Summary
Secundária degeneração das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. Este estudo descreve uma abordagem inovadora e operativa para transecção parcial nervo óptico. O uso dessa abordagem operativa de economia de espaço amplia gama de aplicação do modelo e permite a exploração dos mecanismos de lesão secundária em RGCs de uma maneira nova.
Abstract
Estudos anteriores mostraram que a degeneração secundária das células ganglionares da retina (RGCs) comumente ocorre no glaucoma. A transecção parcial nervo óptico é considerada um modelo útil e reprodutível. Comparado com outros modelos de lesão do nervo óptico comumente usados para avaliar a degeneração secundária, por exemplo, completa nervo óptico transecção e modelos de esmagamento do nervo óptico, o modelo de transecção parcial nervo óptico é superior, como distingue primário de degeneração secundária em situ. Portanto, ele serve como uma excelente ferramenta para avaliar a degeneração secundária. Este estudo descreve uma nova abordagem operativa da transecção parcial nervo óptico acessando diretamente a área do nervo óptico retrobulbar através da parede lateral orbital do globo ocular. Além disso, apresentamos um instrumento cirúrgico recentemente projetado, de baixo custo para ajudar com transecção. Como demonstrado pelos resultados representativos na distinção entre o limite das áreas de lesão primária e secundária, a nova abordagem e o instrumento garante alta eficiência e estabilidade do modelo, fornecendo o espaço adequado para a operação cirúrgica. Isto por sua vez torna mais fácil para separar a bainha meníngea e vasos oftálmicos do nervo óptico antes transecção. Um benefício adicional é que esta abordagem operativa de economia de espaço melhora a capacidade dos investigadores para administrar drogas, transportadoras ou traçadores RGC seletivas para o coto do nervo óptico parcialmente necrosante, permitindo a exploração de mecanismos subjacentes lesão secundária em RGCs, de uma maneira nova.
Introduction
Degeneração secundária ocorre geralmente no sistema nervoso central (SNC) após lesões traumáticas e seguintes doenças neurodegenerativas agudas e crônicas. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 a morte de neurônios e células gliais como uma consequência antecipada dos eventos patológicos primários é denominada degeneração primária, enquanto degeneração secundária refere-se à morte de neurônios e células gliais, que não são ou apenas parcialmente afetadas pela primária danos. Degeneração secundária de RGCs também é acredita para ocorrer no glaucoma. 6 . Yoles et al 7 confirmou que a lesão secundária de RGCs ocorre no modelo de lesão do nervo óptico. Eles mostraram que neurônios cujos axônios não ficaram feridos depois que um dano agudo eventualmente irão degenerar devido ao ambiente degenerativo produziram por lesão em torno destes axônios. Esta degeneração secundária afeta os neurônios de forma progressiva, relacionados com a gravidade dos danos infligidos. Até agora, os mecanismos subjacentes danos RGC no glaucoma permanecem pouco claras, especialmente aqueles relacionados a lesão secundária, o que resulta em tratamento clínico insuficiente. 8 , 9 , 10 portanto, é necessário explorar os mecanismos subjacentes de degeneração secundária de RGCs durante o desenvolvimento do glaucoma. 11 criação de modelos animais de lesão secundária que pode avaliar quantitativamente o tamanho, distribuição e mecanismo de degeneração secundária de RGCs atrai cada vez mais a atenção de cientistas estudando lesões secundárias de RGCs.
Para esclarecer esta questão, estabeleceu-se um modelo do rato PONT por Luiz-Verbin et al 12 para avaliar lesão axonal induzida por degeneração e morte de RGCs. Este modelo é acredita-se que constituem uma boa ferramenta para explorar os mecanismos da degeneração secundária e identificar os potenciais agentes neuroprotective. O instrumento usado para gerar este modelo de lesão secundária é uma faca de diamante com uma escala de transecto quantitativamente, definindo a profundidade da abscisão através do botão de discagem, para completar uma quantitativa transecção do nervo óptico. O caminho cirúrgico aproxima-se da conjuntiva ocular ascendente ou temporal. Durante o processo operacional, a retina e o nervo ótico pode ser afetado pela força de pinça, que por sua vez, pode causar lesões primárias. Mais importante, devido ao espaço limitado do nervo óptico exposto, é difícil separar a bainha meníngea antes da incisão. Portanto, é possível danificar os vasos oftálmicos durante transecção parcial nervo óptico, que resulta em isquemia da retina e o fracasso do modelo. Além disso, a faca de diamante é cara, e cada utilização diminui a nitidez de ponta. Isto por sua vez pode afetar a profundidade e o efeito da modelagem.
O modelo de degeneração secundária de RGCs descrito neste estudo foi obtida através de uma nova abordagem operativa da parede orbital lateral do globo ocular. Esta nova abordagem operativa acessa diretamente o nervo óptico retrobulbar rodeado pelo cone muscular orbital, evitando lesão primária para o globo ocular e nervo óptico quando puxando para baixo ou para o lado nasal lateral do globo ocular. Isto também aumenta o espaço de operação cirúrgica durante o estabelecimento de modelo e permite o isolamento de bainha meníngeos antes parcialmente cruza o nervo óptico. É importante notar que o envolvimento inadvertido e lesão dos vasos oftálmicos podem levar ao fracasso do modelo. Além disso, o modelo permite uma acompanhamento avaliação das células transfectadas, drogas e reagentes no tronco do nervo óptico parcialmente necrosante. O instrumento cirúrgico auto-concebidos é barato e pode ser usada várias vezes, reduzindo assim o custo da modelagem. O modelo de lesão secundária de RGCs estabelecido por este método foi mostrado para ter estabilidade e boa reprodutibilidade.
Protocol
procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo animal institucional conta e usar o Comité (IACUC) da Universidade de medicina da Capital. Todos os instrumentos cirúrgicos e soluções foram esterilizadas antes da cirurgia para limitar a infecção microbiana.
Nota: O protocolo cirúrgico incluiu cinco partes, designadamente anestesia, abordagem cirúrgica, avaliação do nervo óptico, fechamento e recuperação. Para ajudar com transecção quantitativa parcial do nervo óptico, destinava-se um instrumento cirúrgico de novo, de baixo custo. Todos os procedimentos foram realizados seguindo regras éticas e a técnica cirúrgica.
1. técnica cirúrgica
- realizar experimentos utilizando a técnica asséptica; protocolos para uso de animais devem ser instituição específica.
- Esterilize instrumentos e materiais (soluções, teste de substâncias, traçadores, agulhas, etc.) entram em contacto com tecidos vivos, a fim de prevenir a contaminação e impactos negativos sobre o bem-estar dos animal, bem como potenciais impactos negativos sobre o estudo .
2. Anestesia
- ratos Anesthetize SD usando um sistema de vaporizador de isoflurano veterinária. Uso de oxigênio da classe médica em uma taxa de 1 L/min para vaporizar o gás de isoflurano. Coloque o animal na caixa anestesia anexado e executar isoflurano em uma concentração de 4,5% até respiração lenta e sedação animal.
- Mudar o fluxo de gás para o acessório de máscara de gás e colocar o animal sobre a mesa de operação. Reduzir a concentração de isoflurano para anestesia monitor e 2%. Animais maiores (> 300 g) podem exigir uma maior concentração de isoflurano. Monitorar a anestesia durante a cirurgia, com dosagem de isoflurano, ajustada em conformidade. Constantemente avaliar a profundidade e a taxa de respiração e realizar a avaliação de pitada de dedo cada 5 min, para garantir a ausência de dor profunda.
- , Uma vez que a cirurgia é concluída, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio do ar por alguns minutos antes da remoção da mesa de operação. Manter a temperatura corporal cobrindo o animal com um cobertor cirúrgico e/ou usando um cobertor regulamentado durante a cirurgia.
3. Auto-concebidos instrumento cirúrgico Assistant (SSAI)
- uso um SSAI feita de aço inoxidável e principalmente é composto por uma vara de mão (9 mm de diâmetro, comprimento, 100 mm;) e uma cabeça estriada ( Figura 1). A superfície estriada da cabeça estriada é semi circular, com profundidade vertical, largura e comprimento de 200 µm, 500 µm e 1.000 µm, respectivamente. Entre as duas partes, há uma seção conjunta com um comprimento de 50 mm. A cabeça estriada ' s edge é 300 µm de largura.
Nota: A superfície estriada permite a estabilização do nervo óptico ventral para transecção. Nervo óptico dorsal é exposto para o exterior do sulco, quando o lado ventral do nervo óptico põe dentro dele; Entretanto, o nervo óptico dorsal, exposto à borda estriada pode ser seccionado quando corte vertical é realizada. Nervo óptico ventral definido dentro da superfície estriada é protegido pela cabeça estriada ' borda s. - Atingir a lesão primária no RGCs correspondente a axônios quantitativamente necrosante nervo óptico (lado dorsal), enquanto o secundário lesão seria realizada em RGCs, correspondente a untransected nervo óptico axônios (lado ventral) sem dano direto.
4. Abordagem cirúrgica
- lugar do lado direito do rato para cima na mesa cirúrgica com a cabeça virada para o cirurgião. Ajuste a órbita direita no centro do campo de visão cirúrgico. Em seguida, limpe a área de incisão várias vezes ao longo do canto lateral ao forame acústico externo da pele bem orbital, aplicação de clorexidina 0,5% em etanol a 75%. Remova o pelo entre o canto do olho lateral ao forame acústico externo usando tesoura íris.
- Fazer uma incisão de pele usando uma tesoura de íris ao longo do canto lateral ao forame acústico externo com um comprimento de 0,5 a 1 cm. Em seguida, aperte a fáscia e puxe para cima para criar uma cunha triangular com fórceps com dentes de 0.12mm. Insira a lâmina inferior de Vannas para primavera na área de incisão e abriram a fáscia na mesma direção da tesoura.
- Corte a fáscia com Vannas tesoura de mola e expor a veia orbital. Uso serra afiada fórceps para apertar os lados da veia orbital e blunt abrir ambos os lados da incisão. Coloque a veia orbital na direção da superfície orbital do músculo, que é posicionada para facilitar a operação de acompanhamento cirúrgica e evitar cirurgia relacionados com sangramento da veia orbital.
- Use tesoura de íris para cortar o direito canto lateral do olho separado ao longo da linha de incisão para expor totalmente o campo de visão para dissecação dos músculos orbitais durante siga de cima
- Continuar para fixar a pasta do músculo orbital subfascial e blunt separa verticalmente na direção da incisão da pele e fáscia. Separados ao longo dos lados gradualmente até atingir a profundidade orbital, até o aparecimento do tecido adiposo orbital.
- Após a exposição do tecido adiposo orbital, mudar a direção da cabeça de rato de virados para o cirurgião verticalmente ao lado direito do cirurgião. Enquanto isso, mantenha a área constantemente úmido usando cirúrgico ou cotonetes de algodão contendo PBS estéril. Esse procedimento garante uma visão clara do campo cirúrgico, mantendo os tecidos úmida e macia.
5. Acessando o nervo óptico
- corte orbitais tecidos adiposo, cobrindo o cone muscular orbital em torno do nervo óptico na cavidade orbital. Isso garante uma melhor exposição da abordagem cirúrgica adequada. Sustentada de manter ressecção do tecido adiposo limitado para evitar sangramento.
- Corte do tecido adiposo, expondo o reto lateral. Fixar o reto lateral para fora e depois cortá-la com Vannas para primavera. Se o tecido adiposo permanece sob o reto lateral, puxe para cima a gordura sobrejacente nervo óptico usando 0.12 mm com dentes fórceps e cortá-la com Vannas para primavera.
Nota: Neste momento, a bainha de tecido em torno do nervo óptico deve ser visível. - Continuar a separar a bainha do tecido ao longo da direção do nervo óptico na profundidade orbital, até a exposição total do nervo óptico. Manter a área limpa utilizando compressas cirúrgicas para limpar pequenas quantidades de sangue que surgem a partir de remoção de tecido.
Nota: Agora, o nervo óptico deve ser visível. - Para acessá-lo, retire a bainha na meninge que envolve o nervo sem danificar a artéria oftálmica. Gire suavemente a bainha para examinar o padrão vascular da dura-máter em alta ampliação sob um microscópio operacional.
- Identificar uma área desprovida de vasos sanguíneos e realizar um corte longitudinal sobre a dura-máter. 13 rasgar a bainha paralela à direção do nervo óptico com uma ponta de agulha 26G ou uma faca de safira sonda cirúrgica com cuidado, evitando danos à vasculatura com cortes laterais.
Nota: O único resquício cobrindo o nervo deve ser membra da aracnoidene, que é muito fina e transparente.
- Identificar uma área desprovida de vasos sanguíneos e realizar um corte longitudinal sobre a dura-máter. 13 rasgar a bainha paralela à direção do nervo óptico com uma ponta de agulha 26G ou uma faca de safira sonda cirúrgica com cuidado, evitando danos à vasculatura com cortes laterais.
- Semelhante ao passo 5.2, rasgar a membrana aracnoide suavemente com uma ponta de agulha 26G ou uma faca de safira sonda cirúrgica, paralela à direção do nervo óptico. 13
- lay nervo óptico dentro do sulco de instrumento suavemente e cuidadosamente, resultando no nervo óptico dorsal, sendo ligeiramente maior do que a borda de cabeça estriada. Neste momento, transecto nervo óptico dorsal acima da borda da plataforma de cabeça estriada com uma ponta de agulha 26G ou uma faca de safira sonda cirúrgica para completar a transecção parcial nervo óptico.
6. Fechamento e recuperação
- Move o instrumento um pouco mais fundo no sentido vertical direção do nervo óptico para libertar o último. Em seguida, remova a cabeça estriada do instrumento suavemente. Tente não arranhar os músculos oculares ou outros tecidos para evitar dano extra. O coto de transecção parcial nervo óptico pode ser observado.
- Substituir o reto lateral, fáscia e outros tecidos circunvizinhos do olho para suas posições originais. Em seguida, suture o músculo e as camadas de pele da órbita em sequência. Se a hemorragia persistir, delicadamente preencher com uma bola de algodão médico antes de fechar a ferida e manter isso por um período de tempo. Aplique a pomada antibiótica na ferida para prevenir a infecção.
- Turn off fonte de isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio do ar por vários minutos. No processo de reanimação de rato, preparar o isolamento térmico com uma esteira aquecida, ou cubra a superfície da gaiola com estofamento seco. Cobrir os animais com cobertores, para garantir a permeabilidade das vias aéreas de rato durante o processo de recuperação.
- Animais de casa individualmente após a cirurgia. Administre analgésicos pós-cirúrgicos de acordo com as diretrizes fornecidas pelas autoridades institucionais cuidados com animais. Monitorar cuidadosamente os animais após a cirurgia.
Representative Results
Para verificar o sucesso relativos ao estabelecimento de um modelo de lesão secundária com a nova abordagem operacional usando SSAI (Figura 2A), o RGCs retrogradely foram rotulados imediatamente após a criação do modelo. O objetivo deste procedimento foi rótulo RGCs retrogradely através da injeção de um corante marcador neural (3% fluoróforo (por exemplo, Fluorogold) em solução salina tampão de fosfato estéril) no colículo superior (Figura 2B). Essa abordagem resulta em rotulagem reprodutíveis de RGCs viáveis com pouca variação. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 o corante vai ser retrogradely tomado pelos RGCs na retina e constitui um marcador para RGCs ao vivo, com os axônios não seccionados no olho direito. Enquanto isso, o RGCs correspondente ao nervo óptico parcialmente necrosante axônios no olho direito não poderiam ser rotulados com corante marcador (Figura 2). Como um olho de controle, o olho esquerdo sem operação, RGCs ao longo do nervo óptico da retina foram todos identificados com a tintura fluorescente de ouro de forma retrógrada do colículo superior (Figura 2D).
Sete dias após a transecção parcial nervo óptico e rotulagem retrógrada de RGCs, as retinas foram colhidas, fixo, achatadas e montadas. Os rotulado RGCs foram fotografadas sob um microscópio fluorescente em regiões definidas da retina. Os resultados de fluorescência-etiquetada RGCs com ou sem transecção parcial nervo óptico são mostrados na Figura 3. Somente os RGCs na retina direita correspondente à porção untransected do nervo óptico foram rotulados com ouro fluorescente, e um limite claro de RGCs sem rótulo e rotulados pode ser visualizada (Figura 3A, Figura 3B), demonstrando a transação parcial do nervo óptico. Como um olho de controle, todos os RGCs da fluorescência de retina mostrou olho esquerdo (Figura 3, Figura 3D).
Para avaliar se a vascularização ao redor da cabeça do nervo óptico e artéria oftálmica que fornece sangue para o entoretina foram feridos e afetadas durante a operação, o fundo do olho direito foi fotografada antes e após a cirurgia. As imagens mostraram o fornecimento de sangue para o olho direito (olho operativo) antes e 1 hora após a operação. Sangue nas artérias era adequada. Observou-se não há obstrução da veia. Estes resultados indicaram que não houve dano ao sistema de abastecimento de sangue durante a operação (Figura 4A, Figura 4B). Portanto, o modelo de degeneração secundária de RGCs foi estabelecido com êxito.
Figura 1 : Fotografias de instrumento auxiliar auto-concebidos, SSAI. (A) vista panorâmica do instrumento cirúrgico, com duas partes principais, incluindo um polo à mão e uma cabeça estriada. Entre eles, há uma seção conjunta com um comprimento de 50 mm. O comprimento do polo à mão é de 100 mm, e o diâmetro do polo à mão é 9 mm. (B) A característica do sulco SSAI. A superfície estriada da cabeça estriada é semi circular, o que permite que o nervo óptico colocar dentro dela, sendo estabilizado por transecção. A superfície estriada é com uma profundidade vertical de 200 µm e uma largura de 500 µm e um comprimento de 1.000 µm. A largura da borda da cabeça estriada é 300 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Diagrama esquemático da RGC rotulagem na retina após a transecção parcial do nervo óptico direito com o instrumento de auto-concebidos assistente cirúrgico (SSAI) e retrogradely, rotulando o colículo superior com o fluoróforo. (A) a vista cirúrgica de transecção parcial razão óptico nervo em ratos com o instrumento de auto-concebidos assistente cirúrgico (SSAI). (B) após a modelagem, RGCs foram rotulados retrogradely pela injeção de um corante marcador neural (cor amarela, fluoróforo 3% em solução salina tampão de fosfato estéril) para o colículo superior do cérebro. Desde que os axônios das RGCs residem no colículo superior, o corante marcador é retomado por RGCs retrogradely e constitui um marcador de células vivas. A seção transversal na figura representa um corte transversal de nervo óptico. OD, olho operado; OS, olho de controle sem operação. Em (C), apenas os RGCs correspondente à porção untransected do nervo óptico foram rotulados com fluoróforo. Azul representa não separados ventral os nervos ópticos e os RGCs correspondentes na retina; vermelho reflete parcialmente necrosante dorsal os nervos ópticos e os RGCs correspondentes na retina. (D) o retinal RGCs do olho esquerdo (olho de controle) sem o procedimento cirúrgico foram todos identificados pela tintura. Dorsais e ventrais nervos ópticos foram todos identificados pela tintura também. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Micrografias de epifluorescência retina inteira de fluoróforo rotulado RGCs 7 dias após o estabelecimento da transecção parcial nervo óptico modelo e retrógrada de rotulagem do colículo superior. Também são apresentados os Diagramas esquemáticos correspondentes de Fluorogold manchado áreas RGC na retina. (A) e (C) representam os Diagramas esquemáticos de RGCs na retina do direito (agente) e olhos de esquerda (controle) após a rotulagem com fluoróforo, respectivamente. Amarelo indica a área rotulada com a tintura fluorescente de ouro. A retina é dividida em partes centrais, dorsais e ventrais. (B) e (D) representam toda retina epifluorescência micrografias obtidas sob um microscópio de fluorescência; amarelo representa a área de RGCs rotulado com fluoróforo. No cirúrgico olho (olho direito) mostrado em B, a região sem rótulo representa a área de RGCs correspondente ao nervo óptico, que é parcialmente seccionado, principalmente no lado dorsal da retina. A região rotulada pela tintura fluorescente de ouro é a área de RGCs correspondente ao nervo óptico, que não é seccionado e concentrou-se sobretudo nos lados ventrais e centrais da retina. O bounDary entre as áreas de sem rótulo e etiquetados RGCs é claro. Degeneração primária de RGC corpos seria limitada a retina dorsal, e toda perda de corpos RGC da retina central e ventral poderia ser atribuída à degeneração secundária. (D) retinal todo photomicrograph do olho esquerdo após a rotulagem do RGCs com fluoróforo. As RGCs do olho esquerdo controle sem procedimento cirúrgico foram totalmente manchadas pelo fluoróforo. Escala de barras = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Imagens pré-operatórias e pós-operatórios do fundo do olho direito obtida pela câmera de Fundus. (A) a imagem de fundo antes da cirurgia do olho direito em ratos, mostrando o suprimento de sangue bom de fundo, enchimento arterial e não há retorno venoso ou obstrução, indicando um sistema de abastecimento de sangue nobre da retina. (B) a imagem de fundo do olho direito 1 hora após a cirurgia. Em comparação com a imagem pré-operatória do fundo, sem alterações significativas foram observadas no suprimento sanguíneo da retina, indicando que o sistema de abastecimento de sangue do globo ocular não foi afectado durante o processo de modelagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Fotografias do nervo óptico retrobulbar e a artéria oftálmica localizado na bainha meníngea, capturada através da abordagem cirúrgica. Depois de remover completamente o alvo comprimento do nervo óptico, artéria oftálmica (seta) concomitante com a meníngea da bainha do nervo óptico foi exposta e paralelamente ao nervo óptico. Escala de barras = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Diagrama esquemático das localizações de degeneração primária e secundária no nervo óptico. Incisão parcial do nervo óptico foi conseguido usando o instrumento auto-concebidos assistente cirúrgico (seta). Os axônios em sites diretamente danificados (local de corte dorsal do nervo óptico na seção transversal em cinza) sofrem degeneração primária, enquanto que aqueles em sites indiretamente danificados (áreas centrais e ventrais do nervo óptico na seção transversal em amarelo) sofrem degeneração secundária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Procedimento operacional
Existem alguns pontos dignos de observação no processo de construção do modelo. Na etapa 4.2, o movimento cirúrgico deve ser realizado com cuidado para evitar danificar a vasculatura acima do músculo subfascial. Especialmente, quando corta a fáscia subcutânea no canto do olho lateral exterior, fórceps de serra afiada deve ser usado para puxar para cima a fáscia subcutânea na superfície de fáscia verticalmente; a fáscia deve ser cortada com Vannas tesoura de mola para evitar danificar a veia orbital para o canto externo, que pode resultar em falha do modelo por sangramento excessivo. Passo 4.3 tem a vantagem de potencialmente prevenir sangramento quando removendo diretamente de vasos sanguíneos. Na separação orbitais músculos em passo 4.5, a razão para colheita fórceps de serra afiada mas não Vannas tesoura de mola é evitar o sangramento contínuo e hemorragia. Sem rodeios, os músculos são separados em ambos os lados na direção perpendicular da incisão na pele fáscia; Enquanto isso, os músculos profundos da órbita são esticados para fora e perifericamente. Este procedimento irá revelar mais profundas porções da cavidade orbital, proporcionando uma maior janela cirúrgica e permitindo o acesso irrestrito aos tecidos sobrepondo o nervo óptico. Nos procedimentos acima, se o sangramento ocorre, pressão deve ser aplicada usando estéril cirúrgica ou cotonetes. Menor sangramento para após alguns segundos por esse procedimento. O objetivo da etapa 4.6 é facilitar as operações de acompanhamento para remover facilmente alguns músculos gordos e separados do cone do músculo de órbita para expor o nervo óptico ao longo da direção do nervo óptico na profundidade orbital.
As partes mais críticas do atual protocolo são etapas 5.1-5.6. É importante para não danificar o sistema vascular ao redor da cabeça do nervo óptico. O nervo óptico deve ser seccionado parcialmente pelo menos 1.5-2.0 mm na parte de trás do olho, para evitar danos à artéria oftálmica que penetra o nervo dentro de 1 mm do olho e fornece sangue para a retina interna. A finalidade de cortar o reto lateral é conseguir a melhor exposição do nervo óptico como o reto lateral é largo e obviamente bloqueia a vista do nervo óptico. Entretanto, para evitar a remoção da artéria oftálmica que está associada com a bainha meníngea (Figura 5), é necessário separar, dissociar a dura-máter em torno do nervo óptico e examinar o padrão vascular da bainha meníngea, usando fórceps para girar suavemente a bainha. Além disso, uma área desprovida de vasos sanguíneos deve ser identificada, permitindo um corte longitudinal na bainha meníngea. Também é necessário manter uma pequena distância de trabalho na parte de trás do olho, para evitar a parte da dura-máter que está intimamente associada com a artéria oftálmica. A retina é normalmente transparente, e os vasos sanguíneos podem ser claramente demarcados. No caso de fornecimento de sangue da retina danificada, a retina é degenerada, levando a uma aparência de floculante branco leitoso. Câmara de vítreo do olho e a lente normalmente se tornará nublada, bem como, com tamanho de olho diminuiu ao longo do tempo. Neste estudo, imagens pré-operatórias e pós-operatório de fundo não confirmaram nenhum dano para o suprimento de sangue do fundo no modelo depois de aplicar as etapas acima.
Além disso, cuidado especial é necessário em diversas etapas deste modelo. Ao usar fórceps afiado-curvo-serrilhada ou outros instrumentos cirúrgicos para expor o nervo óptico, o cirurgião deve evitar força excessiva, pois pode danificar o nervo óptico, o globo ocular ou a artéria oftálmica, resultando em lesões primárias e isquemia da retina. Além disso, vasos sanguíneos que irrigam o olho deve não ser danificados, para evitar sangramento sustentado, que poderia conduzir à falha de modelagem. O SSAI usado neste experimento requer o uso de delicadas. Quando o nervo óptico é colocado dentro do sulco do instrumento, o nervo óptico e a superfície estriada precisam ser montado firmemente para garantir boa consistência e repetibilidade de cada modelo animal. Com a prática, o procedimento cirúrgico completo pode ser concluído dentro de 15-20 minutos por olho, após os entrada inicial de cortes foram feitos.
Wang et al. 19 publicou um modelo animal semelhante de transecção parcial nervo óptico estabelecida usando um amputator quantitativa do nervo óptico. Os procedimentos cirúrgicos inclui: 1) corte separados o canto exterior, suspensão e fixação do palpebral superior; 2) explorando o nervo óptico e cruza a porção superior do nervo óptico, usando o amputator; e 3) sutura a conjuntiva e a pele. Embora o procedimento cirúrgico foi relativamente simples, os seguintes problemas foram encontrados durante a operação. Embora incisão lateral canto poderia expor determinado espaço para a operação, houve uma inevitável necessidade de constantemente esticar o globo ocular para expor a bainha do nervo óptico retrobulbar, especialmente quando os cirurgiões desejavam para expor um mais retrobulbar bainha do nervo óptico para facilitar ainda mais o isolamento de bainha; a força de alongamento do globo ocular foi maior, que é susceptível de causar lesão direta da tração do globo ocular e nervo óptico. Nenhuma atenção especial para os vasos sanguíneos que podem ser cortados em conjunto com a bainha do nervo óptico, e danos aos vasos sanguíneos são susceptível de conduzir a criação de modelo falhado. Os principais procedimentos do modelo de lesões secundárias descritas neste documento são: um novo agente aproximar-se da parede orbital lateral do globo ocular para acessar diretamente o nervo óptico retrobulbar rodeado pelo cone muscular orbital, evitando lesão primária para o globo ocular e nervo óptico, ao puxar para baixo ou para o lado nasal lateral do globo ocular. Esta nova abordagem operacional aumenta o espaço de operação cirúrgica durante a modelagem e permite fácil isolamento da bainha meníngeo, que está intimamente associada com a artéria oftálmica, antes transecção parcial do nervo óptico. Transecção parcial nervo óptico foi realizada com um instrumento cirúrgico auto-concebidos, que é custo-eficaz e reutilizáveis, reduzindo o custo geral de modelagem. Estrutura orbital do rato é diferente de outros mamíferos, com a órbita mais próximo do canto do olho e sem estrutura óssea, mas coberto com músculos. A abordagem cirúrgica pode atingir a parte posterior do globo ocular sem a necessidade de destruir o osso orbital e periósteo. Através de rigorosa desinfecção pré-operatória e pós-operatória profilaxia antibiótica, infecção, inflamação e edema foram bastante reduzidos.
Auto-concebidos instrumento cirúrgico de assistente
O modelo do rato de transecção parcial nervo óptico foi criado usando o instrumento auto-concebidos assistente cirúrgico, cujas principais características são as seguintes. Pode ajudar na transecção quantitativa parcial do nervo óptico exposto à borda estriada, também garantindo a transecção consistência entre animais diferentes. Nós testamos e verific a repetibilidade de estabelecimento de modelo com SSAI. O máximo coeficiente de variação foi de 1,85%, com um valor médio 0,67% ±0. 44%. 20 estes resultados indicam que o SSAI poderia ser usado para estabelecer modelos de transecção parcial nervo óptico, com satisfatória reprodutibilidade e uniformity.
Largura a superfície estriada e o design do semicírculo da superfície interna do sulco podem ter um efeito mais fixo no nervo óptico e tornar a superfície estriada e nervo óptico anexar mais firmemente, também diminuindo erros experimentais e reações adversas. A borda estriada permite uma melhor proteção do nervo óptico no sulco durante a operação, que não irá danificar o nervo óptico no sulco, independentemente de nitidez do cortador. Outra vantagem da borda estriada é a prevenção de lesões de esmagamento durante a transecção do nervo óptico.
É apropriado para operar no espaço profundo e estreito. Embora a nova abordagem operativa foi expandida, o caminho continua a ser profundo, e o polo à mão e da articulação podem ser usados para colocar a cabeça estriada facilmente sob a bainha do nervo óptico para executar operações de acompanhamento. Quando o instrumento é usado para a operação, uma vasta gama de cortadores pode ser usada para transecção, por exemplo, uma ponta de agulha 26G. Até mesmo uma faca de safira sonda cirúrgica pode ser selecionada para evitar contusão e esmagar os ferimentos causados por uma tesoura. Sulco superfícies podem ser feitas em diferentes profundidades verticais para completar vários graus de corte do nervo óptico.
Comparado com o amputator de Wang et al . o SSAI tem uma estrutura mais simples. Além disso, a etapa de corte é mais conveniente usar o SSAI, com maior consistência e repetibilidade do modelo animal. Finalmente, a gama de ferramentas aplicáveis para o corte com o SSAI também é mais ampla. Em conclusão, SSAI, que faz incisões quantitativas e uniformes do nervo, pode servir como um instrumento eficaz para o estabelecimento de modelos do rato para avaliar a transecção do nervo óptico.
Características do modelo de transecção parcial nervo óptico rato
O modelo de transecção parcial nervo óptico é útil para avaliar a degeneração secundária no RGCs. O mérito potencial deste modelo é a capacidade de separar primário de degeneração secundária com precisão em situ, tanto no nervo óptico e retina. Os nervos ópticos centrais e ventrais foram mais suscetíveis à lesão secundária após a transecção parcial (aproximadamente 1/3 a 1/2) do nervo óptico dorsal (Figura 6). Na retina, a localização regional das lesões primárias e secundárias da RGCs deve basear-se a topografia do nervo óptico, correspondendo a RGCs da retina após a transecção parcial. Se a retina inteira do rato é dividida em peças (inferiores) ventrais e dorsal (superior), lesões primárias e secundárias estão presentes em ambas as partes. No entanto, com base na relação entre RGCs na retina e o axônio do nervo óptico, RGC morte na retina ventral deve ser principalmente atribuída a lesão secundária (Figura 3). 12 , 22 , 23 as vantagens de incluir este modelo: instrumento simples e fácil de operar com os procedimentos padrão; nenhum efeito sobre os vasos oftálmicos; boa reprodutibilidade e estabilidade. Esta técnica pode ser usada para transfect RGCs com esta abordagem operativa de economia de espaço, aplicando curtos interferentes RNAs (siRNAs), plasmídeos, e desafiar a vetores virais para o nervo óptico parcial; Além disso, os reagentes podem ser colocados no tronco para o tratamento seletivo ou rotulagem de RGCs parcial nervo óptico.
Lesões totais, primários e secundários de RGCs coexistiram após a transecção parcial nervo óptico neste modelo animal, com um limite claro na retina entre os tipos de duas lesões. Embora a Associação dos axônios do nervo óptico e RGC localização na retina precisa investigação adicional para uma distinção mais precisa, esta abordagem operativa de economia de espaço aumenta a gama de aplicação do modelo e permite que os pesquisadores explorar o mecanismos de lesão secundária no RGCs de uma maneira nova.
Disclosures
Todos os autores declaram que têm sem qualquer conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação ciência Natural Pequim (7152038), os fundos de pesquisa Fundamental para as universidades Central da Central South University (2016zzts162) e Science Foundation de Aier Eye Hospital grupo de pesquisa (Grant no. AF156D11). Finalmente, Fancheng Yan Obrigado Yiping Xu pelo inestimável apoio ao longo dos anos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
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