Metoder för att skapa storskaliga gärna bibliotek bör vara enkel, effektiv och kostnadseffektiv. Vi beskriver ett protokoll för produktion av gärna bibliotek baserat på enzymatisk nedbrytning av mål-DNA. Denna metod, CORALINA (omfattande gärna biblioteket generationen genom kontrollerad nuclease aktivitet) presenterar ett alternativ till kostsamma anpassade oligonukleotiden syntes.
Populariteten av CRISPR/Cas9 systemet för både genomet och epigenomet teknik härrör från dess enkelhet och anpassningsförmåga. En effektor (den Cas9 nuclease eller ett nuclease-döda dCas9 fusionsprotein) riktas till en specifik plats i genomet av en liten syntetisk RNA kallas för guide RNA, eller gärna. Bipartit beskaffenhet CRISPR systemet gör det möjligt för dess användning i screening metoder sedan plasmid bibliotek innehållande uttryck kassetter av tusentals enskilda gRNAs kan användas för att förhöra många olika webbplatser i ett enda experiment.
Hittills har har gärna sekvenser för byggandet av biblioteken genererats nästan uteslutande av oligonukleotiden syntes, som begränsar genomförbara komplexiteten i sekvenser i biblioteket och är förhållandevis kostnadsintensiv. Här ett detaljerat protokoll för CORALINA (omfattande gärna biblioteket generationen genom kontrollerad nuclease aktivitet), en enkel och kostnadseffektiv metod för generering av mycket komplexa gärna bibliotek baserat på enzymatisk nedbrytning av tillförda DNA, beskrivs. Eftersom CORALINA bibliotek kan genereras från någon källa av DNA, finns gott om alternativ för anpassning, möjliggör ett stort utbud av CRISPR-baserade skärmar.
Anpassning av det bakteriella CRISPR/Cas9-systemet som en molekylär inriktning verktyg orsakade den senaste revolutionen i molekylärbiologi. Aldrig tidigare har det varit så lätt att manipulera kromatin på definierade genomisk platser. Vanliga tillämpningar av CRISPR inkluderar riktade genen mutationer1, genomet engineering2, epigenomet redigera3, transkriptionell aktivering och nedtystning4. En särskild fördel med CRISPR systemet är att dess tillämpningar inte är begränsat till väl studerat kandidat platser, som gärna bibliotek gör mindre partisk skärmar möjligt. Dessa underlättar upptäckten av funktionella loci i genomet utan några experimentella förkunskaper. Dock gärna biblioteket konstruktion är för närvarande mestadels baserad på oligo-nukleotid syntes, och det finns begränsade alternativ att köpa gärna bibliotek som inte är av mänskliga eller mus ursprung eller mål regioner utanför öppna läsning ramar. Således, även om CRISPR skärmar har redan visat sig otroligt potent5,6,7,8, sin fulla potential har ännu inte har utnyttjats.
För att övervinna begränsning av klassiskt gärna generation metoder två strategier har nyligen utvecklats. Båda är baserade på kontrollerade enzymatisk nedbrytning av målet DNA i stället för att förlita sig på anpassade oligonukleotiden syntes. Medan CORALINA9 sysselsätter micrococcal nuclease, endast tillgängliga alternativa metoden, CRISPR-äta10, använder sig av restriktionsenzym (HpaII, ScrFI, Bfajag och Mmejag). Ännu viktigare, kan båda teknikerna tillämpas på alla ingående DNA, som fungerar som källa av gärna protospacer sekvenser. Medan metoden CRISPR-ätande sysselsätter en strategi för att minska antalet klonade gRNAs vars inriktning platser inte följs av krävs S.pyogenes PAM (protospacer angränsande motiv), det genererar bara en bråkdel av alla möjliga funktionell gRNAs för en viss region. CORALINA, däremot, kan generera alla potentiella gRNAs för sekvensen källa, men innehåller också en högre andel av icke-funktionella guider. Gärna biblioteket generation genom kontrollerad nuclease aktivitet möjliggör produktion av omfattande gärna bibliotek för alla arter, alla Cas9-protein eller -effektor system på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt. Dessutom är CORALINA anpassningsbar till anpassning, som lämpliga indata och vektor val definiera bibliotek typ, storlek och innehåll. Här presenteras ett detaljerat protokoll som kan användas för generering av omfattande gärna bibliotek från olika källor av DNA (figur 1), inklusive bakteriella artificiella kromosomer (BACs) eller genomisk DNA9. De representativa resultat som åtföljer detta protokoll härleddes genom att tillämpa protokollet CORALINA BAC DNA.
CORALINA kan användas för att generera stor skala gärna bibliotek genom kontrollerad nuclease-nedbrytning av mål-DNA och bulk kloning av resulterande dubbel strandsatta fragment. Statistisk inferens indikerar att många fler än 107 individuella gärna sekvenser har redan varit framgångsrikt klonat använder protokollet vid hand9. CORALINA kan anpassas på flera sätt. Valet av DNA-templat definierar målregionen och maximal komplexiteten i det genererade biblioteket. Användning av detta protokoll, CORALINA bibliotek tidigare har genererats från människa och mus genomiskt DNA9. Representativa resultat presenteras här skildrar generering av ett CORALINA bibliotek från renat BAC DNA. Ytterligare anpassning kan uppnås genom valet av gärna uttryck vektor och linker sekvenser. Vi har tidigare testat tre olika par linker längder för Gibson montering med små variationer i effektivitet9.
På grund av deras ursprung från bulk rötas DNA, protospacer av CORALINA gRNAs är oftast inte exakt 20 bp i längd, men Visa en längd fördelning med ett medelvärde som beror både på parametrarna för MNase matsmältningen samt storleken på excision görs från sidan gelen s. representativa exemplet i figur 2B och C, skildrar fragment med en median längd mellan 19 och 27 bp. Vår erfarenhet bevaras troget längden av fragment av den genererade gärna protospacer9. Medan fragment kortare än 20 bp bör undvikas på grund av högre off-target resulterande gRNAs, längre fragment är sannolikt mycket mindre av ett problem för nedströms tillämpningar, eftersom det har visat att gRNAs med protospacers så länge som 45 bp är fortfarande funktionella9.
De två mest kritiska steg i protokollet CORALINA är storlek val av MNase-rötas fragment och kloning steg. Generation av fragment som är för korta (e.g. genomsnittet under 18 bp) eller införlivandet av alltför många tomma gärna uttryck vektorer kommer att göra biblioteket värdelös. Därför är det viktigt att optimera steget MNase matsmältning (figur 2A), att övervaka excision (figur 2B, C), kontrollera för fullständig nedbrytning av gärna vektor ryggraden och inklusive inga fragment kontroller i hela protokollet. Särskild omsorg måste också vidtas för att bevara framställningen av gärna biblioteket. En gemensam flaskhalsen i biblioteket generation är i allmänhet effektiv överföring av plasmider in bakterier för förstärkning. Således, stora mängder bakterier med utmärkt kompetens och ett stort antal enskilda elektroporation händelser är nödvändigt för att uppnå ett högt antal gärna kloner.
Nya strategier för gärna biblioteket produktion kommer att vara nödvändigt att skörda den fulla potentialen av CRISPR-baserad screening metoder under de kommande decennierna. Det finns en betydande efterfrågan på kostnadseffektiva, enkla och anpassningsbara metoder att generera storskalig bibliotek, en förutsättning att göra screening kan bli föremål för ett större antal modellsystem och olika CRISPR-baserade engineering tillvägagångssätt. CORALINA tillhandahåller ett första steg mot detta. De potentiella användningsområdena är många, särskilt för att producera omfattande bibliotek av genomen, cDNA härrör bibliotek av mindre vanliga modellsystem, mycket fokuserad bibliotek och experimentella uppställningar i vilka olika CRISPR-proteiner (med olika PAM krav) används i kombination.
Till skillnad från andra metoder genererar CORALINA alla möjliga gRNAs från ingången DNA. En nackdel med metoden är dock att gRNAs saknar sekvensen som behövs PAM ingår också i biblioteket, en funktion som den delar med en andra enzymatisk metod för gärna biblioteket generation, CRISPR-ätande (tabell 1). Valet av den idealiska metoden för gärna biblioteket generation beror på specifikationerna för planerade screeningen experimentera, särskilt natur (genic, tillsyn, intergenic) och storlek av målregionen (single locus, flera regioner, genome-wide). Vi ser en särskild upp i använda CORALINA när ett stort antal icke-kodande eller regulatoriska regioner skall analyseras, om det finns ofullständiga eller otillförlitliga sekvensinformation (exotiska modellsystem, blandningar av arter (t.ex. microbiomes) eller experimentellt erhållna ingång), om olika CRISPR endonucleases kombineras eller om mättar analys utförs på ett kort och definierade locus (e.g. representeras av BACs).
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Prof. Dr. Stephan Beck och Prof. Dr Magdalena Goetz för deras insats, hjälp och stöd i att utveckla metoden CORALINA, Maximilian Wiessbeck och Valentin Baumann för hjälpsamma kommentarer. Arbetet har stötts av DFG (STR 1385/1-1).
500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |