröna och blå konturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Dosen uppskattning av prover

Det slutliga resultatet av ADCI analyser är dosen uppskattningar av prover utläsas kalibreringskurvor. Dos-uppskattningar som gjorts av programvaran för proven i tabell 1 anges i tabellerna 2 och 3. För jämförelse, den fysiska stråldosen som avges och manuell skårade doserna av experter på HC för prover HCS01, HCS08 och HCS10 indikeras. På samma sätt visas de fysiska och manuell gjorde doser av CNL experter för CNLS04, CNLS05 och CNLS07.

Figur 6 visar kalibreringskurvorna med strålning dosuppskattningar för Health Canada biodosimetry laboratorieprov HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 och HCS07. Kalibreringskurvan genereras med prover HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy och HC4Gy. Den bild urvalsmodellen innehållande 3 Z-Poäng-baserade filter + ”grupp bin avstånd, top 250 bilder” tillämpas på alla prover. Dosuppskattningar tillsammans med tillhörande statistiska analyser redovisas i tabell 2.

Figure 6
Figur 6: Skärmdump av dos uppskattning av HC testprover. Svarta fyrkanter representerar kalibrering prover. Bilder i proverna och kalibrering prov väljs av modellen (3 FP filter + grupp bin avstånd, topp 250 bilder). Tjocka streckade linjerna representerar kartläggning av DCs/metafas genom kalibreringskurvan beräknad dos. Tunna streckade linjer beteckna övre och lägre 95% konfidensintervallet för DCs/metafas. Färg koder av prover: klarröd, HC S01 (fysiska dos: 3.1Gy, HC innebäras dos: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); mörkgröna, HC S04 (fysiska dos: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); ljus blå, HC S05 (fysiska dos: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); mörkblå, HC S07 (fysiska dos: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); mörkröda, HC S08 (fysiska dos: 2.3Gy, HC innebäras dos: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); ljust gröna, HC S10 (fysiska dos: 1.4Gy, HC innebäras dos: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prover Fysiska dos HC innebäras dos ADCI beräknad dos Beräknade dosen LCL Beräknade dosen UCL P-värde *
HCS01 3.1 3.4 3 2.3 3.8 0.117
HCS08 2.3 2.5 2 1.4 2.7 0.815
HCS10 1.4 1.4 0,95 0,5 1,55 0.211
HCS04 1.8 NA 1,85 1,25 2,55 0.0293
HCS05 2.8 NA 2,95 2,25 3,75 0.00354
HCS07 3.4 NA 2,35 1.7 3.1 0,0002

Tabell 2: Dos uppskattning resultat av HC testprover.
Fotnot: Modifierad från tabell 3 i Rogan et al., 20164. ADCI dosuppskattningar tidigare rapporterat var baserade på ofiltrerat bilder och kurva montering utfördes med hjälp av minsta kvadratmetoden. Här kalibreringskurvan var passform med metoden maximalt-sannolikhet och en bild urval modell som innehåller 3 FP filter + ”grupp bin avstånd, top 250 bilder” tillämpades före dos uppskattning. Beräknade dosen UCLoch LCL avser dos uppskattning övre och lägre 95% konfidensintervall baserat på DC avkastning Poisson karaktär. * Chi square godhet passform till teoretiska Poissonfördelning; NA: Resultat av manuellt antagna dos inte tillhandahölls.

Stråldos uppskattningar för prover från kanadensiska kärntekniska laboratorier CNLS04, CNLS05, CNLS07, CNLS01 och CNLS08 visas i figur 7. Kalibreringskurvan genereras med prover CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy och CNL4Gy. Vi tillämpat en bild urval modell bestående av 6 FP filter till alla prover. Resultaten med statistiska analyser redovisas i tabell 3.

Figure 7
Figur 7: Skärmdump av dos uppskattning av CNL testprover. Svarta fyrkanter representerar kalibrering prover. Bilder i testprover och kalibrering prover väljs med 6 FP filter. Tjocka streckade linjerna representerar kartläggning av DCs/metafas genom kalibreringskurvan beräknad dos. Tunna streckade linjer beteckna övre och lägre 95% konfidensintervallet för DCs/metafas. Färg koder av prover: klarröd, CNL S04 (fysiska dos: 1.8Gy, CNL innebäras dos: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); mörkröda, CNL S05 (fysiska dos: 2.8Gy, CNL innebäras dos: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); ljust gröna, CNL S07 (fysiska dos: 3.4Gy, CNL innebäras dos: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); mörkgröna, CNL S01 (fysiska dos: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); blå, CNL S08 (fysiska dos: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prover Fysiska dos CNL innebäras dos ADCI beräknad dos Beräknade dosen LCL Beräknade dosen UCL P-värde *
CNLS04 1.8 1.7 1,95 1,25 2,45 0.0545
CNLS05 2.8 2.7 3,05 2,75 3.35 0,325
CNLS07 3.4 3.1 3.4 3 3,75 0.473
CNLS01 3.1 NA 3,75 3.35 > 4 7.63E-11
CNLS08 2.3 NA 2.8 2,25 3.3 0.777

Tabell 3: Dos uppskattning resultaten av CNL testprover.
Fotnot: Modifierad från tabell 3, Rogan et al., 20164. ADCI dosuppskattningar tidigare rapporterat baserades på ofiltrerad (HC) eller valts manuellt (CNL) bilder och kurva montering utfördes med hjälp av minsta kvadratmetoden. Här kalibreringskurvan var passform med metoden maximalt-sannolikhet och en bild urval modell som innehåller 3 FP filter + ”grupp bin avstånd, top 250 bilder” tillämpades före dos uppskattning. Beräknade dosen UCL och LCL, se respektive dos beräknade övre och lägre 95% konfidensintervall baserat på DC avkastning Poisson karaktär.
* Chi square godhet passform till teoretiska Poissonfördelning; NA: Resultaten av manuellt antagna dos var inte tillgänglig.

Uppskattning av stråldosen inom linjär spänna av kalibreringskurvan (< 1 Gy) kan utföras med programvaran, men en Sigma värde 1.0 rekommenderas är att ytterligare minska frekvensen av felaktig klassificering DCs (figur 8).


Figure 8
Figur 8: Skärmdumpar av två kalibreringskurvorna härrör från HC kalibrering prover på olika Sigma värden. (A) HC kalibrering prover: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, och 5Gy på Sigma = 1,5. (B) HC kalibrering prover: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, och 5Gy använder SVM Sigma = 1.0. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Dessa analyser visar att det finns små, men acceptabla skillnader mellan fysiskt och biologiskt antagna dos tolkas av experter och av programvaran. Skillnaden mellan antingen manuell eller programvara uppskattning från fysiska dosen benämns som ”fel”. Felet i de antagna doserna av prover manuellt poängsätts av HC och CNL är ≤0.3 Gy. Automatiserad behandling av programvaran är mindre exakt än experter, men i allmänhet inom IAEA-specificerade triage ± 0,5 Gy3. För de flesta proven i tabellerna 2 och 3producerade programvaran rätt resultat inom denna tröskel. Dock uppvisar HCS07 och CNLS01 en dålig godhet-av-passform till Poisson-fördelningen, vilket tyder på att det fanns potentiella problem i bild och DC kvalitet i dessa prover som inte löstes genom tillämpning av bilden och FP urval modeller. Tröskeln för betydelse för p-värde verkar vara alltför stränga när det gäller HCS05, där programvaran nöjaktigt bestämmas korrekt dos.

Discussion

Funktioner och begränsningar av programvaran

Protokollet beskrivs i denna uppsats introducerar det typiska stegvisa förfarande används i ADCI att importera och bearbeta cytogenetiska metafas bilder, skapa strålning kalibreringskurvor och uppskatta biologiska dos i individer eller prov utsätts för okänd strålningsnivåer. Dock är det inte nödvändigt att utföra dessa instruktioner sekventiellt. Exempelvis många prover av okänd dos kan bearbetas och analyseras med samma precomputed kalibreringskurvan. Dessutom när bearbetningen är klar kan bild urval och DC filtrering modeller vara upprepade av användaren. Tillämpningen av en lämplig bild urval modell beror på egenskaper och kvalitet metafas bilddata, som i sin tur bygger både på laboratoriet protokollet används för att förbereda celler och stringens kriterier används för att markera celler med automatiserade metafas capture system. Kromosom morfologier skiljer sig bland biodosimetry och cytogenetiska laboratorier, och således de bild urval modellerna bör utvärderas av användaren att avgöra om de fördefinierade bild urval modeller levereras med programvaran kommer att vara tillräcklig för att producera korrekta dosuppskattningar eller om anpassade modeller med användardefinierade tröskelvärden behöver skapas. Baserat på vår erfarenhet, är effektiviteten i bild urval modeller influerad av källan och cell bildkvaliteten. Användare kan designa sina egna kriterier för urval av bilden med hjälp av olika kombinationer av filter för att eliminera falska positiva DCs och bild urval modeller och de motsvarande tröskelvärdena för att välja önskad bilder. Det finns flexibilitet i inmatning av kalibreringskurvor och dos uppskattning, som koefficienter av linjär-kvadratisk kurva och DC frekvenser kan ändras eller manuellt inmatade.

Även om programvaran är helt automatiserad, kan bilder manuellt granskade och utvalda. Denna kapacitet är tillgänglig att inkludera eller ta bort individuellt bearbetade bilder genom mikroskopet visningsfunktionen i huvudsakliga GUI. På grund av automatisering är programvaran dock betydligt effektivare jämfört med den manuella räknandet av metafas bilder och räknar DCs. Ett prov som består av 1000 bilder kan bearbetas i 20 (tiff)-40 (jpg) min på en arbetsstation med flera kärnor. Denna programvara kommer att vara särskilt tidskritiska eller arbetsintensiva situationer, till exempel händelser som flera individer har exponerats eller misstänktes ha exponerats för strålning, eller där känsliga diagnoser och behandling beslut är kritiska.

Exakt och korrekt hög genomströmning detektion av DCs samt dos uppskattning är nödvändiga för obevakad strålning bedömning. Andra tillgängliga alternativ till programvaran uppfyller inte båda dessa krav. En användare-assisted, image-baserad cytogenetisk analys (DCScore, Metasystems17) system kräver manuell verifiering av kandidat DCs, på grund av en hög fel ränta hänförligt till okorrigerad överlappningar mellan kromosomer och systemet avgör inte stråldos. DCScore skulle inte vara lika effektivt som ADCI i ett strålning evenemang där ett stort antal potentiellt utsatta individer. Stor bländare Mikroskop system kan samla bilder flera metafas celler18, dock de analysera inte dem. ”CABAS”19 och ”dos uppskatta”20 programvara kan generera kalibrering kurvor och uppskattning dos, men inte Poäng DCs. Andra biodosimetry-analyser som inte är baserade på DC analys inkluderar H2AX fluorescens, fluorescens i situ hybridisering med DNA-prober riktade till specifika kromosomer, genuttryck, mikronukleär analys, och urin och respiratoriska biomarkörer. Dessa metoder är mindre specifika och mindre känsliga för joniserande strålning, kan vara mer kostsamt, i vissa fall, är mer tidskrävande och har generellt inte standardiserats över flera referenslaboratorier. De flesta av dessa tekniker inte upptäcka stabil strålning svaren, så de inte kan användas för långsiktig bedömning (> 7 dagar efter exponering) av stråldosen. Däremot detta kan utvärdera individer upp till 90 dagar efter exponering och kan bearbeta data från någon cytogenetik laboratorium Mikroskop imaging system. Dock om ett urval dras > 4 veckor efter exponering, känslighet minskas på grund av förfalla av disentrisk avvikelser1,2,3 och programvaran för närvarande inte korrigera DC frekvenser för förseningar i provtagning exponerade individer.

Denna programvara har vissa begränsningar. Befintlig bild urval modeller Markera mestadels acceptabel metafas bilder, men i vissa fall misslyckas att eliminera otillfredsställande bilder, som kan minska riktigheten av DC upptäckt. Det är fortfarande en öppen fråga hur man designar en tillfredsställande bild urval modell som eliminerar alla olämpliga metafas celler. Programvaran ger exakta uppskattningar för prover exponeras för högre stråldoser (≥ 2 Gy). Trots betydande framsteg i att minska antalet falska positiva DCs16, har dessa objekt inte uteslutits. Lägre kvalitet metafas celler på låg stråldos (särskilt < 1 Gy) är mer benägna att falskt positiva DC upptäckt. Låg dos prover var därför inte ingår när du genererar kalibreringskurvan används för dos uppskattning av HC prover. Om en kurva som innehåller låg dos prover önskas, ett lägre SVM Sigma värde minskar falska positiva räknas i låg dos prover men kan resultera i lägre DC avkastning i hög dos prover. Figur 8 jämförs kurvan HC används för dos uppskattning (Sigma = 1,5) en kalibreringskurva passa med extra låg dos prover vid lägre SVM sigma värde (1,0). I prover med otillräckligt antal metafas celler och/eller dålig kvalitet metafas bilder, får det inte vara möjligt att exakt uppskatta biologiska exponeringar vid låg dos, potentiellt resulterar i avvikelser från fysiska dosen överstiger 0,5 Gy.

Programvaran får inte exakt bedöma strålningstyper om deras dos-responskurvor bästa passar en linjär eller nära-linjär modell. Hittills har det testats endast med prover exponeras för X- och gammastrålning. Om en annan strålkällan undersöks, måste användare se till både kalibrering och test prover är utsatta för samma typ av strålning. Programvaran använder antingen högsta sannolikheten eller minstakvadratmetoden passande för att konstruera ett dos-respons kurva med en linjär-kvadratisk modell. Det finns för närvarande ingen möjlighet att införa en strikt linjär kurvanpassning, lämpligt för hög energi partikel exponeringar, men sådana funktioner blir tillgängliga i framtiden.

Framtida utveckling

Våra pågående insatser är inriktade på att förbättra bild urval modeller och korrekt dos mätning, i synnerhet av prover som utsätts för låga stråldoser. Efterföljande versioner kommer att ge standardfel mätningar på dosuppskattningar och konfidensintervall på kalibreringskurvor. Dessutom är en high-performance-computing version av programvaran för superdatorn Blue Gene (BG/Q, IBM) under utveckling för snabb utvärdering av individer som exponerats i en mass-casualty strålning händelse. Vissa komponenter i programvaran har redan testats och distribuerats på denna plattformlass = ”xref” > 11.

Disclosures

Tillsammans grundade CytoGnomix, som kommersialisera ADCI och innehar relaterade patent PKR och JHMK. YL och BCS är anställda av CytoGnomix. ADCI är upphovsrättsskyddade och metoden centromer lokalisering i ADCI är patenterat (oss Pat. Nr 8,605,981; Tyska Pat. Nr 112011103687).

Acknowledgments

Vi är tacksamma till Dr. Ruth Wilkins, radiobiologyen och Protection Division på Health Canada, och Farrah Flegal, kanadensisk kärntekniska laboratorier och deras laboratoriepersonal åt metafas bilddata från sina cytogenetiska biodosimetry laboratorier. Detta papper stöddes av ett kontrakt från Build i Kanada Innovation Program till CytoGnomix (serienr. EN579-172270/001/SC). Den första versionen av ADCI och utveckling av algoritmer stöddes av Western innovationsfonden; de naturliga vetenskaperna och Engineering Research Council of Canada (NSERC Discovery Grant 371758-2009); US Public Health Service (DART-dos CMCR, 5U01AI091173-0); den kanadensiska fonden för Innovation. Kanada forskning stolar och CytoGnomix Inc.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI) CytoGnomix NA ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei Examples: Metasystems, Leica Microsystems M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63X magnification objective, 10X magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional) Micro-Star International MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro Multi-core performance workstation.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brewen, J. G., Preston, R. J., Littlefield, L. G. Radiation-Induced Human Chromosome Aberration Yields Following an Accidental Whole-Body Exposure to60 Co γ-Rays. Radiat Res. 49, (3), 647-656 (1972).
  2. Bender, M. A., Gooch, P. C. Persistent Chromosome Aberrations in Irradiated Human Subjects. Radiat Res. 16, (1), 44-53 (1962).
  3. INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. IAEA: Vienna. (2011).
  4. Rogan, P. K., Li, Y., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Knoll, J. H. M. Radiation Dose Estimation by Automated Cytogenetic Biodosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 172, (1-3), 207-217 (2016).
  5. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An image processing algorithm for accurate extraction of the centerline from human metaphase chromosomes. 2010 IEEE International Conference on Image Processing. 3613-3616 (2010).
  6. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J., Khan, W., Rogan, P. An Accurate Image Processing Algorithm for Detecting FISH Probe Locations Relative to Chromosome Landmarks on DAPI Stained Metaphase Chromosome Images. 2010 Canadian Conference on Computer and Robot Vision. 223-230 (2010).
  7. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Rogan, P. K., Knoll, J. H. M. Intensity integrated Laplacian algorithm for human metaphase chromosome centromere detection. 2012 25th IEEE Canadian Conference on Electrical and Computer Engineering (CCECE). 1-4 (2012).
  8. Li, Y., et al. Towards large scale automated interpretation of cytogenetic biodosimetry data. 2012 IEEE 6th International Conference on Information and Automation for Sustainability. 30-35 (2012).
  9. Ranjan, R., Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Automatic Detection of Pale Path and Overlaps in Chromosome Images using Adaptive Search Technique and Re-thresholding. International Conference on Computer Vision Theory and Applications. 462-466 (2017).
  10. Arachchige, A. S., Samarabandu, J., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Intensity Integrated Laplacian-Based Thickness Measurement for Detecting Human Metaphase Chromosome Centromere Location. IEEE Trans Biomed Eng. 60, (7), 2005-2013 (2013).
  11. Rogan, P. K., et al. Automating dicentric chromosome detection from cytogenetic biodosimetry data. Radiat Prot Dosimetry. 159, (1-4), 95-104 (2014).
  12. Li, Y., Knoll, J. H., Wilkins, R. C., Flegal, F. N., Rogan, P. K. Automated discrimination of dicentric and monocentric chromosomes by machine learning-based image processing. Microsc Res Tech. 79, (5), 393-402 (2016).
  13. Subasinghe, A., et al. Centromere detection of human metaphase chromosome images using a candidate based method. F1000Res. 5, 1565 (2016).
  14. Shirley, B. C., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Online manual for the Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator, Version 1.2. Available from: http://adciwiki.cytognomix.com (2017).
  15. Wilkins, R. C., et al. Evaluation of the annual Canadian biodosimetry network intercomparisons. Int J Radiat Biol. 91, (5), 443-451 (2015).
  16. Liu, J., Li, Y., Wilkins, R., Flegal, F., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Accurate Cytogenetic Biodosimetry Through Automation Of Dicentric Chromosome Curation And Metaphase Cell Selection. F1000Research. 6, 1396 (2017).
  17. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lörch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenet Genome Res. 104, (1-4), 383-389 (2004).
  18. Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. S. High-throughput sample processing and sample management; the functional evolution of classical cytogenetic assay towards automation. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2015, 132-141 (2015).
  19. Deperas, J., et al. CABAS: a freely available PC program for fitting calibration curves in chromosome aberration dosimetry. Radiat Prot Dosimetry. 124, (2), 115-123 (2007).
  20. Ainsbury, E. A., Lloyd, D. C. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Phys. 98, (2), 290-295 (2010).
Skyndsam strålning Biodosimetry automatiserade av disentrisk kromosom identifiering (ADCI) och dos uppskattning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).More

Shirley, B., Li, Y., Knoll, J. H. M., Rogan, P. K. Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation. J. Vis. Exp. (127), e56245, doi:10.3791/56245 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter