Summary
Вторичной дегенерации сетчатки ганглия клеток (РГК) обычно возникает в глаукомы. Это исследование описывает постановляющей части новаторский подход для частичного зрительного нерва перерезка. Использование этой экономии пространства оперативного подхода расширяет диапазон применения модели и позволяет исследовать вторичного повреждения механизмов в РГК в новый путь.
Abstract
Предыдущие исследования показали, что вторичной дегенерации сетчатки ганглия клеток (РГК) обычно возникает в глаукомы. Перерезка частичное зрительного нерва считается полезным и воспроизводимые модели. По сравнению с другими моделями повреждения зрительного нерва, обычно используется для оценки вторичной дегенерации, например полный зрительный нерв перерезка и зрительного нерва раздавить модели, модель частичной зрительного нерва перерезка превосходит как оно отличает первичной от вторичной дегенерации в situ. Таким образом он служит прекрасным инструментом для оценки вторичной дегенерации. Это исследование описывает Роман оперативного подхода перерезка частичной зрительного нерва, непосредственно обратившись к области ретробульбарная зрительного нерва через боковые стенки глазницы глазного яблока. Кроме того мы представляем новый дизайн, низкая стоимость хирургический инструмент для оказания помощи с перерезка. Как свидетельствует представитель результаты в разграничении границы областей первичных и вторичных повреждений, новый подход и инструмент обеспечивает высокую эффективность и стабильность модели, предоставляя достаточное пространство для хирургической операции. Это в свою очередь делает его легко отделить от зрительного нерва до перерезка менингеальные оболочкой и глазных сосудов. Дополнительным преимуществом является, что этот компактный постановляющей части подход улучшает способность следователей применять препараты, перевозчиков или селективного RGC Трейсеры пень частично пересекал зрительного нерва, позволяя изучение механизмов за вторичные травмы в РГК, новым способом.
Introduction
Вторичной дегенерации происходит обычно в центральной нервной системе (ЦНС) после травм и следующие острые и хронические нейродегенеративные заболевания. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 смерть нейронов и глиальных клеток как следствие раннего первичного патологического событий называется первичной дегенерации, в то время как вторичной дегенерации относится к гибели нейронов и глиальных клеток, которые являются не только частично или пострадавших от начальной повреждения. Считается также, что вторичной дегенерации РГК происходят в глаукомы. 6 Yoles и др. 7 подтвердил, что вторичные травмы РГК происходит в модель повреждения зрительного нерва. Они показали, что нейроны, аксоны которых не были ранены после острого повреждения выродится в конечном итоге из-за дегенеративных условий производства травмы, окружающих эти аксоны. Этот вторичной дегенерации влияет нейронов в прогрессивной моды, относящиеся к тяжести повреждения. До настоящего времени лежащие в основе RGC повреждения при глаукоме механизмы остаются неясными, особенно тех, которые касаются вторичные травмы, которая приводит к недостаточной клинического лечения. 8 , 9 , 10 таким образом, это необходимо для изучения основных механизмов вторичной дегенерации РГК в ходе развития глаукомы. 11 создание животных моделей вторичных повреждений, которые могут количественно оценить размер, распределения и механизм вторичной дегенерации РГК привлекает все большее внимание ученых, изучающих вторичные травмы РГК.
Чтобы прояснить этот вопрос, модель PONT крыса была учреждена Levkovitch-Вербин и др. 12 для оценки аксональное травмы индуцированной дегенерация и смерть РГК. Считается, что эта модель является хорошим инструментом для изучения механизмов вторичной дегенерации и выявления потенциальных агентов нейропротекторной. Инструмент, используемый для создания этой модели вторичных повреждений является Алмазный нож со шкалой к створу количественно, установив глубина осыпания через ручку dial, чтобы завершить количественных перерезка зрительного нерва. Хирургический путь подходов от височной или вверх конъюнктивы глазного яблока. Во время процесса постановляющей части сетчатки и зрительных нервов могут быть затронуты силы щипцы, который в свою очередь может привести к первичной травмы. Что еще более важно из-за ограниченного пространства подвергаются зрительного нерва, трудно отделить менингеальные платье до разреза. Таким образом можно повредить офтальмологический судов во время перерезка частичной зрительного нерва, что приводит к сетчатки ишемии и провал модели. Кроме того Алмазный нож является дорогостоящим, и каждое использование уменьшает резкость наконечник. Это в свою очередь может повлиять на глубину и силу моделирования.
Модель вторичной дегенерации РГК, описанные в данном исследовании был получен через нового оперативного подхода от боковой стенки глазницы глазного яблока. Этот роман оперативного подхода напрямую обращается к ретробульбарная зрительного нерва, окруженных орбитальной мышцы конуса, избегая первичной травмы глазного яблока и зрительного нерва, когда потянув вниз или в сторону носа боковой глазного яблока. Это также увеличивает пространство хирургической операции во время создания модели и позволяет менингеальные оболочки изоляции перед частично transecting зрительного нерва. Важно заметить, что случайного участия и травмы глазной сосудов может привести к провалу модели. Кроме того модель позволяет последующей оценки transfected клеток, препаратов и реагентов на пне частично пересекал зрительного нерва. Самостоятельно разработанные хирургический инструмент дешево и можно использовать несколько раз, тем самым снижая стоимость моделирования. Вторичные травмы модель РГК, установленных этим методом было показано иметь хорошую воспроизводимость и стабильности.
Protocol
процедуры с участием животных темы были одобрены институциональные животное уход и использовать Комитет (IACUC) столица медицинского университета. Все хирургические инструменты и решения были стерилизованы до операции, чтобы ограничить микробной инфекции.
Примечание: хирургический протокол включены пять частей, а именно анестезии, хирургический подход, оценке зрительного нерва, закрытие и восстановления. Чтобы помочь с частичной количественных перерезка зрительного нерва, был разработан новый, низкая стоимость хирургический инструмент. Все процедуры были проведены следующие этические правила и хирургической техники.
1. хирургическая техника
- проводить эксперименты с использованием метода асептических; протоколы для использования животных должно быть конкретным учреждением.
- Стерилизируй-отпусти инструменты и материалы (решения, испытываемого вещества, Трейсеры, иглы и т.д.) соприкасающихся живых тканей с целью предотвращения инфицирования и негативное воздействие на благосостояние животных, а также потенциального негативного воздействия на исследование .
2. Анестезия
- Anesthetize SD крыс с помощью системы ветеринарного изофлюрановая испарителем. Использование медицинского кислорода в размере 1 Л/мин для испарения газа изофлюрановая. Установите животного прилагаемый анестезии и запустить изофлюрановая на 4,5% концентрации до медленное дыхание и животных седации.
- Переключатель потока газа вложение, противогаз и поместите животное на операционном столе. Нижняя изофлюрановая концентрации до 2% и монитор анестезии. Крупные животные (> 300 g) может потребовать более высокую концентрацию изофлюрановая. Монитор анестезии во время операции, с изофлюрановая дозировке, соответствующим образом скорректированы. Постоянно оценить глубину и скорость дыхания и выполнять мыс щепотку оценки каждые 5 минут, чтобы обеспечить отсутствие глубокой боли.
- После завершения операции, выключите изофлюрановая и позволяют дыхание кислородом животное за несколько минут до удаления из таблицы операции. Поддерживать температуру тела, охватывающих животное с хирургической одеяло и/или с помощью регулируемых электроодеяло во время операции.
3. Самостоятельно разработан хирургического помощник инструмент (SSAI)
- использования SSAI сделаны из нержавеющей стали и в основном включает в себя ручные полюс (длина 100 мм; диаметр 9 мм) и рифленой головкой ( рис. 1). Рифленая поверхность рифленая головки полукруглые, вертикальная глубина, ширина и длина 200 мкм, мкм 500 и 1000 мкм, соответственно. Между двумя частями существует совместная секция длиной 50 мм. Желобчатых головы ' s края составляет 300 мкм.
Примечание: Рифленая поверхность позволяет стабилизации вентральной зрительного нерва для перерезка. Дорсальная зрительный нерв подвергается снаружи канавки при вентральной стороне зрительного нерва лежит внутри него; Тем временем подвергается рифленые края спинной зрительного нерва может перерезанных гори, когда Вертикальная резка выполняется. Вентральной зрительного нерва, заложен в пределах рифленая поверхность защищена желобчатых голова ' s край. - Достижения первичных травмы в РГК, соответствующий аксоны количественно пересекал зрительного нерва (спинной стороне), а вторичная травмы будет производиться в РГК, соответствующий аксоны untransected зрительного нерва (вентральной стороне) без прямого ущерба.
4. Хирургический подход
- место в правой части крысы вверх на операционном столе с головой, стоящих перед хирургом. Отрегулируйте правой орбиты в центре хирургического поля зрения. Затем очистите области разреза несколько раз вдоль бокового угла глазной щели для внешней акустической отверстие правой орбиты кожу, применяя 0,5% хлоргексидин в 75% этанола. Удаление меха между боковыми угла глазной щели внешней акустической отверстия с помощью ножниц Ирис.
- Сделать разрез с помощью ножниц Ирис вдоль бокового угла глазной щели внешней акустической отверстия с длиной от 0,5 до 1 см. Затем щепотка фасции и потяните вверх, чтобы создавать треугольную клин зубчатый пинцетом 0,12 мм. Вставьте нижнего лезвия ножниц весной беззаботными в области разреза и разрезали фасции в том же направлении сдвига.
- Разрез фасции с беззаботными пружинные ножницы и разоблачить орбитальных вен. Использование острые зубчатые щипцы для зажима стороны орбитальных вен и тупые открыть обе стороны разреза. Орбитальных вен в хирургической направлении поверхности орбитальной мышцы, который позиционируется для облегчения последующей операции и избежать операции связанные с кровотечение из орбитальных вен.
- Использование Ирис ножницы, чтобы вырезать право бокового угла глазной щели, друг от друга вдоль линии разреза выставить в поле зрения для тупых рассечение орбитальной мышцы во время полностью следовать наверх
- Продолжать зажим папке субфасциальная орбитальной мышцы и тупые отдельных вертикально в направлении разрез кожи и фасции. Отдельный вдоль стороны постепенно достичь орбиты глубины, до появления орбитальных жировой ткани.
- После воздействия орбитального жировой ткани, изменить направление крыса голову от стоящих перед хирургом вертикально на правой стороне хирурга. Тем временем Держите области постоянно влажный с помощью хирургического или ватные тампоны, содержащие стерильные PBS. Эта процедура обеспечивает четкое видение операционного поля, сохраняя в тканях, влажные и мягкие.
5. Доступ к зрительному нерву
- , отрезать орбитальных жировой ткани, охватывающих конуса орбитальной мышцы вокруг зрительного нерва в орбитальной полости. Это обеспечивает лучшее предоставление надлежащих хирургических подхода. Держите резекции жировой ткани, ограничиваясь избежать устойчивый кровотечение.
- Сокращение жировой ткани, подвергая боковые прямая. Закрепите боковые прямая наружу и затем вырезать ножницами беззаботными весной. Если жировой ткани остается под боковые прямая, потяните вверх жир, обволакивающие зрительного нерва с использованием 0.12 мм зубчатый щипцами и резать с ножницами весной беззаботными.
Примечание: На данный момент, ножны ткани вокруг оптического нерва должна быть видна. - Продолжить отделить ткани оболочкой вдоль направления зрительного нерва в орбитальной глубина, до общего воздействия зрительного нерва. Держите области чистой с помощью хирургического тампоны для чистой небольшое количество крови, которые возникают от удаления ткани.
Примечание: Теперь, зрительного нерва должна быть видна. - Для того, чтобы доступ к нему, удалите менингеальные оболочка, которая окружает нерв без повреждения глазной артерии. Осторожно поверните оболочка для изучения сосудистого рисунка дура с высоким увеличением под операционных микроскопов.
- Определить области лишена кровеносных сосудов и выполняют продольный разрез на Дура. 13 рип оболочка параллельно направлению зрительного нерва с 26G кончик иглы или выхватил Сапфир хирургические зонда тщательно, избегая повреждения сосудистую с боковыми разрезами.
Примечание: Только остатки, охватывающих нерва должна быть Арахноидальная membraNe, который очень тонкий и прозрачный.
- Определить области лишена кровеносных сосудов и выполняют продольный разрез на Дура. 13 рип оболочка параллельно направлению зрительного нерва с 26G кончик иглы или выхватил Сапфир хирургические зонда тщательно, избегая повреждения сосудистую с боковыми разрезами.
- Подобно Рип паутинной мембраны нежно с 26G кончик иглы или выхватил Сапфир хирургические зонда, параллельно направлению зрительного нерва, чтобы шаг 5.2. 13
- заложить зрительного нерва в инструмент groove мягко и осторожно, что приводит к спинной зрительного нерва, немного выше, чем рифленые края головы. В это время, разрез спинной зрительного нерва выше краю рифленая платформы головы с кончиком иглы 26G или выхватил Сапфир хирургических зонда для завершения частичного зрительного нерва перерезка.
6. Закрытие и восстановление
- Переместить инструмент немного глубже, к вертикальной направлении зрительного нерва освободить последнего. Затем осторожно удалите рифленая головка инструмента. Старайтесь не поцарапать глазные мышцы или другие ткани, чтобы избежать дополнительных повреждений. Пень перерезка частичной зрительного нерва может наблюдаться.
- Заменить боковые прямая, фасции и другим тканям глаза на их первоначальные позиции. Затем шов мышц и слои кожи орбиты в последовательности. Если кровотечение продолжается, аккуратно заполнить медицинскую ватным тампоном перед закрытием раны и поддерживать это за определенный период времени. Применять мазь с антибиотиком для предотвращения инфекции в рану.
- Поворот от изофлюрановая источника и позволяют животному дыхание кислородом в течение нескольких минут. В процессе реанимации крыса подготовить теплоизоляции с подогреваемым ковриком, или покрытия поверхности клетки с сухим обивка. Обложка животных с одеяла, чтобы обеспечить проходимость дыхательных путей крыс во время процесса восстановления.
- Дом животные индивидуально после операции. Администрировать послеоперационные анальгетиков согласно руководящими органами институционального ухода за животными. Тщательно контролировать животных после хирургии.
Representative Results
Для проверки успеха относительно создания вторичного повреждения модели с нового оперативного подхода, с использованием SSAI (рисунок 2A), РГК были retrogradely помечены сразу же после создания модели. Цель этой процедуры было РГК лейбл retrogradely путем впрыскивать нейронных трассирующими красителя (3% Флюорофор (например, Fluorogold) в стерильных фосфатный буфер) в четверохолмия (рис. 2B). Этот подход дает, воспроизводимые маркировки жизнеспособных РГК с небольшим изменением. 14 , 15 , 16 , 17 , 18 краска будет рассматриваться retrogradely, РГК в сетчатке и представляет маркер для живой РГК, с аксоны не перерезанных гори в правый глаз. Тем временем РГК соответствует частично пересекал зрительного нерва, которую аксоны в правый глаз не могут быть помечены с трассирующими краситель (рис. 2 c). Как управления глаз левый глаз без операции, РГК вдоль зрительного нерва сетчатки были все помечены Флюоресцентная краска золото в виде ретроградного от четверохолмия (Рисунок 2D).
Через семь дней после частичной зрительного нерва перерезка и ретроградным маркировки РГК, retinas были собирают, фиксированной, плоской и монтируется. Приклеенные этикетку РГК были образы под микроскопом флуоресцентные в определенных регионах сетчатки. Результаты флуоресцировани обозначенного РГК с или без частичного зрительного нерва перерезка показаны на рисунке 3. Только РГК в правой сетчатки, соответствующий untransected части оптического нерва были помечены флуоресцентные золото, и четкие границы РГК неподписанном и метками могут быть визуализированы (рис. 3A, 3B рисунок), демонстрируя частичная транзакция зрительного нерва. Как управления глаз, все РГК флуоресценции сетчатки показал левый глаз (рис. 3 c, рис. 3D).
Чтобы оценить ли сосудистую вокруг головы зрительного нерва и глазной артерии, которая поставляет кровь к entoretina были ранены и пострадавших во время операции, правый глаз глазного дна было imaged до и после операции. Изображения показали кровоснабжение и правый глаз (постановляющей части глаз) до 1 часа после операции. Крови в артериях был хорош. Было отмечено, не обструкция вены. Эти выводы указал, что существует никаких повреждений в системе снабжения кровью во время операции (Рисунок 4A, рис. 4B). Таким образом модель вторичной дегенерации РГК был успешно создан.
Рисунок 1 : Фотографии самостоятельно разработанные хирургического помощник инструмента, SSAI. (A) панорамный вид хирургического инструмента, с двух основных частей, включая ручные полюса и желобчатых головы. Между ними существует совместная секция длиной 50 мм. Ручные полюса-100 мм и диаметр ручные полюса является 9 мм. (B) A особенностью SSAI паза. Рифленая поверхность рифленая головы является полукруг, который позволяет заложить в него, стабилизированный для перерезка зрительного нерва. Рифленая поверхность является вертикальная глубина 200 мкм и шириной 500 мкм и длиной 1000 мкм. Ширина края желобчатых головы – 300 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Схема RGC маркировки на сетчатке после частичной перерезка правой зрительного нерва с собственной разработки хирургического помощник инструмент (SSAI) и retrogradely маркировки четверохолмия с Флюорофор. (A) хирургические вид перерезка частичное право зрительного нерва у крыс с помощью собственной разработки хирургического помощник инструмента (SSAI). (B) после моделирования, РГК были помечены retrogradely путем впрыскивать нейронных трассирующими красителя (желтый цвет, 3% Флюорофор в стерильных фосфатный буфер) в четверохолмия в головном мозге. Так как аксоны РГК проживают в четверохолмия, краситель трассировщик поглощается РГК retrogradely и представляет маркер для живых клеток. Поперечного сечения на рисунке представляет собой сечение зрительного нерва. ОД, оперированный глаз; ОС, управления глаз без операции. (C)с Флюорофор были помечены только РГК, соответствующий untransected части зрительного нерва. Синий цвет представляет неразделенные вентральной зрительных нервов и соответствующий РГК на сетчатке; красный отражает частично пересекал спинной зрительных нервов и соответствующий РГК на сетчатке. (D) сетчатки РГК левого глаза (контроль глаз) без хирургической процедуры были все обозначены красителя. Спинной и брюшной зрительных нервов были названы также краситель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Целом Сетчатка эпифлуоресцентного микроскопии Флюорофор помечены РГК через 7 дней после создания частичной зрительного нерва перерезка модель и ретроградной маркировки четверохолмия. Также представлены соответствующие схемы Fluorogold, окрашенных областей RGC на сетчатке. (A) и (C) представляют собой схематических представлений РГК в сетчатке права (оперативный) и слева (управления) глаза после маркировки с Флюорофор, соответственно. Желтый цвет обозначает область с флуоресцентные золотой краской. Сетчатка состоит из спинной, брюшной и центральной части. (B) и (D) представляют собой весь сетчатки эпифлуоресцентного микроскопии, полученные под микроскопом флуоресценции; желтый цвет представляет область РГК, помечены Флюорофор. В хирургической глаз (правый глаз) показано в Bнеподписанном региона представляет область РГК, соответствующий зрительного нерва, которая является частично перерезанных гори, главным образом на спинной стороне сетчатки. Область, Флюоресцентная краска золото — это область РГК, соответствующий зрительного нерва, которая не перерезанных гори и сосредоточены главным образом в Центральной и брюшной стороны сетчатки. БоонДары между районами РГК неподписанном и помечены ясно. Основная дегенерация RGC органов будет ограничиваться спинной сетчатки, и все потери RGC органов Центральной и брюшной сетчатки может объясняться вторичной дегенерации. Микрофотография (D) весь сетчатки левого глаза после маркировки РГК с Флюорофор. РГК левой контроля глаз без хирургической процедуры были полностью запятнана Флюорофор. Масштаб баров = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Предоперационное и послеоперационное изображений глазного дна правого глаза полученные глазного дна камеры. (A) глазного дна перед правый глаз хирургии в крыс, изображением хорошее кровоснабжение глазного дна, артериальной наполнения и не венозный возврат или обструкции, указывая системы снабжения хороший сетчатки крови. (B) изображение глазного дна правого глаза 1 час после операции. Никаких существенных изменений по сравнению с предоперационной изображение глазного дна, наблюдались в сетчатки кровоснабжение, указав, что системе подачи крови глазного яблока не пострадал в процессе моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Фотографии ретробульбарная зрительного нерва и глазной артерии расположен на менингеальные оболочкой, захватили через хирургической методикой. После полностью удаления целевой Длина зрительного нерва, глазной артерии (стрелки) сочетанной с менингеальные оболочкой зрительного нерва был подвергаются и параллельно зрительному нерву. Масштаб баров = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Схема первичной и вторичной дегенерации мест в зрительном нерве. Частичные разрез зрительного нерва была достигнута с помощью собственной разработки хирургического помощник инструмент (стрелки). Аксоны в непосредственно поврежденных участков (дорсального разруба сайт зрительного нерва в поперечном сечении в серый) проходят первичный дегенерации, а те в косвенно поврежденных участков (Центральный и брюшной области зрительного нерва в поперечном сечении в желтый) подвергаются вторичной дегенерации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Оперативные процедуры
Есть некоторые моменты достойное уведомления в процессе построения модели. В шаге 4.2 хирургические движения должны выполняться тщательно, чтобы избежать повреждения сосудистую выше субфасциальная мышцы. Особенно при резке подкожной фасции в наружной бокового угла глазной щели, острые зубчатые щипцами должны использоваться для тянуть вверх подкожной фасции на поверхности фасции вертикально; фасции следует сократить с беззаботными весной ножницы, чтобы избежать повреждения орбитальных вен в внешнего угла глазной щели, которая может привести к недостаточности модель чрезмерное кровотечение. Шаг 4.3 имеет преимущество потенциально предотвращения кровотечения при удалении непосредственно из кровеносных сосудов. В разделяющей орбитальной мышцы в шаг 4.5, причина для комплектации острые зубчатые пинцет, но не беззаботными весной ножницы, чтобы избежать непрерывной кровотечения и кровоизлияния. Тупо мышцы отделяются с обеих сторон в перпендикулярном направлении фасции разрез кожи; Тем временем глубоких мышц орбиты растягивается наружу и периферии. Эта процедура позволит выявить глубокие части орбитальной полости, обеспечивая окно больших хирургических и беспрепятственного доступа к ткани, наложение зрительного нерва. В вышеуказанных процедур, если кровотечение происходит, давление должно применяться с использованием стерильных хирургического или ватные тампоны. Незначительные кровотечение остановится через несколько секунд после этой процедуры. Шаг 4.6 предназначен для облегчения последующей операции легко удалить некоторые жира и отдельных мышц в конус мышц орбиты подвергать зрительного нерва вдоль направления зрительного нерва в орбитальной глубины.
Наиболее важные части текущего протокола являются шаги 5.1-5.6. Важно, чтобы не повредить сосудистую вокруг головы зрительного нерва. Зрительного нерва должны быть частично перерезанных гори по крайней мере 1.5-2.0 мм от задней части глаза, чтобы избежать повреждения глазной артерии, которая проникает нерва в пределах 1 мм глаза и поставляет кровь к внутренней сетчатки. Резка боковые прямая предназначен для достижения лучшего воздействия зрительного нерва, как боковые прямая широк и явно блокирует мнение зрительного нерва. Между тем чтобы избежать удаления глазной артерии, который связан с менингеальные оболочки (рис. 5), это необходимо отделить и разъединять Дура вокруг зрительного нерва и изучения сосудистого рисунка менингеальные оплетке, с помощью щипцами осторожно поверните оболочка. Кроме того должны быть определены области лишена кровеносных сосудов, позволяя продольной резки в оболочке менингеальные. Это также необходимо сохранить небольшое рабочее расстояние от задней части глаза, чтобы избежать часть Дура, которая тесно связана с глазной артерии. Сетчатки обычно прозрачен, и кровеносных сосудов может быть четко демаркированы. В случае повреждения сетчатки кровоснабжение сетчатки является выродились, ведущих к молочно белый хлопьевидный внешний вид. Стекловидного глаз и объектив будет, как правило, становятся ясно также, снижение глаз размер с течением времени. В этом исследовании предоперационное и послеоперационное изображений глазного дна подтвердил без ущерба для глазного дна кровоснабжение в модели после применения выше шаги.
Кроме того в несколько шагов этой модели требуется особый уход. При использовании Шарп изогнутые зубчатые щипцами или других хирургических инструментов подвергать зрительного нерва, хирург следует избегать чрезмерной силы, как это может привести к повреждению зрительного нерва, глазного яблока или глазной артерии, приводит к первичной травмы и сетчатки ишемии. Кроме того кровеносных сосудов вокруг глаз не должны быть повреждены, чтобы избежать постоянной кровотечение, которое может привести к провалу моделирования. SSAI, используемые в этом эксперименте требует деликатного использования. Когда зрительный нерв располагается внутри инструмент groove, зрительного нерва и рифленой поверхности должны быть плотно установлены для обеспечения хорошей консистенции и повторяемость каждой модели на животных. С практикой полный хирургическая процедура может быть выполнена в течение 15-20 минут в глаз, после первоначального въезда порезы были сделаны.
Wang et al. 19 опубликовал аналогичные животных модель частичной зрительного нерва перерезка с помощью количественных amputator зрительного нерва. Хирургических процедур включает в себя: 1) резка отдельно от внешнего угла глазной щели, приостановления и фиксации глазной Улучшенный; 2) изучения зрительного нерва и transecting Улучшенный часть зрительного нерва с использованием amputator; и 3) ушивание конъюнктивы и кожи. Хотя хирургическая процедура была относительно простой, во время операции были обнаружены следующие проблемы. Хотя бокового угла глазной щели разрез может предоставить определенное пространство для работы, была неизбежной необходимость постоянно растянуть глазного яблока, чтобы разоблачить ретробульбарная оболочка зрительного нерва, особенно когда хирурги подвергать более ретробульбарная зрительного нерва оболочка для облегчения дальнейшей изоляции оболочки; силу для растяжения глазного яблока было больше, что может вызвать травмы прямой тяги глазного яблока и зрительного нерва. Не особое внимание было уделено кровеносных сосудов, которые могут быть сокращены вместе с оболочкой зрительного нерва, и повреждение кровеносных сосудов может привести к неудачной модель создания. Основные процедуры вторичного повреждения модели, описанные в этом документе являются: новый оперативный подход от боковой стенки глазницы глазного яблока прямого доступа ретробульбарная зрительного нерва, окруженный орбитальной мышцы конуса, избегая первичный ущерб глазного яблока и зрительного нерва, когда потянув вниз или в сторону носа боковой глазного яблока. Этот новый подход оперативного увеличивает пространство хирургической операции во время моделирования и позволяет легко изоляции менингеальные оболочки, который тесно связан с глазной артерии, до частичной перерезка зрительного нерва. Перерезка частичное зрительного нерва была выполнена с собственной разработки хирургический инструмент, который является экономически эффективным и многоразовые, уменьшая общую стоимость моделирования. Крыса орбитальной структуры отличаются от других млекопитающих, с орбиты ближе к угла глазной щели и не костные структуры, но покрыты мышц. Хирургический подход может достичь задней части глазного яблока без необходимости уничтожать орбитальной кости и надкостницы. Через строгий дезинфекции предоперационное и послеоперационное Антибиотикопрофилактика были значительно сокращены инфекции, воспаления и отеки.
Самостоятельно разработанные помощник Инструмент хирургический
Крысы модель частичной зрительного нерва перерезка был создан, используя инструмент самостоятельно разработанные хирургические помощником, чьи основные функции заключаются в следующем. Она может помочь в частичной количественных перерезка зрительного нерва, подвергаются к краю рифленая, также обеспечение согласованности перерезка среди различных животных. Мы протестировали и проверены повторяемость создание модели с SSAI. Максимальный коэффициент вариации был 1,85%, а среднее значение 0,67% ±0. 44%. 20 эти результаты показывают, что SSAI могут использоваться для установления частичное зрительного нерва перерезка модели, с удовлетворительным воспроизводимость и ООНiformity.
Рифленая поверхность ширина и дизайн полукруг паз внутренней поверхности могут иметь более фиксированными на зрительный нерв и сделать рифленая поверхность и зрительного нерва придают более плотно, также снижается экспериментальной ошибки и побочных реакций. Рифленые края позволяет лучшую защиту зрительного нерва в паз во время операции, которая не приведет к повреждению зрительного нерва в паз, независимо от того, резак резкость. Еще одним преимуществом рифленые края является раздавить травматизма во время перерезка зрительного нерва.
Это подходит для эксплуатации в глубоких и узких пространства. Хотя новый подход постановляющей части была расширена, путь остается глубоким, и совместная секция и ручные полюс может использоваться для место желобчатых голову легко под оболочкой зрительного нерва для выполнения последующих операций. Когда инструмент используется для операции, широкий спектр фрезы могут использоваться для перерезка, например кончик иглы 26 G. Даже нож Сапфир хирургические зонд можно выбрать для избежания ушиба и раздавить травм, вызванных ножницы. Паз поверхности может производиться в различных вертикальных глубин для выполнения различной степени зрительного нерва резки.
По сравнению с amputator Wang et al. SSAI имеет простой структуры. Кроме того резки шаг является более удобным, с использованием SSAI, с улучшенной консистентности и повторяемость животной модели. Наконец ряд инструментов для резки с SSAI также шире. В заключение SSAI, которая делает количественные и единообразных разрезов нерва, может служить эффективным инструментом для создания крыса модели для оценки перерезка зрительного нерва.
Характеристики модели перерезка крысы частично зрительного нерва
Перерезка модель частичной зрительного нерва является полезным оценить вторичной дегенерации в РГК. Потенциальные преимущества этой модели является возможность отделить основной от вторичной дегенерации точно на месте, как в сетчатки и зрительного нерва. Центральный и брюшной зрительных нервов были более восприимчивы к вторичные травмы после частичной перерезка (около 1/3 до 1/2) спинной зрительного нерва (рис. 6). В сетчатке региональные расположение первичных и вторичных повреждений РГК должны основываться на топографии зрительного нерва, соответствующий сетчатки РГК после частичной перерезка. Если весь сетчатки крыс разделен спинной (superior) и брюшной (нижней) части, вторичных и первичных повреждений присутствуют в обеих частях. Однако основываясь на отношения между РГК на сетчатки и зрительного нерва Аксон, RGC смерти в вентральной сетчатки должны главным образом объяснить вторичных повреждений (рис. 3). 12 , 22 , 23 преимущества этой модели включают: простой и простой в эксплуатации инструмент с стандартными процедурами; не влияет на офтальмологические судов; хорошая воспроизводимость и стабильности. Этот метод может использоваться для transfect РГК от этой экономии пространства оперативного подхода путем применения короткие интерферирующие РНК (малые интерферирующие РНК), плазмиды, а пень вирусных векторов для частичного зрительного нерва; Кроме того реагентов может располагаться на пне частичного зрительного нерва для селективного обращения или маркировки РГК.
Общее, начальное и среднее травм РГК сосуществовали после частичной зрительного нерва перерезка в этой модели на животных, с четкой границей в сетчатке между типами две травмы. Хотя Ассоциация аксоны зрительного нерва и Королевское расположение на сетчатке необходимо дальнейшее расследование для более точного разграничения, этот компактный постановляющей части подход расширяет диапазон применения модели и позволяет исследователям изучить механизмы вторичного повреждения в РГК в новый путь.
Disclosures
Все авторы заявляют, что у них нет любого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Фондом Пекин естественных наук (7152038), фундаментальные исследования средств для университетов Центральной Центральной Южного университета (2016zzts162) и науки исследовательский фонд Aier глаз больницы группы (Грант № AF156D11). Наконец Янь Fancheng спасибо ЙиПинг Сюй за бесценную поддержку, с годами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Aneathesia Ventilator System | MIDMARK | Matrx VMR | |
| Isoflurane | RWD Life Science Co. | R510-22 | |
| Surgical Microscope | Leica AG, Heerbrugg, Switzerland | M620 F20 | |
| Tobramycin Eye ointment | Alcon | H20110312 | |
| Fluorogold | Biotium | 80014 | |
| Iris scissors | 66vision Co. | 54026 | |
| Vannas spring scissor | 66vision Co. | 54137B | |
| Sharp-serrated forceps/0.12mm toothed forceps | 66vision Co. | 53329A | |
| Sharp-curved forceps | 66vision Co. | 53324A | |
| Sapphire surgical probe | 66vision Co. | 50205TA | |
| 26G needle tip | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co. | 3151474 | |
| 10 μl Hamilton Syringe | Hamilton Co. | 80030 | |
| 5-0 non-absorbable suture | Johnson & Johnson International Co. | W580 | |
| Chlorhexidine | Sigma-Aldrich | 282227 | |
| Stereotaxie apparatus | RWD Life Science Co. | 68026 | |
| Retinal Imaging System | OptoProbe Ltd. | OPTO-RIS | |
| RetCamII wide field imaging system | Clarity Medical Systems,Inc. | RetCamII | |
| Fluorescence microscope | Leica Microsystems Inc. | DM6000 |
References
- Stoica, B. A., Faden, A. I. Cell death mechanisms and modulation in traumatic brain injury. Neurotherapeutics. 7 (1), 3-12 (2010).
- Hausmann, O. N. Post-traumatic inflammation following spinal cord injury. Spinal Cord. 41 (7), 369-378 (2003).
- Oyinbo, C. A. Secondary injury mechanisms in traumatic spinal cord injury: a nugget of this multiply cascade. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (2), 281-299 (2011).
- Guimaraes, J. S., et al. Mechanisms of secondary degeneration in the central nervous system during acute neural disorders and white matter damage. Rev Neurol. 48 (6), 304-310 (2009).
- Stewart, S. S., Appel, S. H. Trophic factors in neurologic disease. Annu Rev Med. 39, 193-201 (1988).
- Brubaker, R. F. Delayed functional loss in glaucoma. LII Edward Jackson Memorial Lecture. Am J Ophthalmol. 121 (5), 473-483 (1996).
- Yoles, E., Schwartz, M. Degeneration of spared axons following partial white matter lesion: implications for optic nerve neuropathies. Exp Neurol. 153 (1), 1-7 (1998).
- Nickells, R. W. From ocular hypertension to ganglion cell death: a theoretical sequence of events leading to glaucoma. Can J Ophthalmol. 42 (2), 278-287 (2007).
- Doucette, L. P., Rasnitsyn, A., Seifi, M., Walter, M. A. The interactions of genes, age, and environment in glaucoma pathogenesis. Surv Ophthalmol. 60 (4), 310-326 (2015).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Rokicki, W., Dorecka, M., Romaniuk, W. Retinal ganglion cells death in glaucoma--mechanism and potential treatment. Part II. Klin Oczna. 109 (7-9), 353-355 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. A model to study differences between primary and secondary degeneration of retinal ganglion cells in rats by partial optic nerve transection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (8), 3388-3393 (2003).
- Magharious, M. M., D'Onofrio, P. M., Koeberle, P. D. Optic nerve transection: a model of adult neuron apoptosis in the central nervous system. J Vis Exp. (51), (2011).
- Yoles, E., et al. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (13), 3586-3591 (1992).
- Fisher, J., et al. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21 (1), 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (13), 4169-4174 (2000).
- Li, Y., et al. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. J Clin Invest. 118 (3), 913-923 (2008).
- Tang, Z., et al. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. J Exp Med. 207 (4), 867-880 (2010).
- Wang, X., Li, Y., He, Y., Liang, H. S., Liu, E. Z. A novel animal model of partial optic nerve transection established using an optic nerve quantitative amputator. PLoS One. 7 (9), e44360 (2012).
- Yan, F. C., Li, S. N., Liu, K. G., Lu, Q. J., Wang, N. L. The establishment of a rat partial optic nerve transection model and assessment of its reproducibility. Ophthalmology in China. 22 (1), 34-37 (2013).
- Fitzgerald, M., et al. Secondary degeneration of the optic nerve following partial transection: the benefits of lomerizine. Exp Neurol. 216 (1), 219-230 (2009).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. J Neurotrauma. 27 (11), 2107-2119 (2010).
- Li, H., et al. Lycium barbarum (wolfberry) reduces secondary degeneration and oxidative stress, and inhibits JNK pathway in retina after partial optic nerve transection. PLoS One. 8 (7), 68881 (2013).
