Sekundära degeneration av retinala ganglionceller (RGCs) uppstår vanligen i glaukom. Denna studie beskriver en innovativ operativ strategi för partiell synnerven transection. Användning av denna utrymmesbesparande operativ strategi sträcker sig modellens användningsområde och tillåter utforskning av sekundär skada mekanismer i RGCs på ett nytt sätt.
Tidigare studier har visat att sekundära degeneration av retinala ganglionceller (RGCs) förekommer vanligen i glaukom. Partiell synnerven transection anses vara en användbar och reproducerbara modell. Jämfört med andra synnerven skada modeller används vanligen för bedömning av sekundär degeneration, e.g. komplett synnerven transection och synnerven crush modeller, är partiell synnerven transection modell överlägsen som det skiljer primära från sekundära degeneration i situ. Därför, den fungerar som ett utmärkt verktyg för att utvärdera sekundära degeneration. Denna studie beskriver en ny operativ metod av partiell synnerven transection genom direkt tillgång till området av retrobulbär synnerven genom omloppsbanor laterala väggen av ögongloben. Dessutom presenterar vi en nydesignade, låg kostnad kirurgiska instrument för att hjälpa till med transection. Vilket framgår av de representativa resultat skilja gränsen för primär och sekundär skada områden, garanterar den nya instrument och hög effektivitet och stabilitet av modellen för genom att ge tillräckligt utrymme för kirurgisk operation. Detta gör i sin tur att det är lätt att skilja på meningeal slida och oftalmologiska fartyg från synnerven innan transection. En ytterligare fördel är att denna utrymmesbesparande operativ strategi förbättrar utredarnas förmåga att administrera läkemedel, bärare eller selektiv RGC spårämnen till stubben av delvis transected synnerven, möjliggör utforskandet av mekanismerna bakom sekundär skada i RGCs, på ett nytt sätt.
Sekundära degeneration uppstår vanligen i det centrala nervsystemet (CNS) efter traumatiska skador och följande akuta och kroniska neurodegenerativa sjukdomar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 död av nervceller och stödjeceller som en tidig följd av primära patologiska händelser som kallas primär degeneration, medan sekundär degeneration refererar till död av nervceller och stödjeceller, som inte eller bara delvis påverkas av primär skador. Sekundära degeneration av RGCs är också tros uppstå i glaukom. 6 Yoles o.a. 7 bekräftat att sekundära skadan av RGCs uppstår i synnerven skada modellen. De visade att nervceller vars axoner inte skadades efter en akut skada kommer så småningom urartar på grund av degenerativa miljö producerad av den skada som omger dessa axoner. Denna sekundära degeneration drabbar nervceller i en progressiv mode relaterade till svårighetsgraden av skadorna. Hittills har förblir mekanismerna bakom RGC skador i glaukom oklart, särskilt sådana som anknyter till sekundär skada, vilket resulterar i otillräcklig klinisk behandling. 8 , 9 , 10 därför det är nödvändigt att undersöka de bakomliggande mekanismerna av sekundära degeneration av RGCs under utvecklingen av glaukom. 11 fastställande av djurmodeller för sekundära skador som kan kvantitativt bedöma storlek, distribution och mekanism av sekundära degeneration av RGCs lockar allt större uppmärksamhet från forskare som studerar sekundär skada av RGCs.
För att klargöra denna fråga, grundades en råtta PONT modell av Levkovitch-Verbin et al. 12 att utvärdera axonal skada inducerad degeneration och döden av RGCs. Denna modell tros utgöra ett bra verktyg för att utforska mekanismerna av sekundära degeneration och identifiera potentiella nervskyddande agenter. Instrumentet används för att generera denna modell av sekundär skada är en diamond kniv med en skala till transekt kvantitativt genom att ange djupet av abscission genom ratten ratten, för att slutföra en kvantitativ transection av synnerven. Kirurgisk väg närmar sig från ögongloben uppåt eller temporal bindhinnan. Under den operativa processen, kan näthinnan och synnerverna påverkas av styrkan av pincetten, som i sin tur kan orsaka primär skada. Viktigare, på grund av det begränsade utrymmet av exponerade synnerven är det svårt att skilja den meningeal slidan innan snittet. Därför är det möjligt att skada de oftalmologiska fartyg under partiell synnerven transection, vilket resulterar i retinal ischemi och misslyckandet av modellen. Dessutom i diamantkniven är kostsamt, och varje användning minskar tip skärpan. Detta kan i sin tur påverka djup och effekten av modellering.
Modellen av sekundära degeneration av RGCs beskrivs i denna studie erhölls genom en ny operativ strategi från den laterala orbital väggen i ögongloben. Denna roman operativ strategi går direkt till retrobulbär synnerven omgiven av orbital muskel konen, undvika primära skador på ögongloben och synnerven när du drar nedåt eller mot den nasala laterala sidan av ögongloben. Detta också ökar utrymmet av kirurgisk operation under modell etablering, och gör meningeal slida isolering innan delvis transecting synnerven. Det är viktigt att notera att den oavsiktlig inblandning och skadan av oftalmologiska fartyg kan leda till fel i modellen. Modellen möjliggör dessutom en uppföljande bedömning av transfekterade celler, droger och reagenser på stubben av delvis transected synnerven. Egendesignade kirurgiska instrumentet kan är billigt och användas flera gånger, vilket minskar kostnaden för modellering. Sekundär skada modellen för RGCs som inrättats genom denna metod visade sig ha bra reproducerbarhet och stabilitet.
Operativt förfarande
Det finns vissa punkter värdig underrättelse i färd med att modellera konstruktion. I steg 4,2, bör kirurgiska rörelsen utföras noggrant för att undvika att skada vaskulatur ovan subfascial muskeln. Särskilt, när du klipper den subkutana fascian i det yttre laterala Cantus, kan sharp-tandad tång användas att dra uppåt subkutana fascian på fascia ytan vertikalt; fascian bör skäras med Vännäs våren sax för att undvika skador till orbital ven på de yttersta Cantus, vilket kan resultera i modell misslyckande av kraftig blödning. Steg 4,3 har fördelen av potentiellt hindrar blödning när du tar direkt bort från blodkärlen. I att separera orbital muskler i steg 4,5, anledningen till plockning sharp-tandad tång men inte Vännäs är våren sax att undvika kontinuerlig blödning och blödning. Musklerna är rakt på sak separerade på båda sidor i vinkelrät riktning till huden fascia snittet; under tiden är de djupa musklerna i omloppsbana sträckta utåt och perifert. Detta förfarande kommer att avslöja djupare delar av omloppsbanor kaviteten, som ger ett större kirurgiska fönster och tillåta obehindrat tillträde till vävnader överliggande synnerven. I ovanstående regler, om blödning uppstår, trycket bör tillämpas med hjälp av sterila kirurgiska eller bomullspinnar. Mindre blödning stannar efter några sekunder av detta förfarande. Syftet med steg 4,6 är att underlätta uppföljning för att enkelt ta bort lite fett och separata muskler i omloppsbana muskel konen att exponera synnerven längs riktningen av synnerven i orbital djupet.
De mest kritiska delarna av det nuvarande protokollet är steg 5.1-5.6. Det är viktigt att inte skada i blodkärlen runt synnervspapillen. Synnerven bör vara delvis transected på minst 1,5-2,0 mm från baksidan av ögat, för att undvika skada på den oftalmologiska artär som penetrerar nerven inom 1 mm av ögat och levererar blod till inre näthinnan. Syftet med skära den laterala rectus är att uppnå bättre exponering av synnerven som den laterala rectus är bred och uppenbarligen blockerar vyn av synnerven. Samtidigt för att undvika att ta bort den oftalmologiska artär som associeras med den meningeal slidan (figur 5), är det nödvändigt att separera och separera dura runt synnerven och undersöka det vaskulära mönstret av meningeal slida, med pincett för att försiktigt rotera slidan. Dessutom bör ett område saknar blodkärl identifieras, så att ett längsgående snitt i meningeal skidan. Det är också nödvändigt att bibehålla ett litet avstånd från baksidan av ögat, att undvika portion av dura som är nära förknippad med oftalmologiska artär. Näthinnan är normalt öppet och blodkärl kan vara klart avgränsade. Vid skadade retinal blodtillförsel, är näthinnan degenererat, vilket leder till en mjölkvit flockig utseende. Glaskroppen kammaren i ögat och linsen blir vanligtvis grumlig samt, med minskad eye storlek över tid. I denna studie bekräftade preoperativa och postoperativa bilder av fundus ingen skada att fundus blodtillförseln i modellen efter tillämpning av ovanstående steg.
Dessutom krävs särskild omsorg i flera steg av denna modell. När du använder sharp-böjd-tandad tång eller andra kirurgiska instrument för att exponera synnerven, bör kirurgen undvika överdriven kraft, eftersom det kan skada synnerven, ögongloben eller oftalmologiska artär, vilket resulterar i primära skador och retinal ischemi. Dessutom bör blodkärlen kring ögat inte skadas, för att undvika ihållande blödning, vilket kan leda till fel i modellering. Den SSAI som används i detta experiment kräver känsliga användning. När synnerven placeras inom instrument spåret, behöver synnerven och räfflad yta monteras tätt att säkerställa bra konsistens och repeterbarhet av varje djurmodell. Med praktiken kan hela ingreppet slutföras inom 15-20 minuter per öga, efter initial transaktion nedskärningarna har gjorts.
Wang et al. 19 publicerade en liknande djurmodell av partiell synnerven transection etablerade använder en synnerven kvantitativa Amputeraren. De kirurgiska ingrepp innehåller: 1) skär isär de yttersta Cantus, tillfälligt upphävande och fastställande den palpebrala överlägsen; (2) att utforska synnerven, och transecting den överlägsna delen av synnerven med Amputeraren; och 3) suturering av bindhinnan och hud. Även om det kirurgiska ingreppet var relativt enkla, uppstod de följande problem under operationen. Även om laterala Cantus snitt kan exponera vissa utrymme för drift, fanns det ett oundvikligt behov att hela tiden sträcka ögongloben för att exponera den retrobulbär synnerv slidan, särskilt när kirurgerna önskas att exponera en längre retrobulbär synnerven slida att underlätta ytterligare slida isolering; kraft för stretching ögongloben var större, som sannolikt kommer att skada direkt dragning av ögongloben och synnerven. Ingen särskild uppmärksamhet ägnades åt blodkärl som kan skäras tillsammans med synnerven slida, och skador på blodkärl är sannolikt att leda till misslyckade modell etablering. De huvudsakliga förfarandena för sekundära skador modell som beskrivs i detta dokument är: en ny operativ strategi från den laterala orbital väggen i ögongloben till direkt tillgång retrobulbär synnerven omgiven av orbital muskel konen, undvika primär skada till den ögongloben och synnerven, när du drar nedåt eller mot den nasala laterala sidan av ögongloben. Denna nya operativa strategi ökar utrymmet av kirurgisk operation under modellering, och möjliggör lätt isolering av meningeal slida, som är nära förknippad med den oftalmologiska artären, innan partiell transection av synnerven. Partiell synnerven transection utfördes med ett egendesignade kirurgiska instrument, som är kostnadseffektiv och återanvändbara, minska totalkostnaden för modellering. Råttans orbital struktur är annorlunda från andra däggdjur, med banan som är närmast Cantus och ingen benstrukturen, men täckt med muskler. Den kirurgiska metoden kunde nå den bakre delen av ögongloben utan att behöva förstöra den orbital ben och periostet. Genom strikt preoperativ desinfektion och postoperativ antibiotikaprofylax, var infektion, inflammation och ödem kraftigt reducerad.
Egendesignade kirurgisk assistent Instrument
En råtta modell av partiell synnerven transection fastställdes med hjälp av egendesignade kirurgisk assistent instrumentet, vars huvuddrag är följande. Det kan hjälpa delvis kvantitativa transection av synnerven utsätts för räfflade kanten, också samstämmighet transection bland olika djur. Vi testade och verifierade repeterbarheten av modell anläggning med SSAI. Den maximala variationskoefficienten var 1,85%, med ett genomsnittligt värde 0,67% ±0. 44%. 20 dessa resultat indikerar att SSAI kunde användas att upprätta partiella synnerven transection modeller, med tillfredsställande reproducerbarhet och FNiformity.
Räfflad ytans bredd och utformningen av sikthalvcirkeln spårets inre ytan kan ha en mer fast effekt på synnerven och göra den räfflade ytan och synnerven bifoga mer tätt, också minskar experimentella fel och biverkningar. Den räfflade kanten ger ett bättre skydd av synnerven i spåret under operationen, som inte kommer att skada synnerven i spåret, oavsett fräsens skärpa. En annan fördel med den räfflade kanten är crush skadeförebyggande under synnerven transection.
Det är lämpligt för drift i djupa och smala utrymme. Även om den nya operativa metoden utökats, vägen är fortfarande djupt och handhållna pole och gemensamma avsnitt kan användas för att placera räfflad huvudet lätt under synnerven slida att utföra uppföljande åtgärder. När instrumentet används för drift, kan ett brett utbud av fräsar användas för transection, e.g. en 26 G nålspetsen. Även en safir kirurgisk sond kniv kan väljas att undvika kontusion och krossa skador orsakade av sax. Groove ytor kan göras i olika vertikala djup att slutföra olika grader av synnerven skärning.
Jämfört med Amputeraren Wang har et al. SSAI en enklare struktur. Det skärande steget är dessutom bekvämare med SSAI, med förbättrad konsekvens och repeterbarhet av animaliskt modellen. Verktyg som är tillämpliga för kapning med SSAI är slutligen också bredare. Sammanfattningsvis kan SSAI, vilket gör kvantitativa och enhetlig snitt av nerv, tjäna som ett effektivt instrument för att fastställa råtta modeller för bedömning av synnerven transection.
Egenskaper hos råtta partiell synnerven Transection modellen
Partiell synnerven transection modellen är användbart för att bedöma sekundära degeneration i RGCs. Den potentiella fördelen att denna modell är förmågan att separera primära från sekundära degeneration korrekt i situ, både i synnerven och näthinnan. De centrala och ventrala synnerverna var mer känsliga för sekundär skada efter partiell transection (ca 1/3 till 1/2) av dorsala synnerven (figur 6). I näthinnan, bör den regionala läge av primära och sekundära skador av RGCs baseras på synnerven motsvarande retinala RGCs efter partiell transection topografi. Om hela näthinnan av råtta är indelat i dorsala (superior) och ventrala (sämre) delar, är sekundära och primära skador närvarande i båda delarna. Men bör baserat på förhållandet mellan RGCs på näthinnan och synnerven axon, RGC död i ventrala näthinnan främst hänföras till sekundär skada (figur 3). 12 , 22 , 23 fördelarna med denna modell inkludera: enkel och lätt att använda instrumentet med standardförfaranden; ingen effekt på oftalmologiska fartyg. Bra reproducerbarhet och stabilitet. Denna teknik kan användas för att transfect RGCs från denna utrymmesbesparande operativ strategi genom att tillämpa kort störande RNAs (siRNAs), plasmider och virala vektorer på partiell synnerven stubbe; Dessutom kunde reagenser placeras på partiell synnerven stubben för selektiv behandling eller märkning av RGCs.
Övergripande, primära och sekundära skador av RGCs samexisterat efter partiell synnerven transection i denna djurmodell, med en tydlig gräns i näthinnan mellan två skada typer. Även om associering av RGC läge på näthinnan och synnerven axoner behöver ytterligare utredning för en mer exakt åtskillnad, denna utrymmesbesparande operativ strategi utökar användningsområdet av modellen och tillåter forskare att utforska den mekanismer för sekundära skador i RGCs på ett nytt sätt.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick stöd av Beijing naturvetenskap Foundation (7152038), den grundläggande forskningsmedel för Central universiteten i Central South University (2016zzts162) och Science Foundation av Aier Eye Hospital forskargruppen (Grant nr. AF156D11). Slutligen, tack Fancheng Yan Yiping Xu för det ovärderliga stödet genom åren.
Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
Fluorogold | Biotium | 80014 | |
Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |