Metoder for å generere storskala gRNA biblioteker bør være enkel, effektiv og kostnadseffektiv. Vi beskriver en protokoll for produksjon av gRNA biblioteker basert på enzymatisk fordøyelsen av målet DNA. Denne metoden CORALINA (omfattende gRNA biblioteket generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet) presenterer et alternativ til kostbar egendefinerte oligonucleotide syntese.
Populariteten til CRISPR/Cas9 systemet for både genomet og epigenome engineering stammer fra dens enkelhet og tilpasningsevne. En effektor (Cas9-nuclease eller en nuclease-død dCas9 fusion protein) er rettet mot et bestemt område i genomet av en liten syntetiske RNA kjent som guide RNA, eller gRNA. Bipartite natur CRISPR systemet kan bruken screening tilnærminger siden plasmider biblioteker som inneholder uttrykket kassetter av individuelle gRNAs kan brukes til å forhøre mange forskjellige områder i et enkelt eksperiment.
Hittil er gRNA sekvenser for bygging av biblioteker nesten utelukkende generert av oligonucleotide syntese, som begrenser oppnåelig kompleksiteten i sekvenser i biblioteket og er relativt kostnadskrevende. Her en detaljert protokollen for CORALINA (omfattende gRNA biblioteket generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet), en enkel og kostnadseffektiv metode for generering av komplekse gRNA biblioteker basert på enzymatisk fordøyelsen av input DNA, er beskrevet. Siden CORALINA biblioteker kan genereres fra enhver kilde av DNA, finnes mange alternativer for tilpasning, aktivere et stort utvalg av CRISPR-baserte skjermer.
Tilpasning av bakteriell CRISPR/Cas9 som molekylær målretting verktøy forårsaket siste revolusjonen i molekylærbiologi. Aldri før har det vært så lett å manipulere chromatin definert genomisk steder. Vanlige programmer av CRISPR inkluderer målrettet genet mutasjoner1, genomet engineering2, epigenome3, transcriptional aktivisering og gene stanse4. En bestemt fordel av CRISPR er at deres programmer ikke er begrenset til godt studert kandidat nettsteder, som gRNA bibliotek gjør mindre partisk skjermer mulig. Disse lette oppdagelsen av funksjonelle loci i genomet uten forutgående eksperimentelle kunnskap. Men gRNA biblioteket konstruksjon er for tiden hovedsakelig basert på oligo-nukleotid syntese, og begrenset alternativer kjøpe gRNA biblioteker som ikke er menneske eller musen opprinnelse eller målet områder utenfor åpne lesing rammer. Dermed, selv om CRISPR skjermer har allerede vist seg utrolig potente5,6,7,8, fullt ut har ikke ennå blitt utnyttet.
For å overvinne begrensning av klassisk gRNA metoder to strategier har nylig blitt utviklet. Begge er basert på kontrollert enzymatisk fordøyelsen av målet DNA i stedet for å stole på egendefinerte oligonucleotide syntese. Mens CORALINA9 benytter micrococcal nuclease, bare tilgjengelig alternativ metoden CRISPR-spising10, gjør bruk av begrensning enzymer (HpaII, ScrFjeg, uteksaminertjeg og Mmejeg). Betydelig, kan begge teknikkene brukes på alle innspill DNA, som tjener som kilde til gRNA protospacer sekvenser. Mens metoden CRISPR-spising sysselsetter en strategi for å redusere antall klonet gRNAs som målretting nettsteder ikke er etterfulgt av den nødvendige S.pyogenes PAM (protospacer tilstøtende motiv), genereres bare en liten brøkdel av alle mulige funksjonelle gRNAs for en område. CORALINA, derimot, er i stand til å generere alle potensielle gRNAs for kilde sekvenser, men inkluderer også en høyere brøkdel av ikke-fungerende guider. gRNA bibliotek generasjon gjennom kontrollert nuclease aktivitet kan omfattende gRNA biblioteker for noen arter, alle Cas9-protein eller -effektor system på en enkel og kostnadseffektiv måte. Videre er CORALINA tilpasses tilpasning, som riktig inngang og vektor valg definerer biblioteket type, størrelse og innhold. Her en detaljert protokoll er presentert som kan brukes til generering av omfattende gRNA biblioteker fra ulike kilder av DNA (figur 1), inkludert bakteriell kunstig kromosomene (BBS) eller genomisk DNA9. Representant resultatene følger denne protokollen var avledet ved hjelp CORALINA protokollen BAC DNA.
CORALINA kan brukes til å generere storskala gRNA biblioteker av kontrollert nuclease fordøyelse av målet DNA og bulk kloning av resulterende dobbel strandet fragmenter. Statistisk inferens angir at mange mer enn 107 personlige gRNA sekvenser har allerede blitt er fullført ved hjelp av protokollen hånd9. CORALINA kan tilpasses på flere måter. Valg av mal DNA definerer målregion og maksimal kompleksiteten i genererte biblioteket. Bruker denne protokollen, CORALINA biblioteker har tidligere blitt generert fra menneske og mus genomisk DNA9. Representant resultatene presenteres her skildre generering av et CORALINA bibliotek fra renset BAC DNA. Videre tilpasning kan oppnås av gRNA uttrykk vektor og koblingsfunksjonalitet sekvenser. Vi har tidligere testet tre forskjellige par linker lengder for Gibson montering med små variasjoner i effektivitet9.
På grunn av deres opprinnelse fra bulk fordøyd DNA, protospacer av CORALINA gRNAs er vanligvis ikke nøyaktig 20 bp i lengde, men showet en lengde distribusjon med en mening som avhenger både parameterne for MNase fordøyelsen og størrelsen på excision laget siden gel s. representant eksemplet i figur 2B og Cviser fragmenter med median lengde mellom 19 og 27 bp. I vår erfaring beholdes trofast lengden av fragmenter av genererte gRNA protospacer9. Mens fragmenter kortere enn 20 bp bør unngås på grunn av høyere off-målet antall resulterende gRNAs, lengre fragmenter trolig mye mindre av et problem for nedstrøms programmer, siden det har vært vist at gRNAs med protospacers så lenge 45 bp er fortsatt funksjonell9.
De to viktigste trinnene i CORALINA protokollen er størrelse valg av MNase-fordøyd fragmenter og kloning skritt. Generasjon av fragmenter som er for kort (f.eks gjennomsnitt under 18 bp) eller inkorporering av mange tomme gRNA uttrykk vektorer vil gjøre biblioteket ubrukelig. Derfor er det viktig å optimalisere MNase fordøyelsen trinn (figur 2A), overvåke excision (figur 2B, C) sjekk for komplett fordøyelsen av gRNA vektor ryggraden og inkludert noen fragment kontroller i protokollen. Forsiktighet må også tas å bevare representasjon av gRNA biblioteket. En vanlig flaskehalsen biblioteket generasjon er generelt effektiv overføring av plasmider i bakterier for forsterkning. Dermed er store mengder bakterier med utmerket kompetanse og en rekke personlige electroporation hendelser nødvendig for å oppnå et høyt antall gRNA kloner.
Nye strategier for gRNA biblioteket produksjon vil være nødvendig å høste det fulle potensialet av CRISPR-basert screening de neste tiårene. Det er en betydelig etterspørsel etter kostnadseffektive, enkle og passelig metoder for å generere store biblioteker, nødvendig å gjøre screening mottakelig for et større antall modellsystemer og annet CRISPR engineering tilnærminger. CORALINA gir et første skritt mot denne. Potensielle bruker er mange, spesielt for å lage omfattende biblioteker av genomer, cDNA avledet biblioteker av mindre vanlige modellsystemer, svært fokusert biblioteker og eksperimentelle oppsetninger i hvilke ulike CRISPR proteiner (med ulike PAM krav) brukes i kombinasjon.
I motsetning til andre metoder genererer CORALINA alle mulige gRNAs fra input DNA. En ulempe metoden er imidlertid at gRNAs mangler nødvendig PAM sekvensen er også inkludert i biblioteket, en funksjon som den deler med en annen enzymatisk metode for gRNA biblioteket generasjon, CRISPR-spising (tabell 1). Valg av metoden ideelt for gRNA biblioteket generasjon avhenger av spesifikasjonene til planlagte screening eksperiment, spesielt natur (genic, regulatoriske, intergenisk) og størrelsen på målregion (enkelt locus, flere regioner, genomet-bred). Vi ser en spesiell opp ved CORALINA når et stort antall ikke-koding eller regulatoriske regioner er til å analysere, hvis det er ufullstendig eller upålitelig oppstartsrekkefølgen (eksotiske modellsystemer, blandinger av arter (f.eks microbiomes) eller eksperimentelt oppnådd inngang), hvis ulike CRISPR endonucleases kombineres eller mette analyse utføres på et kort og definert locus (f.eks representert ved BACs).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne gjerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Magdalena Goetz for innspill, hjelp og støtte i å utvikle metoden CORALINA Maximilian Wiessbeck og Valentin Baumann for nyttige kommentarer. Arbeidet har blitt støttet av DFG (STR 1385/1-1).
500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |