Cilia er avgjørende for riktig organogenesen. Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å merke og visualisere tungeformet cellene i sebrafisk.
De siste årene, har sebrafisk fosteret framstått som en populær modell å studere utviklingsbiologi på grunn av trekk som ex utero embryo utvikling og optisk gjennomsiktighet. Spesielt har sebrafisk fosteret blitt en viktig organisme å studere virveldyr nyre organogenesen samt multiciliated celle (MCC) utvikling. For å visualisere MCCs i embryonale sebrafisk nyre, vi har utviklet en kombinert protokoll om hele-mount fluorescerende i situ hybridisering (fisk) og montere hele immunofluorescence (hvis) som gir høy resolution tenkelig. Dette manuskriptet beskriver våre teknikk for co lokalisere transkripsjoner av RNA og protein som et verktøy for å forstå bedre regulering av utviklingsmessige programmer gjennom uttrykk for ulike avstamning faktorer.
De siste tiårene, sebrafisk (Danio rerio) har dukket opp som en førsteklasses modell organisme å studere utviklingsbiologi. Embryoene utvikle utenfor mor og synlig optisk. Dannelsen av vitale organer som øyet, nyre og forebrain oppstår også, raskt, med strukturer av bare 24 h innlegget befruktning (hpf). Viktigere, er sebrafisk genomet svært bevart med pattedyr1,2,3. I tillegg har sebrafisk og pattedyr organer lignende anatomi og fysiologi. Den sebrafisk embryonale nyre, eller pronephros, viser verdien av modellsystem for å undersøke gen funksjon under tidlig nephrogenesis og skjebne fastsettelse av bevarte epithelial celle populasjoner av virveldyr nyre4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. tilsvarende sebrafisk fosteret har blitt stadig viktigere i behandlingen ontogeny MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Som navnet antyder, er MCCs epitelceller preget av masse motile flimmerhårene ligger på den apikale overflaten17. Sebrafisk, MCCs fungere i strømning og spres i en “salt-and-pepper” som mote gjennom midten av hver nyre av pronephros med 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. selv om de har bare vært nevnt i en håndfull av menneskelig nyre sykdom tilfeller18,19,20,21, MCCs er utbredt i andre pattedyr vev som hjernen og spor22,23,24, som utgjør en rekke utfordringer for eksperimentell design. Elegante studier i ulike virveldyr modeller inkludert sebrafisk har vist en bevart sti av MCC skjebne, med hakket signalveien som en inhibitor av MCC utvikling12,17,25 ,26,27. Derfor gir sebrafisk-pronephros en lett tilgjengelig modell for å studere de genetiske mekanismene av MCC utvikling i vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Både åpenhet og lett genetisk manipulering av sebrafisk embryoer har vist seg for å være uvurderlig egenskaper når studere genetiske og molekylære veier som regulerer celle skjebne, vevvekst og utvikling av tidlig embryo1,2 ,3. Som sådan, tradisjonell teknikker å visualisere protein og gene transkripsjoner, som i situ hybridisering og hele veggfeste hvis, har vært brukt på og optimalisert for de sebrafisk16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Ved å kombinere populære protokoller for fisk og hvis, er det mulig å merke og analysere MCCs i vivo16,28,37,38.
Protokollen beskrevet ovenfor er optimalisert for merking MCCs i pronephros med odf3b utskrifter og α-tubulin i 24 hpf sebrafisk embryoer. De beste resultatene anbefales det å bruke ferske fast og forberedt embryoer. Embryo som er fast og lagret i enten MeOH eller Hyb + på 20 ° C lenger enn en uke kan brukes, men sannsynligheten for uønsket bakgrunn flekker øker med tiden embryoene er holdt i lagring.
Endringer og feilsøking av denne teknikken er nødvendig å skreddersy denne metoden for andre suitene på bestemt markører, f.eks andre antisense riboprobes og andre antistoffer. Mange metoder for justering av parametre for trinnene under hele mount i situ hybridisering er tidligere dokumentert av vår gruppe og andre31,34,36,38, 39. Likeledes, hver protein antistoff vil kreve noen feilsøking i flekker ganger, og omtrentlig celleområder fortynninger og inkubasjon tider for hver primære antistoff anslås beste ved evaluering av dokumenterte resultater28, 35. for embryoer yngre enn 24 hpf, pK behandling bør være kortere enn 2 minutter, hvor embryo eldre enn 24 hpf bør behandles med pK lenger enn 2 min. Også embryo eldre enn 24 hpf bør være bleket pigment før pK behandling.
Etter farging med fluorescerende flekker løsning, er det avgjørende å fjerne eventuelle gjenværende flekken, antistoffer og peroxidases ved å utføre en rekke metanol og hydrogenperoksid vasker. PBS vasker umiddelbart etter er avgjørende å fjerne overflødig metanol fra embryoene. Viktigere, før du utfører hvis antistoffer, har vi funnet at aceton og deionisert vann vasker gjøre embryoer mindre sannsynlig å forholde seg til hverandre og/eller sentrifuger rørene. I vår erfaring, antistoffer spesifikke transkripsjonsfaktorer og andre gener, selv om de kan fungere effektivt Western blotter, fungerer ikke bra for hvis sebrafisk. Men fungerer høyt konservert og rikelig proteiner, som α-tubulin og β-catenin, godt i sebrafisk for hvis16,37.
Med fisk er det mulig å visualisere RNA transkripsjoner av gener som ennå ikke har spesifikke antistoffer i sebrafisk. Ved å kombinere fisk med hvis, som demonstrert av denne protokollen, kan co lokalisering av RNA utskrifter og protein være sett i vivo (figur 2). Fleksibel natur protokollen kan rask feilsøking for visualisering av ulike RNA utskrifter og proteiner i flere vev og tidspunkt. Kombinert med allerede respektert trekk av sebrafisk embryo, gir denne protokollen fisk + hvis et annet verktøy for å utforske uttrykket av gener og proteiner viktig til utviklingsmessige veien regulering.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av grant R01DK100237 R.A.W. og feltet National Science Foundation Graduate forskning fellesskap. DGE-1313583 til A.N.M. Vi takker også College av vitenskap sommer Undergraduate Research stipendprogrammet for støtte til M.U. Vi vil gjerne takke sentrum for sebrafisk forskning ved University of Notre Dame for deres dedikert omsorgen for våre sebrafisk. Vi vil også gjerne takke departementet av biologisk vitenskap samt medlemmene av vår lab for all deres støtte og verdifull innsikt.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |