Métodos para la generación de bibliotecas de gRNA a gran escala deben ser simple, eficiente y rentable. Se describe un protocolo para la producción de bibliotecas de gRNA basado en la digestión enzimática del ADN diana. Este método, CORALINA (gRNA integral generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlados) presenta una alternativa a la síntesis de oligonucleótidos de encargo costosos.
La popularidad del sistema CRISPR/Cas9 de genoma y epigenoma ingeniería proviene de su simplicidad y adaptabilidad. Una unidad de efectos (la nucleasa Cas9 o una proteína de fusión de nucleasa-dead dCas9) está dirigido a un sitio específico en el genoma por un pequeño arn sintético conocido como RNA de la guía, o gRNA. La naturaleza bipartita del sistema CRISPR permite su utilización en los enfoques de detección desde bibliotecas de plásmidos que contienen cassettes de expresión de miles de gRNAs individual se pueden utilizar para interrogar a muchos sitios diferentes en un solo experimento.
Hasta la fecha, gRNA secuencias para la construcción de las bibliotecas se han generado casi exclusivamente por síntesis de oligonucleótidos, que limita la posible complejidad de secuencias en la biblioteca y es relativamente costosa. Aquí, un detallado protocolo de CORALINA (generación de biblioteca de gRNA integral a través de la actividad de nucleasa controlados), un sencillo y un método rentable para la generación de bibliotecas de gRNA altamente complejo basado en la digestión enzimática de la entrada de ADN, se describe. Puesto que de cualquier fuente de ADN, se pueden generar bibliotecas CORALINA, un montón de opciones para personalización existen, lo que permite una gran variedad de pantallas de CRISPR.
La adaptación del sistema CRISPR/Cas9 bacteriana como herramienta segmentación molecular causó la más reciente revolución en biología molecular. Nunca antes ha sido tan fácil manipular cromatina en lugares genómicos definidos. Usos comunes de CRISPR incluyen mutaciones de genes específicos1, genoma ingeniería2, epigenoma, edición3, activación transcripcional y4el silenciamiento del gen. Una ventaja particular del sistema CRISPR es que sus aplicaciones no se limitan a sitios candidato bien estudiados, como bibliotecas de gRNA pantallas menos sesgadas posible. Éstos facilitan el descubrimiento de lugares geométricos funcionales en el genoma sin ningún previo conocimiento experimental. Sin embargo, gRNA biblioteca construcción actualmente en su mayoría se basa en la síntesis de oligo-nucleótidos y existen limitadas opciones para comprar gRNA bibliotecas que no son de humanos o regiones de origen o destino de ratón fuera abren marcos de lectura. Así, aunque CRISPR pantallas ya han demostrado ser increíblemente potente5,6,7,8, su potencial ha no sido explotado.
Para superar la limitación de dos estrategias de gRNA clásica generación métodos han sido desarrollados recientemente. Ambas se basan en la digestión enzimática controlada de ADN diana en lugar de depender de la síntesis del oligonucleótido personalizado. Mientras que CORALINA9 emplea nucleasa micrococcal, el método alternativo actualmente disponible sólo, comer CRISPR10, hace uso de enzimas de restricción (HpaII, ScrFI, BfaI y MmeI). Lo importante, ambas técnicas pueden ser aplicadas a cualquier entrada del ADN, que sirve como fuente de gRNA protospacer secuencias. Mientras que el método comer CRISPR emplea una estrategia para disminuir el número de gRNAs clonados cuyos sitios apuntados no son seguidos por la necesaria PAM S.pyogenes (motivo adyacente protospacer), genera sólo una pequeña fracción de todos los gRNAs funcionales posible para un región determinada. CORALINA, por otra parte, es capaz de generar todos los gRNAs posibles para la secuencia de origen, pero también incorpora una mayor fracción de guías no funcional. gRNA generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlado permite la producción de bibliotecas de gRNA integral para cualquier especie, cualquier sistema Cas9 proteína o – efectoras de una manera simple y rentable. Por otra parte, CORALINA es adaptable a la personalización, como opciones de entrada y el vector apropiados definición el tipo de biblioteca, tamaño y contenido. Aquí, se presenta un protocolo detallado que puede ser utilizado para la generación de bibliotecas de gRNA integral de diversas fuentes de ADN (figura 1), incluyendo los cromosomas artificiales bacterianos (BACs) o genomic ADN9. Los resultados representativos que acompaña a este protocolo se obtuvieron aplicando el protocolo CORALINA al ADN BAC.
CORALINA permite generar bibliotecas de gRNA a gran escala mediante digestión controlada de la nucleasa del ADN diana y a granel clonación de fragmentos resultantes de trenzado doble. Inferencia estadística indica que muchas secuencias de gRNA individual7 más de 10 han ya sido con éxito reproducidas usando el protocolo a mano9. CORALINA se puede personalizar de múltiples maneras. La elección de la plantilla de ADN define la región de destino y la complejidad máxima de la biblioteca generada. Usando este protocolo, CORALINA bibliotecas previamente se han generado de humano y ADN genómico del ratón9. Resultados representativos presentados aquí representan la generación de una biblioteca CORALINA de ADN purificado de BAC. Personalización adicional puede lograrse mediante la opción de secuencias de vectores y vinculador de expresión gRNA. Previamente hemos probado tres diferentes pares de longitudes de vinculador para Asamblea de Gibson con pequeñas variaciones en eficiencia9.
Debido a su origen a granel digerido ADN, protospacer de CORALINA gRNAs no suelen ser exactamente 20 bp en longitud, pero mostrar una distribución de longitud con un promedio que depende tanto de los parámetros de la digestión MNase, así como el tamaño de la supresión hecha del gel de la página s. el ejemplo representativo se muestra en la figura 2B y C, muestra fragmentos con una longitud media entre 19 y 27 PB. En nuestra experiencia, la longitud de los fragmentos se conserva fielmente por la gRNA generado protospacer9. Mientras que los fragmentos más cortos de 20 bp debe evitarse debido a la tasa objetivo de gRNAs resultante, más fragmentos son probablemente mucho menos de un problema para aplicaciones posteriores, puesto que ha sido demostraron que gRNAs con protospacers tanto como 45 bp son todavía funcional9.
Los dos pasos más importantes en el protocolo CORALINA son la selección de tamaño de fragmentos digeridos MNase y medidas clonaje. Generación de fragmentos que son demasiado cortos (por ejemplo media menores de 18 años bp) o incorporación de muchos vectores de expresión de gRNA vacía será inutilizar la biblioteca. Por lo tanto, es importante optimizar el paso de la digestión de MNase (figura 2A), para supervisar la supresión (figura 2B, C), Compruebe la digestión completa de la columna vertebral de vector de gRNA y como no hay controles de fragmento en el protocolo. Especial cuidado tiene también que deben tomarse para preservar la representación de la biblioteca de gRNA. Un cuello de botella común de generación de la biblioteca en general es la eficiente transferencia de plásmidos en bacterias para la amplificación. Así, grandes cantidades de bacterias con capacidad excelente y un gran número de eventos de electroporación individuales son necesarias para lograr un alto número de clones de gRNA.
Nuevas estrategias para la producción de la biblioteca de gRNA será necesarios cosechar el potencial de los enfoques basado en el CRISPR durante las próximas décadas. Hay una importante demanda de métodos rentables, simple y personalizables para generar librerías a gran escala, un requisito previo para hacer proyección favorable a un mayor número de sistemas modelo y diferentes enfoques de ingeniería CRISPR. CORALINA es proporcionar un primer paso hacia esto. Los usos potenciales son múltiples, sobre todo para producir bibliotecas completa de los genomas, cDNA derivada bibliotecas de modelo menos común de los sistemas, bibliotecas altamente enfocadas y montajes experimentales en que diversas proteínas CRISPR (con PAM diferentes requisitos) se utilizan en combinación.
A diferencia de otros métodos, CORALINA genera todos gRNAs posible de la entrada de ADN. Sin embargo, una desventaja del método es que gRNAs carecer de la necesaria secuencia de PAM se incluyen también en la biblioteca, una característica que comparte con un segundo método enzimático para la generación de la biblioteca del gRNA, CRISPR-comer (tabla 1). La elección del método ideal para generación de gRNA biblioteca depende de las especificaciones de la proyección prevista experimentar, especialmente la naturaleza (génica, regulación, intergénica) y el tamaño de la región de destino (solo locus, múltiples regiones, genoma). Vemos una boca especial en el uso de CORALINA cuando un gran número de no codificante o regiones reguladoras deben ser analizadas, si hay información incompleta o poco confiable secuencia (sistemas de modelos exóticos, mezclas de especies (por ejemplo, microbiomes) o obtenidos experimentalmente entrada), si se combinan diferentes endonucleasas CRISPR o saturar el análisis se realiza en un lugar corto y definido (por ejemplo, representado por BACs).
The authors have nothing to disclose.
Los autores quisieran gracias Prof. Dr. Stephan Beck y Prof. Dr. Magdalena Goetz por sus aportes, ayuda y apoyo en el desarrollo el método CORALINA, Maximiliano Wiessbeck y Valentin Baumann para comentarios. El trabajo ha sido apoyado por DFG (STR, 1385, 1-1).
500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |