बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालयों पैदा करने के लिए तरीके सरल, कुशल और लागत प्रभावी होना चाहिए । हम लक्ष्य डीएनए के एंजाइमी पाचन पर आधारित gRNA पुस्तकालयों के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । इस विधि, CORALINA (नियंत्रित nuclease गतिविधि के माध्यम से व्यापक gRNA पुस्तकालय पीढ़ी) महंगा कस्टम oligonucleotide संश्लेषण के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करता है ।
जीनोम और epigenome इंजीनियरिंग दोनों के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली की लोकप्रियता अपनी सादगी और अनुकूलन क्षमता से उपजी है । एक प्रभाव (Cas9 nuclease या एक nuclease-मृत dCas9 फ्यूजन प्रोटीन) एक छोटा सा सिंथेटिक गाइड आरएनए, या gRNA के रूप में जाना जाता आरएनए द्वारा जीनोम में एक विशिष्ट साइट के लिए लक्षित है । CRISPR प्रणाली के द्विपक्षीय प्रकृति प्लाज्मिड व्यक्तिगत gRNAs के हजारों की अभिव्यक्ति कैसेट युक्त पुस्तकालयों के बाद से स्क्रीनिंग के दृष्टिकोण में इसके उपयोग में सक्षम बनाता है एक भी प्रयोग में कई विभिंन साइटों पूछताछ किया जा सकता है ।
तारीख करने के लिए, पुस्तकालयों के निर्माण के लिए gRNA दृश्यों लगभग अनंय रूप से oligonucleotide संश्लेषण, जो पुस्तकालय में अनुक्रम की प्राप्त जटिलता को सीमित करता है द्वारा उत्पंन किया गया है और अपेक्षाकृत लागत गहन है । यहाँ, CORALINA के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल (नियंत्रित nuclease गतिविधि के माध्यम से व्यापक gRNA पुस्तकालय पीढ़ी), इनपुट डीएनए के एंजाइमी पाचन पर आधारित अत्यधिक जटिल gRNA पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि, वर्णित है. चूंकि CORALINA पुस्तकालयों डीएनए के किसी भी स्रोत से उत्पंन किया जा सकता है, अनुकूलन के लिए बहुत सारे विकल्प मौजूद हैं, CRISPR आधारित स्क्रीन की एक बड़ी विविधता को सक्षम करने से ।
एक आणविक लक्ष्यीकरण उपकरण के रूप में बैक्टीरियल CRISPR/Cas9 प्रणाली के अनुकूलन आणविक जीवविज्ञान में सबसे हाल ही में क्रांति का कारण बना । पहले कभी नहीं किया गया है इतना आसान परिभाषित जीनोमिक स्थानों पर क्रोमेटिन हेरफेर करने के लिए । CRISPR के आम अनुप्रयोगों के लक्षित जीन उत्परिवर्तनों1, जीनोम इंजीनियरिंग2, epigenome संपादन3, transcriptional सक्रियण और जीन मुंह4शामिल हैं । CRISPR प्रणाली का एक विशेष लाभ यह है कि अपने आवेदन अच्छी तरह से अध्ययन उंमीदवार साइटों तक ही सीमित नहीं हैं, के रूप में gRNA पुस्तकालयों कम पक्षपातपूर्ण स्क्रीन संभव बनाते हैं । ये किसी भी पूर्व प्रयोगात्मक ज्ञान के बिना जीनोम में कार्यात्मक loci की खोज की सुविधा । हालांकि, gRNA पुस्तकालय निर्माण वर्तमान में ज्यादातर oligo-न्यूक्लियोटाइड संश्लेषण पर आधारित है, और वहाँ gRNA पुस्तकालयों है कि मानव या माउस मूल या खुले पढ़ने के फ्रेम के बाहर लक्ष्य क्षेत्रों के नहीं हैं खरीद करने के लिए सीमित विकल्प हैं । इस प्रकार, हालांकि CRISPR स्क्रीन पहले से ही अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली5,6,7,8साबित कर दिया है, उनकी पूरी क्षमता का अभी तक शोषण नहीं किया गया है ।
शास्त्रीय gRNA पीढ़ी के तरीकों की सीमा को दूर करने के लिए दो रणनीतियों हाल ही में विकसित किया गया है । दोनों के बजाय कस्टम oligonucleotide संश्लेषण पर निर्भर लक्ष्य डीएनए के नियंत्रित एंजाइमी पाचन पर आधारित हैं । जबकि CORALINA9 micrococcal nuclease कार्यरत है, केवल वर्तमान में उपलब्ध वैकल्पिक विधि, CRISPR-10खाने, प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है (Hpaद्वितीय, ScrFमैं, Bfaमैं और Mmeमैं) । महत्वपूर्ण बात, दोनों तकनीकों किसी भी इनपुट डीएनए, जो gRNA protospacer दृश्यों के स्रोत के रूप में कार्य करता है के लिए लागू किया जा सकता है । जबकि CRISPR खाने की विधि एक रणनीति क्लोन gRNAs जिनकी लक्ष्यीकरण साइटों आवश्यक एस pyogenes पाम (protospacer आसंन मकसद) द्वारा पीछा नहीं कर रहे है की संख्या कम करने के लिए रोजगार, यह एक के लिए सभी संभव कार्यात्मक gRNAs का एक छोटा सा अंश उत्पंन दी निवडा. CORALINA, दूसरी ओर, के लिए स्रोत अनुक्रम के लिए सभी संभावित gRNAs उत्पंन करने में सक्षम है, लेकिन यह भी गैर के एक उच्च अंश-कार्यात्मक गाइड शामिल हैं । नियंत्रित nuclease गतिविधि के माध्यम से gRNA पुस्तकालय पीढ़ी किसी भी प्रजाति के लिए व्यापक gRNA पुस्तकालयों के उत्पादन में सक्षम बनाता है, किसी भी Cas9-प्रोटीन या-एक सरल और लागत प्रभावी तरीके से प्रभाव प्रणाली । इसके अलावा, CORALINA अनुकूलन करने के लिए अनुकूल है, के रूप में उपयुक्त इनपुट और वेक्टर विकल्प पुस्तकालय प्रकार, आकार और सामग्री को परिभाषित । यहाँ, एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है कि डीएनए के विविध स्रोतों से व्यापक gRNA पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (चित्रा 1), बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (BACs) या जीनोमिक डीएनए9सहित. इस प्रोटोकॉल के साथ प्रतिनिधि परिणाम बीएसी डीएनए को CORALINA प्रोटोकॉल लागू करने के द्वारा प्राप्त किए गए थे ।
CORALINA लक्ष्य डीएनए के नियंत्रित nuclease पाचन और परिणामस्वरूप डबल असहाय टुकड़े के थोक क्लोनिंग द्वारा बड़े पैमाने पर gRNA पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सांख्यिकीय निष्कर्ष इंगित करता है कि कई 10 से अधिक7 व्यक्तिगत gRNA दृश्यों पहले से ही सफलतापूर्वक किया गया है हाथ में प्रोटोकॉल का उपयोग कर9क्लोन । CORALINA कई मायनों में अनुकूलित किया जा सकता है । टेंपलेट डीएनए के चुनाव लक्ष्य क्षेत्र और उत्पंन पुस्तकालय की अधिक से अधिक जटिलता को परिभाषित करता है । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, CORALINA पुस्तकालयों पहले मानव और माउस जीनोमिक डीएनए9से उत्पंन किया गया है । प्रतिनिधि यहां प्रस्तुत परिणाम शुद्ध बीएसी डीएनए से एक CORALINA पुस्तकालय की पीढ़ी को दर्शाते हैं । आगे अनुकूलन gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर और linker दृश्यों के विकल्प से प्राप्त किया जा सकता है । हम पहले गिब्सन विधानसभा के लिए 3 दक्षता में थोड़ा बदलाव के साथ linker लंबाई के तीन अलग जोड़े परीक्षण किया है9।
थोक पचा डीएनए से उनके मूल के कारण, CORALINA gRNAs के protospacer आमतौर पर लंबाई में ठीक 20 बीपी नहीं कर रहे हैं, लेकिन एक मतलब है कि दोनों MNase पाचन के मापदंडों पर निर्भर करता है के साथ एक लंबाई वितरण दिखाने के साथ ही पृष्ठ जेल से बनाया उत्पाद का आकार एस चित्रा बी 1 और सीमें दिखाया प्रतिनिधि उदाहरण, 19 और 27 बीपी के बीच एक औसत लंबाई के साथ टुकड़े को दर्शाया गया है । हमारे अनुभव में, टुकड़ों की लंबाई ईमानदारी से उत्पंन gRNA protospacer द्वारा संरक्षित है9। जबकि टुकड़े से कम 20 बीपी उच्च बंद होने के कारण बचा जाना चाहिए gRNAs परिणामस्वरूप के लक्ष्य दर, अब टुकड़े की संभावना बहुत बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक समस्या के कम कर रहे हैं, क्योंकि यह प्रदर्शन किया गया है कि protospacers के साथ gRNAs के रूप में लंबे समय के रूप में ४५ बीपी अभी भी कर रहे है कार्यात्मक9.
CORALINA प्रोटोकॉल में दो सबसे महत्वपूर्ण चरणों MNase-पचा टुकड़े और क्लोनिंग कदम का आकार चयन कर रहे हैं । टुकड़े की पीढ़ी है कि बहुत कम कर रहे है (18 बीपी नीचे औसतउदा ) या बहुत सारे खाली gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के शामिल करने के पुस्तकालय बेकार प्रदान करेगा । इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है MNase पाचन कदम (चित्रा 2a) का अनुकूलन करने के लिए, (चित्रा बी सी, सी), gRNA वेक्टर रीढ़ की पूरी पाचन के लिए जांच और प्रोटोकॉल भर में कोई टुकड़ा नियंत्रण सहित उत्पाद की निगरानी करने के लिए । gRNA पुस्तकालय के प्रतिनिधित्व को संरक्षित करने के लिए भी विशेष ध्यान रखा जाना है । सामांय में पुस्तकालय पीढ़ी के एक आम अड़चन plasmids के प्रवर्धन के लिए बैक्टीरिया में कुशल हस्तांतरण है । इस प्रकार, महान दक्षता और व्यक्तिगत electroporation घटनाओं की एक बड़ी संख्या के साथ बैक्टीरिया की बड़ी मात्रा में gRNA क्लोन की एक उच्च संख्या को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।
gRNA पुस्तकालय उत्पादन के लिए नई रणनीतियों के लिए अगले दशकों में CRISPR आधारित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण की पूरी क्षमता फसल के लिए आवश्यक हो जाएगा । वहां लागत के लिए एक महत्वपूर्ण मांग प्रभावी, सरल और अनुकूलन के लिए बड़े पैमाने पर पुस्तकालयों, एक पूर्व आवश्यक स्क्रीनिंग मॉडल प्रणालियों और विभिंन CRISPR आधारित इंजीनियरिंग दृष्टिकोण की एक बड़ी संख्या के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए उत्पंन है । CORALINA इस ओर पहला कदम प्रदान कर रहा है । संभावित उपयोग कई गुना, विशेष रूप से जीनोम के व्यापक पुस्तकालयों का उत्पादन कर रहे हैं, सीडीएनए कम आम मॉडल प्रणालियों के व्युत्पंन पुस्तकालयों, अत्यधिक ध्यान केंद्रित पुस्तकालयों और प्रयोगात्मक सेट अप जिसमें अलग CRISPR प्रोटीन (अलग पाम के साथ आवश्यकताओं) संयोजन में उपयोग किया जाता है ।
अंय तरीकों के विपरीत, CORALINA इनपुट डीएनए से सभी संभव gRNAs उत्पंन करता है । हालांकि, विधि का एक दोष यह है कि gRNAs आवश्यक पाम अनुक्रम कमी भी पुस्तकालय में शामिल हैं, एक विशेषता यह है कि gRNA पुस्तकालय पीढ़ी के लिए एक दूसरे एंजाइमी विधि के साथ शेयर, CRISPR खाने (तालिका 1) । gRNA पुस्तकालय पीढ़ी के लिए आदर्श विधि के चुनाव की योजना बनाई स्क्रीनिंग प्रयोग के विनिर्देशों पर निर्भर करता है, विशेष रूप से प्रकृति (genic, विनियामक, intergenic) और लक्ष्य क्षेत्र के आकार (एकल लोकस, कई क्षेत्रों, जीनोम चौड़ा) । हम CORALINA का उपयोग करने में एक विशेष उल्टा जब गैर की एक बड़ी संख्या कोडिंग या विनियामक क्षेत्रों का विश्लेषण किया जा रहे है देखते हैं, अगर वहां अधूरा या अविश्वसनीय अनुक्रम जानकारी (विदेशी मॉडल सिस्टम, प्रजातियों के मिश्रण (उदा microbiomes) या प्रयोग इनपुट प्राप्त), अगर विभिंन CRISPR endonucleases संयुक्त या यदि संतृप्त विश्लेषण एक छोटी और परिभाषित लोकस पर किया जाता है (उदा BACs द्वारा प्रतिनिधित्व) ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक प्रो dr. स्टीफ़न बेक और प्रो dr. Magdalena Goetz उनके इनपुट के लिए, मदद और समर्थन CORALINA विधि, मैक्सीमिलियन Wiessbeck और वैलेंटिन Baumann उपयोगी टिप्पणियों के लिए विकसित करने में शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । काम DFG (STR 1385/1-1) द्वारा समर्थित किया गया है ।
500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |