Metoder til at generere store gRNA biblioteker skal være enkel, effektiv og omkostningseffektiv. Vi beskriver en protokol til produktion af gRNA biblioteker baseret på Enzymatisk nedbrydning af target-DNA. Denne metode, CORALINA (omfattende gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet) præsenterer et alternativ til dyre brugerdefinerede oligonukleotid syntese.
Populariteten af CRISPR/Cas9-system for både genom og epigenome engineering skyldes dets enkelthed og tilpasningsevne. En effektor (Cas9 nukleasen eller en nukleasen-døde dCas9 fusion protein) er målrettet mod et bestemt websted i genomet ved en lille syntetisk RNA kendt som guide RNA eller gRNA. Den todelte karakter af CRISPR systemet muliggør dets brug i screening tilgange siden plasmid biblioteker indeholder udtryk kassetter af tusindvis af individuelle gRNAs kan bruges til at afhøre mange forskellige websteder i et enkelt eksperiment.
Til dato, har gRNA sekvenser for opførelsen af biblioteker været næsten udelukkende genereret af oligonukleotid syntese, som begrænser den opnåelige kompleksiteten af sekvenser i biblioteket og er relativt omkostningskrævende. Her, en detaljeret protokol for CORALINA (omfattende gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet), en enkel og omkostningseffektiv metode til generation af meget komplekse gRNA biblioteker baseret på Enzymatisk nedbrydning af input DNA, er beskrevet. Da CORALINA biblioteker kan oprettes fra enhver kilde til DNA, findes masser af muligheder for tilpasning, gør det muligt for en lang række CRISPR-baserede skærme.
Tilpasning af bakterielle CRISPR/Cas9-systemet som en Molekylær målretning værktøj forårsagede den seneste revolution i Molekylærbiologi. Aldrig før har det været så nemt at manipulere kromatin definerede genomisk steder. Fælles anvendelser af CRISPR omfatter målrettede gen mutationer1, genom engineering2, epigenome redigering3, transcriptional aktivering og genhæmning4. En særlig fordel ved CRISPR systemet er, at dens anvendelser ikke er begrænset til velundersøgte kandidat websteder, som gRNA biblioteker gøre mindre forudindtaget skærme muligt. Disse lette opdagelsen af funktionelle loci i genom uden nogen forudgående eksperimentelle viden. Dog gRNA bibliotek byggeri er i øjeblikket for det meste baseret på oligo-nukleotid syntesen, og der er begrænsede muligheder for at købe gRNA biblioteker, som ikke er af menneskelige eller mus oprindelse eller target regioner uden for åbne læsning rammer. Således, selv om CRISPR skærme har allerede vist sig utrolig potent5,6,7,8, deres fulde potentiale endnu ikke blevet udnyttet.
For at overvinde begrænsning af klassisk gRNA generation metoder to strategier er for nylig blevet udviklet. Begge er baseret på kontrollerede Enzymatisk nedbrydning af target DNA i stedet stole på brugerdefinerede oligonukleotid syntese. Mens CORALINA9 beskæftiger micrococcal nukleasen, metoden kun aktuelt tilgængelige alternative CRISPR-SPISE10, gør brug af restriktionsenzymer (HpaII, ScrFjeg, Bfajeg og Mmejeg). Vigtigere, kan begge teknikker anvendes på ethvert input DNA, som fungerer som kilde til gRNA protospacer sekvenser. Mens metoden CRISPR-spiser beskæftiger en strategi til at mindske antallet af klonede gRNAs hvis målretning websteder ikke er efterfulgt af den krævede S.pyogenes PAM (protospacer tilstødende motiv), det skaber kun en lille brøkdel af alle mulige funktionelle gRNAs for en given region. CORALINA, på den anden side er i stand til at generere alle mulige gRNAs for kilde sekvens, men indeholder også en højere brøkdel af ikke-funktionelle guider. gRNA bibliotek generation gennem kontrolleret nukleasen aktivitet giver mulighed for fremstilling af omfattende gRNA biblioteker for alle arter, eventuelle Cas9-protein eller -effektor system i en enkel og omkostningseffektiv måde. CORALINA er desuden tilpasses for tilpasning, som passende input og vektor valg definerer den type dokumentbibliotek, størrelse og indhold. En detaljeret protokol præsenteres her, kan bruges til den generation af omfattende gRNA biblioteker fra forskellige kilder af DNA (figur 1), herunder bakteriel kunstige kromosomer (BACs) eller genomisk DNA9. De repræsentative resultater ledsager denne protokol blev afledt ved at anvende CORALINA protokol til BAC DNA.
CORALINA kan bruges til at generere store skala gRNA biblioteker af kontrollerede nukleasen fordøjelsen af target-DNA og bulk kloning af resulterende dobbelt strandede fragmenter. Statistisk inferens indikerer, at mange flere end 107 individuelle gRNA sekvenser har allerede blevet med held klonede ved hjælp af protokollen på side9. CORALINA kan tilpasses på flere måder. Valget af DNA-template definerer målområde og maksimal kompleksiteten af den genererede bibliotek. Ved hjælp af denne protokol, CORALINA biblioteker tidligere er blevet genereret fra mennesker og mus genomisk DNA9. Repræsentative resultater præsenteret her skildre generation af en CORALINA bibliotek fra renset BAC DNA. Yderligere tilpasning kan opnås ved valg af gRNA udtryk vektor og linker sekvenser. Vi har tidligere prøvet tre forskellige par linker længder til Gibson forsamling med små variationer i effektivitet9.
På grund af deres oprindelse fra bulk fordøjet DNA, er protospacer i CORALINA gRNAs normalt ikke præcis 20 bp i længden, men Vis en længde distribution med et middel, der afhænger både parametrene for MNase fordøjelsen samt størrelsen af excision fremstillet af side gel s. den repræsentative eksempel vist i figur 2B og C, skildrer fragmenter med en median længde mellem 19 og 27 bp. Vores erfaring, er længden af fragmenter trofast bevaret af genererede gRNA protospacer9. Mens fragmenter kortere end 20 bp bør undgås på grund af højere ud målbeløbet af resulterende gRNAs, længere fragmenter er sandsynligvis langt mindre af et problem for downstream applikationer, da det er blevet påvist, at gRNAs med protospacers så længe 45 bp er stadig funktionelle9.
De to mest kritiske trin i CORALINA protokol er størrelse udvælgelse af MNase-fordøjet fragmenter og kloning trin. Generation af fragmenter, der er for kort (f.eks. gennemsnit under 18 bp) eller indarbejdelse af for mange tomme gRNA udtryk vektorer vil gøre biblioteket ubrugelig. Det er således vigtigt at optimere MNase fordøjelse trin (figur 2A), til at overvåge excision (figur 2B, C), check for komplet foraskning af gRNA vektor rygraden og herunder ingen fragment kontrol i hele protokollen. Særlig omhu har også at bevare repræsentation af gRNA bibliotek. Én fælles flaskehals i biblioteket generation er generelt effektiv overførsel af plasmider til bakterier til forstærkning. Således er store mængder af bakterier med fremragende kompetence og et stort antal individuelle elektroporation begivenheder nødvendige for at opnå et højt antal gRNA kloner.
Nye strategier for gRNA bibliotek produktion vil være nødvendigt at høste det fulde potentiale af CRISPR-baseret screening tilgang i de næste årtier. Der er en betydelig efterspørgsel efter omkostningseffektive, simple og tilpasselig metoder til at generere store biblioteker, en forudsætning at gøre screening imødekommenhed over for et større antal modelsystemer og forskellige CRISPR-baserede engineering tilgange. CORALINA giver et første skridt mod dette. De potentielle anvendelser er mangfoldige, især til at producere omfattende biblioteker af genomer, cDNA afledt biblioteker af mindre almindelige modelsystemer, stærkt koncentreret biblioteker og eksperimenterende set-ups i hvilke forskellige CRISPR proteiner (med forskellige PAM krav) anvendes i kombination.
I modsætning til andre metoder genererer CORALINA alle mulige gRNAs fra input DNA. En ulempe ved metoden er imidlertid at gRNAs mangler de krævede PAM sekvens indgår også i biblioteket, en funktion, som den deler med en anden enzymatisk metode for gRNA bibliotek generation, CRISPR-spiser (tabel 1). Valg af den ideelle metode for gRNA bibliotek generation afhænger specifikationerne af den planlagte screening eksperimentere, især arten (genic, lovgivningsmæssige, intergenic) og størrelse af målområde (enkelt locus, flere regioner, genome-wide). Vi ser en særlig opadrettede i hjælp CORALINA når et stort antal ikke-kodende eller lovgivningsmæssige områder er der skal analyseres, hvis der er ufuldstændige eller upålidelige sekvens oplysninger (eksotiske modelsystemer, blandinger af arter (f.eks. microbiomes) eller eksperimentelt indhentet input), hvis forskellige CRISPR endonucleases er kombineret eller hvis mætte analyse er udført på en kort og afgrænset locus (f.eks. repræsenteret ved BACs).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Prof. Dr. Stephan Beck og Prof. Dr. Magdalena Goetz for deres input, hjælp og støtte i udviklingen af CORALINA metoden, Maximilian Wiessbeck og Valentin Baumann til nyttige kommentarer. Arbejdet er blevet støttet af DFG (STR 1385/1-1).
500 mM EGTA | Sigma Aldrich | 03777-10G | 1.4., Inactivation of Mnase |
Novex Hi-Density TBE Sample Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6678 | 2.1. |
Novex® TBE Gels, 20%, 10 well | Thermo Fisher Scientific | EC6315BOX | 2.1., pre-made 20 % PAGE gel |
O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder, | Thermo Fisher Scientific | SM1303 | 2.1. |
Novex® TBE Running Buffer | Thermo Fisher Scientific | LC6675 | 2.1., PAGE gel running buffer |
Disposable scalpel, sterile | VWR | 233-5363 | 2.3., other equivalent reagents may be used |
SYBR Green I nucleic acid stain (1000x concentrate in DMSO) | Sigma Aldrich | S9430 |
2.3. +2.5., also available from Thermo Fisher Scientific (S7563) |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1) | Thermo Fisher Scientific | 15593-031 | 3.6.1. + 4.3., other equivalent reagents may be used |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
3M Sodium acetate , pH5.2 | Thermo Fisher Scientific | R1181 | 3.6.4., other equivalent reagents may be used |
Ethanol | 3.6.4. + 9.1.8., molecular biology grade | ||
Quick blunting kit | New England Biolabs | E1201 | 4.1. |
ammomium acetate | Sigma | A1542 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
magnesium acetate | Sigma | M5661 |
3.1., other equivalent reagents may be used |
0.5 M EDTA (pH 8.0) | VWR | MOLEM37465520 (or Promega V4231) | 2.2. + 3.1., other equivalent reagents may be used |
Agencourt AMPure XP beads | Beckman coulter | A63881 | 5.3. + 6.5. |
Gel extraction kit | QIAGEN | 28704 | 5.7.+ 7.1. +8.4., other equivalent reagents may be used |
concentrated T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | 6.1.+ 8.1.2. |
Long Amp Taq 2X Master Mix | New England Biolabs | M0287S | 6.3. |
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | 5.1. + 6.6., other equivalent reagents may be used |
HindIII | New England Biolabs | R0104S | 5.4.1. |
SacII | New England Biolabs | R0157S | 5.4.2. |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | 8.2.1. |
Tris base | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
2M MgCl | Sigma | 93362 | 8.1.1. |
dGTP,dATP, dCTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | 8.1.1. |
DTT | Sigam | DTT-RO |
8.1.1. |
PEG-8000 | Sigma | P5413 |
8.1.1. |
NAD | Sigma | N6522 |
8.1.1. |
T5 exonuclease | New England Biolabs | M0363S | 8.1.2. |
Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | 8.1.2. |
Taq DNA ligase | New England Biolabs | M0208L | 8.1.2. |
rSAP | New England Biolabs | M0371S | 8.3.1. |
TG1 competent cells | Lucigen | 60502-1 | 9.1. |
1mm gap electroporation cuvettes | VWR | 732-2267 | 10.2. |
Bio-Assay Dish (Polystyrene, 245 mm x 245 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | DIS-988-010M | 9.4. |
NaCl | Sigma | S7653 | 9.3. |
Bacto-tryptone | BD | 211705 | 9.3. |
Yeast extract | BD | 212750 | 9.3. |
Agar | Sigma | A1296 |
9.4. |
Glycerol | Sigma | G5516 |
9.17. |
MNAse | New England Biolabs | M0247S | 1.1. |
Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | throughout |
Micropulser | Biorad | 165-2100 | 10.2. |
Electroporation cuvettes | Biorad | 732-2267 | 10.2. |
250 ml centrifuge tubes | Corning | 430776 | 9.1-9.9. |