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Biochemistry

Personnalisés de microéchantillons de peptides pour la détection des allo-anticorps HLA dans la Transplantation d’organes

doi: 10.3791/56278 Published: September 6, 2017

Summary

Incompatibilités dans les séquences antigen (HLA) leucocytaire humain entre donneur d’organe et de paires de destinataire sont la principale cause de rejet humoral dans la transplantation d’organes. Nous présentons ici l’utilisation de tableaux d’antigène personnalisés qui sont basées sur les séquences de HLA de donateurs individuels pour sonder des allo-anticorps d’anti-donneurs HLA chez des receveurs d’organes.

Abstract

Transplantation d’organes, la fonction et la longévité de la prothèse critique s’appuient sur le succès de contrôler la réactivité immunologique de rejet contre les antigènes des leucocytes humains (HLA). Histocompatibilité lignes directrices sont fondées sur des tests de laboratoire de l’immunité anti-HLA, qui présente en tant que la préexistant ou de novo généré anticorps HLA qui constituent un obstacle majeur de la transplantation. Les tests actuels sont construits sur une plate-forme unique-antigène perles (SAB) en utilisant un ensemble fixe d’antigènes HLA ~ 100 présélectionnés pour sonder les sérums de transplantation. Cependant, chez les humains, il existe une variété beaucoup plus grande de types HLA, avec aucun deux individus autres que les jumeaux identiques qui peuvent partager la même combinaison de séquences HLA. Alors que les technologies de pointe pour le typage HLA et le séquençage direct peuvent capturer précisément toute inadéquation dans la séquence d’ADN entre un donneur et HLA du receveur, le dosage de la SAB, en raison de sa variété limitée dans la représentation de la séquence, est incapable de détecter avec précision allo-anticorps spécifiquement contre le donneur HLA des incompatibilités. Nous avons cherché à développer une méthode complémentaire à l’aide d’une technologie différente pour détecter et caractériser les anticorps HLA anti-bailleurs de fonds sur une base personnalisée. L’outil de dépistage est un tableau personnalisé de peptide de séquences de donneur HLA-dérivées pour sonder post-transplantation sérums du receveur orgue pour évaluer le risque de rejet humoral. Sur un tableau unique pour une paire de donateur-bénéficiaire, jusqu'à 600 peptides uniques sont prises en fonction sur les séquences de protéines HLA du donneur, chaque peptide transportant au moins un résidu ne correspondent pas dans une séquence d’acides aminés 15. Dans nos expériences pilotes pour comparer les modèles d’antigène pour pré et post-transplantation sérums sur ces tableaux, nous avons pu détecter des signaux anti-HLA avec la résolution que nous a également permis d’identifier les épitopes immunitaires impliqués. Ces personnalisés tableaux antigène faire une détection à haute résolution de des épitopes spécifiques donneur HLA dans la transplantation d’organes.

Introduction

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Thérapie de remplacement d’orgue qui est systématiquement menée à travers le monde a sauvé des millions de vies. Transplantation d’organes solides se produit dans environ 100 patients par million de personnes aux Etats-Unis chaque année, alors qu’un plus grand nombre encore sont sur listes d’attente pour recevoir des organes du donneur en raison d’une grave pénurie d’approvisionnement (selon les informations fournies par l’organe Approvisionnement et Transplantation Network - OPTN/UNOS : optn.transplant.hrsa.gov). Transplantation d’organe est fortement réglementée afin de réduire le gaspillage de l’orgue et de sauver des vies, mais les outils scientifiques utilisés pour informer de ces règlements sont limitées en termes d’efficacité. Par exemple, la communauté scientifique reconnaît pleinement les États fortement polymorphes de molécules HLA et précis tests génétiques d’ADN à l’aide de typage de haute résolution et axée sur la séquence tapant (SBT) ont été développés au cours des dernières années1, 2. Toutefois, les méthodes d’essai alloanticorps n’ont pas encore été en mesure de produire la grande variété des séquences individuelles de HLA comme sondes de l’antigène. Le test standard utilise de nos jours un panneau invariable de ~ 100 antigènes alléliques qui sont composent des variations courantes du HLA, A, B, C, DQ, DP et DR séquences dans les populations humaines3,4,5,6. Fréquemment, les séquences HLA du donneur réelles ne sont pas inclus dans le panneau de test, forçant transplantation médecins et chirurgiens d’inférer la réactivité de donateurs spécifique basée sur partagé similarités du donneur séquences réelles et correspondant de « normes » dans la test jeu7,8. Par conséquent, il est parfois difficile de faire une estimation fiable du risque de rejet issu des anticorps test résultats9,10,11,12. Donc, nouveau personnellement personnalisables tests pour allo-anticorps sont nécessaires d’urgence13,14.

Les gènes HLA encodent les récepteurs de (MHC) complexes majeur d’histocompatibilité qui ont une fonction essentielle dans la réponse immunitaire6. Les gènes HLA sont connus pour être les plus polymorphes gènes du génome humain6. En raison des progrès rapides dans l’ADN, séquençage des stratégies pour les gènes HLA, nouveaux variants alléliques (ou simplement appelés allèles) sont découverts à un taux explosif15,16. En mars 2017, 16 755 validés allèles avaient été déposés à la base de données IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html), de laquelle 12 351 étaient de classe I et 4 404 ont été des groupes de classe II. En contraste, seulement un peu plus de 100 différents allèles sont représentés dans l’analyse standard single-antigène perles (SAB), qui est régulièrement utilisée pour détecter des allo-anticorps dans la transplantation d’organes. La méthode SAB est construite sur une plateforme Luminex cytométrie. Puisque le test utilise un ensemble invariable des antigènes, en dehors des variabilités de lots mineures dans la production, le test de l’antisérum peut être robuste normalisé selon les individus et les laboratoires5. Toutefois, ce test est incapable de capturer tous les allo-anticorps mis au point spécifiquement contre les allèles de donateurs, en particulier lorsque les séquences de donateurs sont absents de la SAB. Bien que la fabrication sur commande d’antigènes des donateurs basés sur des séquences vrais sont souhaitables, il reste des défis techniques à rationaliser la production nécessaire et au contrôle.

Nous avons récemment décrit une méthode alternative dans une étude de faisabilité de la transplantation rénale sujets17. La méthode utilisée antigènes peptidiques dans un format de tableau pour sonder pré et post transplantation sérums de sujets individuels. Chaque tableau a été personnalisé généré à l’aide de la tache synthèse méthode18,19,20,21,22,23 qui produit des antigènes peptidiques, chaque 15 acides aminés dans la longueur, entièrement fondé sur les allèles HLA du donneur organe respectives de A, B, C, DQA1, DQB1 et DRB1. Synthèse SPOT est exploitée sur une membrane de cellulose à l’aide de la norme Fmoc-chimie22 et peut produire des centaines de peptides personnalisés en parallèle avec un système robotique entièrement automatisé19,21. Le tableau de la membrane résiste à plusieurs cycles de décapage et reprobing cycles. Dans notre étude rétrospective17, nous avons détecté des changements dans l’antigène avec les antisérums de transplantation stockée recueillis dans une série chronologique (c.-à-d., avant et après la transplantation). Dans les présentes, nous décrivons le protocole technique pour le flux de travail y compris la baie conception, fabrication, analyse de palpage et résultat d’antisérum. La méthode est conçue pour la détection des allo-anticorps contre des épitopes linéaires spécifiques sur des molécules HLA transplantation des donateurs.

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Protocol

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Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par la Northwestern University Institutional Review Board (IRB protocol #: STU00104680). Un flux de travail global du protocole est illustrée à la Figure 1.

1. analyse bioinformatique du donneur et receveur HLA séquences

  1. récupérer les séquences de base de données IMGT/HLA 15.
    1. Rapports typage HLA obtenir du don d’organe et l’accès à son destinataire.
      NOTE : S’assurer que les procédures appropriées pour protéger les dossiers médicaux confidentiels sont utilisés. En règle générale, un agrément de Institutional Review Board (IRB) de protocole de l’étude ou la vérification expérimentale est prescrit conformément aux directives de la CISR institutionnels. Si les rapports HLA étaient basées sur la PCR taper (de la résolution soit haute ou basse) ou axée sur le séquençage de dactylographie (SBT), passez directement à l’étape 1.1.3. Si les séquences ont été obtenues de séquençage génomique/HLA, et si elles sont complètes, utilisez ces séquences directement. Occasionnellement, quand taper seulement incomplète ou de résultats de séquençage sont disponibles, suivez l’étape supplémentaire 1.1.2. pour assigner le " manquant " allèles via l’outil web indiqué au point 1.1.2.
    2. Ouvrir les combinaisons d’allèles ambigu suite web lier - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html et une recherche en utilisant le “ outil de recherche de combinaisons alléliques ambigu ” fonction pour récupérer les allèles hypothétiques. Ensuite, passer au point 1.1.3. pour entrer le nom d’allèle.
    3. Ouvrir le formulaire de requête d’allèle IMGT/HLA à ce qui suit le lien web - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html et sous réserve d’entrée ’ noms allèle s (chacun individuellement, comme illustré à la Figure 2) dans le “ recherche pour ” boîte. Cliquez sur le “ recherche maintenant des allèles ” bouton. Noms d’allèle HLA devraient utiliser des systèmes de dénomination standards (c'est-à-dire, A *, A * 01, A * 01:01:01:01 et toute désignation antérieure comme A * 01010101).
    4. Trouver le nom d’allèle correspondant affiché sur l’écran. Cliquez sur le bouton de l’allèle.
    5. Copie le " séquence de la protéine " et le coller dans un document texte sous une ligne d’en-tête de " > nom d’allèle ". En effet, le document texte est dans un format FASTA (FAST-All) du nom de l’allèle et séquence.
  2. Effectuer géniques plusieurs alignements d’allèles donneur et receveur/patient.
    1. Un gène (c'est-à-dire, DQB1 * 03:01:01:01) à la fois, copiez et collez tous quatre allèles des donateurs et patient séquences FASTA (deux du donneur) et deux du patient dans un document texte combiné. À ce stade, il est important de désigner différentiellement noms allèle donneur de noms de patients allèle (Options comprennent l’utilisation différentielle des supérieur vs inférieur cas ; ou créer une extension de préfixe ou de suffixe distinctive pour chaque nom d’allèle pour marquer séparément les donateurs vs. allèles patients). L’ordre d’entrée des séquences n’est pas important parce que suite à l’alignement de l’ordre est mélangé selon des degrés de similitude entre n’importe quelle paire de séquences de.
    2. Copiez et collez les séquences FASTA format (comme on le voit à la Figure 3) par le haut dans le “ entrez vos séquences d’entrée ” boîte sur le site Web du Cluster Omega : http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/.
    3. Cliquez sur " soumettre votre travail " en utilisant des paramètres standards de paramètres : comme " PROTEINŔ et " Clustal w / numéros ". Effectuer un alignement en cliquant sur " envoi ". Un alignement de quatre séquences est affiché sur l’écran ( Figure 4).
  3. Marquer propres donateurs non-correspondances.
    Remarque : Il est spécialement à noter que les séquences alléliques donnés ici étaient fondées sur les résultats du typage HLA, ne pas le séquencement. Par conséquent, il y a un risque que la variation des séquences pertinentes le couple donneur-receveur particulier peut manquer. Ce problème potentiel est atténué comme plus et plusieurs centres de transplantation adoptent le typage de haute résolution précise et directement de séquençage de l’ADN.
    1. Copier et coller le texte de l’alignement dans un document texte et créez un nouveau document. Si le format du fichier aligné est perturbé, Difficulté le format en changeant la taille et le style de police : toujours utiliser " Courier New " police en caractères de petite taille pour s’adapter les lignes. Enregistrez le document après que nous solutionnons les problèmes de formatage.
    2. Inspecter manuellement les séquences alignées afin d’identifier tous les résidus dépareillées qui appartiennent uniquement au donateur. Marquez-les de ces résidus de bailleurs de fonds spécifiques à l’aide d’une couleur de police distinctif.
    3. Souligner toutes les lettres chez le donneur ' s séquences qui s’étendent de 14 résidus les deux haut - et en aval des non-correspondances donateurs spécifique marquées (calculée comme 15 acides aminés peptides moins 1 résidu de l’incompatibilité).
  4. Dérivent des séquences peptidiques 15-mer dans une série qui se chevauchent.
    NOTE : La raison du choix des peptides 15-mer était fondée sur la connaissance générale des épitopes typiques étant de 4 à 9 acides aminés. Par conséquent, lorsque nous avons appliqué un " fenêtre mobile " procédure avec une taille d’étape de 4 acides aminés ( Figure 1), notre sélection d’une longueur de 15 acides aminés laissé un 15-4 = 11 acides aminés chevauchement entre les peptides voisins dans une série. En théorie, ce chevauchement de 11 acides aminés est suffisant pour couvrir tous les épitopes immunitaires jusqu'à 9 acides aminés de longueur, afin que ne soit aucun épitope par inadvertance " split " en deux avec seulement les séquences partielles sur le tableau.
    1. Utiliser les séquences soulignés comme modèles pour dériver dans l’ordre court 15 séquences d’acides aminés dans une série qui se chevauchent par 4 résidus entre deux suites adjacentes dans la série.
    2. Copiez et collez ces 15 séquences d’acides aminés dans un tableur ( Figure 5) dans un format de colonne accompagnent de colonnes de notation qui incluent les noms correspondants des allèles donneur. Une colonne supplémentaire à inclure des postes de résidus aa peut être utile.
  5. Répéter les étapes de 1.1.3. 1.3. pour chaque allèle HLA (c'est-à-dire, A, B, C, DQA1, DQB1, DRB1 et DP) du donneur et la paire bénéficiaire pour dériver les 15 aa courtes séquences du donneur.
  6. Copie et coller toutes les colonnes dans une feuille de calcul maître pour créer une colonne longue continue de toutes les séquences de aa 15 de tous les allèles du donneur. Notez le nombre total de lignes (pour les séquences peptidiques) dans le document.

2. Conception de la Production et la mise en page de tableau personnalisé

professions
  1. générer une feuille de calcul des séquences peptidiques avec l’allèle correspondant. Le tableau a 20 lignes et des 30 colonnes et peut contenir jusqu'à 20 x 30 = 600 points pour les peptides. Selon le nombre total de peptides enregistré dans l’étape 1.5 provenant d’un donneur particulier et selon notre expérience passée avec les deux exemples que nous avions essayé à Liu et al.. 17, le tableau comptant 600 peut contenir toutes les séquences produits de cas de transplantation séparé ~ 2.
    1. Plan rationnellement le plus efficace moyen pour s’adapter à l’ensemble des peptides dans le format 600-place du tableau.
    2. Si plus d’un sujet peut s’insérer dans un tableau entier, insérer des lignes vides après le premier donateur ' séquences de s pour correspondre au nombre total de lignes qui peut être divisé par 30 (le nombre de places dans une rangée sur le tableau).
    3. Immédiatement après la dernière ligne vide pour le premier ensemble de séquences, coller dans la colonne entière du contenu de la séquence de la deuxième affaire de transplantation.
    4. Répéter ces étapes jusqu'à ce que le tableau est rempli, et aucuns plus de cas ne peuvent être ajoutés sans dépasser les 600 points. Si toute lignes vides restent à remplir en bas, " aller " la ligne vide pour être positionné entre les ensembles de deux donateurs. Ce large espace laissé entre les cas rend la découpe de la membrane à l’issue de la synthèse plus facile - suite étape 3.2. au-dessous de.
  2. Programmer les séquences peptidiques dans le cadre de la mise en page de tableau. Le programme du synthétiseur SPOT prend le format texte des séquences (séquence un peptide d’une ligne), qui peut être obtenu directement en enregistrant la feuille de calcul résultant de l’étape 2.1.4 comme un document de texte simple (sans l’ou les colonnes supplémentaire pour les noms de l’allèle, aa postes, etc.).
  3. Run peptide automatisé Tableau synthèse via le synthétiseur SPOT. Toute l’opération de la synthèse est détaillée dans Kudithipudi Al 21. Notez que le Fmoc synthèse de deux matrices prend environ 4-5 jours.

3. Sonde et Reprobe des antisérums d’une série temporelle d’une personne greffée.

Remarque : le tableau de membrane 600-spot a les dimensions ~ 7 cm x 13 cm. Après la synthèse, les baies peuvent être stockés à température ambiante comme membranes secs pendant au moins deux ans quand l’abri de la lumière directe. Évitez de plier excessive de la membrane pour préserver sa longévité pour un usage répété.

  1. Réhydrater le tableau de la membrane avec de l’éthanol et de visualiser les taches de peptide colorées au Ponceau S. Tableau
    1. réhydrater la membrane transportant les peptides issue d’une procédure par étapes optimisée en Li et al. 24.
      1. immerger la membrane tableau dans 20 mL d’éthanol à 100 %.
      2. Ajouter 20 mL d’eau pour diluer la solution d’éthanol à 50 % et incuber à température ambiante pendant 15 min. distillée
      3. Changer la solution de l’immersion à 40 mL d’eau de 100 %, trois fois et incuber 15 minutes chaque fois.
      4. Lavage dans un tampon de travail approprié, par exemple, 20 mL d’un mélange TBST (Tris salin avec 0,1 %), trois fois pendant 5 min chaque.
    2. Ponceau S coloration du tableau pour visualiser les peptides synthétiques
      1. Ajouter 20 mL de solution de Ponceau S préalable formulée directement au tableau hydraté et incuber pendant environ 30 s avec agitation.
      2. D’i ' eau distillée en continu sur la membrane sur la tache de fond couleur Ponceau S. Au cours du processus, les taches de peptide de couleur rouge peuvent devenir visibles.
      3. Séparer les parties du tableau pour chaque donneur en coupant soigneusement entre les sections du tableau pour les cas individuels. Marquer l’orientation de chaque baie.
  2. Tableau de pré bloc. Lait écrémé
    1. bloc la membrane dans 20 mL de 5 % dissoute dans un mélange TBST tampon. Cette solution à base de lait se tachera plus loin hors de couleur Ponceau S. Remplacer le tampon de lait plusieurs fois afin d’obtenir les images les plus manifestes de peptide.
    2. à des fins de tenue des registres, prendre une photo de l’image de Ponceau S du tableau à l’aide d’une caméra à l’épaule (par exemple à la Figure 6).
    3. Continuer le blocage de la membrane dans le lait écrémé de 5 % à 4 ° C durant la nuit ou à température ambiante pendant 2 h avec bascule.
  3. Tableau incuber avec greffe antisérum.
    Remarque : Il doit être noté qu’un phénomène appelé prozone ou l’effet crochet pouvant résulter de l’interférence dépendante du complément dans l’analyse des anticorps sériques. Pour contourner ce problème, une étape de prétraitement de sérum en option peut être envisagée avec l’EDTA ou chaleur inactivation des échantillons de sérum.
    1. Retirer un tampon bloquant et laver la membrane avec 20 mL d’un mélange TBST trois fois le lendemain pendant 5 minutes chaque fois.
    2. Ajouter 20 µL de sérum brut du bénéficiaire à 20 mL de 2,5 % du lait dans un tampon TBST et incuber avec la membrane pendant 2-3 h à température ambiante. Notez que dans cette première série de sonder, il est recommandé que le dernier sérum post-transplantation (ou sérum probablement plus sensibilisée) dans les séries chronologiques sert tout d’abord. Ceci est basé sur l’hypothèse que les spécimens plus tôt dans la série, en particulier de points dans le temps de pré transplantation, ont moins variété d’allo-anticorps qui tendent à se développer au fil du temps. De cette façon, toute possibilité d’interférence du signal de " Report " entre les cycles de palpage peut être clairement distinguée de la réactivité des alloanticorps véritablement développés en raison de réponses immunitaires contre le greffon.
  4. Laver le tableau à l’aide de 20 mL d’un mélange TBST et incubation avec l’anticorps secondaire.
    1. Laver la membrane trois fois pendant 10 minutes chaque fois.
    2. Incuber avec anticorps secondaire chèvre anti-homme IgG-HRP (peroxydase de raifort) à dilution de 1/10 000 en tampon TBST additionné de lait 1 % pour un autre 2 h.
  5. Lavage et développer le blot.
    1. Laver la membrane trois fois avec un mélange TBST pendant 10 minutes chaque fois.
    2. Perform amélioré par chimiluminescence (ECL) à l’aide de 5 mL de solution de luminol fraîchement mélangé avec 5 mL de solution de peroxyde pour développer la membrane (pendant 1 min).
    3. ECL visualiser les signaux à l’aide d’un imageur approprié (c.-à-d., ChemiDoc Imaging Systems ou Azure C600).
  6. Analyser et quantifier le blot.
    1. Enregistrer les images développées ( Figure 7, image du bas) et effectuer la quantification d’intensité spot.

4. Comparer la réactivité de l’antisérum à travers une série de cliniques.

  1. Le tableau de bande.
    1. à ce stade, maintenir la membrane humide en permanence.
    2. Enlever la membrane en incubant avec 20 mL de tampon de décapage commercial à 37 ° C pendant 20 min et laver ensuite la membrane avec un mélange TBST trois fois pendant 10 min chaque. Répétez ensuite le blocage (étape 4.2) et poussé (étape 4.3) étapes à l’aide d’un sérum différent du patient pris à un moment différent.
  2. Bloc dépouillé membrane.
    Remarque : Après le décapage, la membrane peut être réutilisée pour une nouvelle série de sondes d’un sérum différent chez le même patient dans une série chronologique.
    1. Bloquent la membrane à l’aide de tampons de lait 5 % comme avant (Voir l’étape 3.2).
  3. Reprobe un antisérum différent de la même série chronologique (répétez les étapes de 3,3 à 3,6 ; exemple dans la Figure 7, image du dessus).
    Remarque : Le tableau dépouillé peut ensuite servir à reprobe un autre échantillon de sérum. Étant donné que les peptides sont conjugués par liaison covalente à la matrice de prise en charge de la membrane, nous avons montré que le tableau peut être réutilisé pour jusqu'à 20 séances d’effeuillage et sondage cycles sans perdre ses perfoupé.
  4. Stockage à long terme des baies de.
    1. Magasin la membrane dans un tampon TBS additionné de 0,02 % d’azide de sodium w/w comme agent de conservation. Utiliser un sac plastique scellé pour le stockage à long terme. À 4 ° C, sous la protection de la lumière directe, la membrane humide peut être conservée pendant au moins 2 ans.

5. Acquisition de données et d’analyse

  1. annoter manuellement des peptides de positif pour l’antigène.
    1. Localiser les spots montrant les signaux positifs anticorps et déterminer chacune de leurs positions de grille.
    2. Mettre en évidence les lignes correspondantes dans la feuille de calcul maître pour les peptides positives.
  2. Récupérer les séquences peptidiques énumérés dans la feuille de calcul maître ( Figure 7, liste du bas). Selon le principe de conception décrit à l’étape 1.4.1., taches séries voisins partagent beaucoup de chevauchement des séquences (15-4 = 11), donc épitopes réactives peuvent être partagés par les peptides d’une série consécutive.
    1. Mettre en évidence tous les points positifs qui se produisent dans la succession.
  3. Déterminer la longueur minimale épitope pour chaque peptide dans une série.
    1. Mettre en évidence toutes les séquences d’épitope partagé potentiellement basés sur le chevauchement des segments de peptides réactives.
  4. Modèle structurellement antigène épitopes.
    1. Obtenir des structures cristallines de prototype HLA de la Protein Data Bank à ce qui suit le lien web : http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.
    2. Afficher le prototype structure de HLA dans Pymol (téléchargement de www.pymol.org).
    3. Carte " ou modèle découvert épitopes des donateurs aux structures 3D des molécules HLA prototype en mettant en évidence les séquences peptidiques réactive ( Figure 8). Cliquez sur " écran ", puis " fond ", puis sélectionnez " blanc ". Pour enregistrer l’image, allez à " fichiers " et " enregistrer l’Image sous " et sélectionnez le format de fichier " png ".
  5. Rapport résultats et assigner des épitopes réactives pour les allèles correspondants.
  6. Comparer tableau résultats aux résultats single-antigène perles (SAB), si elles sont disponibles.
    Remarque : Le test SAB utilisant des antigènes alléliques unique mesure réactivité des anticorps vers un panneau fixe de protéines HLA. Les peptides qui montrent la réactivité des anticorps appartiennent à certains allèles HLA permettant, si également inclus dans le panneau SAB, une comparaison directe entre le tableau et les résultats de la SAB. Notre précédente étude 17 ont montré un haut niveau de corrélation entre les résultats, ce qui suggère que les épitopes de peptide contribuent de manière significative à la réactivité globale du SAB En outre, les résultats du tableau révèlent également des acides aminés-niveaux de spécificité.
    1. Obtenir SAB résulte d’un laboratoire HLA qui fournit des informations sur l’opportunité et les allèles de donateurs sont réactives au post transplantation sérum du patient. Résultats de l’étape 5.5. basé sur le tableau analyse fournissent également des informations sur les allèles correspondants de donneur positifs pour la réactivité des alloanticorps.
    2. Comparer SAB et tableau des résultats.

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Representative Results

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Dans l’étude originale en utilisant le tableau17de la méthode de dépistage, nous avons inscrit un total de 5 sujets de greffe de rein. Nous avons obtenu le HLA typage des résultats de notre cohorte et de leurs bailleurs de fonds respectifs. Leurs antécédents médicaux et les titres d’anticorps allélique de CCS essais étaient également à notre disposition. Dans notre étude pilote de ces 5 patients, nous avons mis au point deux méthodes différentes : un tableau standard composé d’un panneau fixe des peptides et des tableaux personnalisés qui ont été personnalisés réalisés pour chaque paire de donneur et receveur. Alors que la première méthode a permis de valider techniquement les performances de la plate-forme de tableau à atteindre des niveaux élevés de spécificité dans les greffes individuels, le protocole personnalisé pour cette dernière méthode est décrite dans cet article et la vidéo destiné pour un bilan complet d’anticorps spécifiques au donateur (DSA), qui souvent sont corrélés avec greffon pauvres résultats5,25,26.

Les tableaux personnalisés ont été appliqués à deux des cinq cas17, et pour illustrer le flux de travail global de la méthode, nous nous concentrons ici sur un de ces deux patients (à savoir PTN #4). La technologie clé pour la fabrication de tableau personnalisé peptide implique le synthétiseur SPOT. C’est un système robotique entièrement automatisé qui fait des peptides utilisant la synthèse Fmoc directement sur une matrice cellulaire spécialement dérivée sur une membrane (Figure 1). Nous avons exploité la souplesse du synthétiseur pour assembler des ensembles de peptides dérivés de séquences HLA des donneurs d’organes individuels. Afin d’avoir une couverture suffisante pour éviter une situation lorsqu’un épitope continu est en « split » et perd la réactivité des anticorps, nous avons suivi une conception « marche » de peptides séries d’avoir 15-4 = 11 résidus de chevauchement entre les peptides juste à côté, donc que la série est toujours suffisante pour couvrir la durée habituelle d’épitopes anticorps estimée à 4-9 aa de longueur (Figure 1).

Les séquences HLA modèle ont été téléchargées directement à partir de la base de données de référentiel maintenue à EMBL-EBI (l’Institut européen de bioinformatique). À titre d’exemple, le donneur de PTN #4 de HLA-DQB1 * 03:01:01:01 allèle a cherché (illustration de la page Web dans la Figure 2). Parallèlement, nous avons téléchargé séparément des séquences pour l’allèle HLA-DQB1 deuxième du donneur de * 02 : 01:01, ainsi que ceux de PTN #4 lui-même, HLA-DQB1 * 04:02 et * 05:01. Alignement de séquences multiples a été ensuite effectuée en utilisant les fonctions de web Clustal Omega (Figure 3). Le fichier résultant de l’alignement a été obtenu (Figure 4), de qui tous les résidus d’acides aminés ne correspondent pas ont été identifiés (résidus du donneur sont mises en évidence). Ensuite, nous avons marqué des séquences de modèle (soulignés) du donateur qui étaient suffisamment longs pour couvrir tous ses résidus ne correspondent pas. Basé sur ces séquences de modèle et en suivant un dessin ou modèle « marche », tel que décrit ci-dessus, trois séries de peptides chaque 15 aa de longueur ont été calculées pour HLA-DQB1. Ce processus a été répété pour le reste des allèles du donneur HLA-A, B, C, DQA1 et DRB1 (DRA1 et DP ont été exclus en raison de l’indisponibilité du dossier clinique pertinente) en comparaison avec les allèles correspondants de son destinataire. À la fin, un total de 202 peptides ont été engagés pour faire le tableau (séquences peptidiques dans une feuille de calcul à la Figure 5 et une illustration du tableau de la Figure 6) conçu pour sonder sérum post-transplantation de PTN #4 et avons comparé les résultats avec ceux obtenus par un sondage subséquent de son sérum pré transplantation (Figure 7). Hors les 202 peptides, un total de 10 signaux d’anticorps ont montré associée à l’échantillon post-transplantation de quels résidus donateurs spécifique (incompatibilité par le bénéficiaire) E87, I306, W243 et K197 de HLA-B * 52:01, B * 52:01, - C * 03:04 et - DQA1 * 05:01 semble être impliquée dans l’incitation à la réactivité des anticorps (résidus dénotés en lettres rouges dans la Figure 7).

En outre, l’un des principaux avantages de la méthode array contre le critère traditionnel de la SAB est que les informations de l’épitope peuvent être facilement obtenues, comme illustré à la Figure 7. Nous avons comparé les épitopes réactif anticorps HLA-DQA1 et - DQB1 depuis les cinq patients (à partir de résultats tableau distinct du Liu et al. 17) en les faisant tous modélisés pour une structure en cristal Co de heterodimer DQA1 et DQB1 (Figure 8). Fait encourageant, un segment important de la structure connue sous le brin de β1 est un « hotspot » qui était beaucoup plus susceptibles (3/5 des patients en 2,3,5) ciblé par allo-anticorps parmi les sujets transplantés dans la cohorte de cas 5.

Figure 1
Figure 1 . L’économie générale de la méthode array antigène HLA-basé pour la détection des allo-anticorps HLA du anti-donneurs receveurs d’organes. (Adapté et modifié de Liu et al. 17) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Site de référentiel de données
Pour extraire des séquences HLA, visitez le site Web suivant : http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html
S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Plusieurs protéines séquences d’alignement des donateurs vs destinataires allèles HLA-DQB1 à l’aide d’outil web Clustal Omega.
Copier et coller des séquences de DQB1 de patient #4(PTN#4) * 0201 et 03:01 et du DQB1 donneur * 04:02 et 05:01 au format FASTA dans http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (à titre d’illustration, DQB1 * 05:01 de PTN #4 et DQB1 * 03:01 du donneur sont affichés dans la zone de saisie) . Sélectionnez l’option « Clustal w / numéros » dans « Etape 2 » pour le format de sortie et exécutez l’alignement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Comparaison dedonateurs vs HLA DQB1 patient/destinataire et la sélection de séquences du modèle pour la synthèse des peptides.
Les séquences du donneur sont en gras, avec donneur spécifique non-correspondances dans police rouge et également mis en évidence avec les boîtes noires. Séquences de modèle (soulignés) pour dériver des peptides contenant ces résidus de bailleurs de fonds propres. (Ce chiffre a été adapté et modifié par rapport à al Liuet. 17) s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Un exemple illustratif de la feuille de calcul maître dans une feuille de calcul des peptides de donneur HLA.
Position de peptide sur le tableau est indiquée par la ligne vs colonne coordonnées. Séquences peptidiques sont utilisés pour programmer la synthèse utilisant le synthétiseur robotique de SPOT. Résidus de donateurs spécifique (incompatibilités des allèles correspondants du destinataire) sont indiquées en caractères gras et soulignés. Les positions de début et de fin du peptide correspondant aux séquences pleine longueur HLA-DQB1 sont également indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 . Image d’une section du tableau coloré avec Ponceau S
Notez la disparité dans l’intensité des couleurs en raison de la différence de composition en acides aminés chez les peptides, tandis que des concentrations de peptide spot toutes les régions sont les mêmes. (L’image est un exemple illustratif, pas celle de cette étude réelle.) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 . Spécifiques donneur HLA-A, B, C, DQ, DR étude de tableau d’épitopes dépareillées dans PTN #4.
Peptides séries provenaient de séquences du donneur pour les résidus ne correspondent pas (un exemple de DQB1 dans la Figure 4). Le tableau a été utilisé pour sonder le sérum post-transplantation (tache inférieure : post-TX) et par la suite le sérum avant transplantation (tache supérieure : pre-TX) chez le même patient. Les quatre séries de fortes taches de sonder post-greffe sont marquées par des lignes rouges (dans la tache inférieure), alors que deux points de moyenne intensité qui ont été associés à seulement prétransplantatoire sérum sont marquées par des lignes bleues (dans la tache supérieure). Le tableau du bas montre les séquences peptidiques correspondantes et leur réactivité au sérum post-transplantation. Bailleurs de fonds propres (dépareillées) résidus E87, I306, W243 et K197 de leurs allèles respectifs sont en lettres rouges et peptides montrant la réactivité des anticorps forte sont des polices "BOLD". Ce chiffre a été adapté et modifié par rapport à Liu et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 . Emplacements structurelles des épitopes HLA-DQ.
Structure cristalline de co du HLA-DQ8 a été utilisé comme modèle. La structure se composait d’un DQA1 et un sous-unités DQB1 avec un peptide antigène (A). Structures secondaires des protéines des hélices-α et β-brins sont indiquées dans le graphique (B). Peptides DQA1 et DQB1 qui réagissent avec l’une des cinq sérum ont été localisés sur la structure cristalline de co (en A et en B: ombrées en bleu). Trois brins β, β1, β6 et β12 (bleu foncé en B), chacune représentée par plusieurs peptides (petits traits rouges correspondant aux positions aa linéaires des DQA1), ont réagi avec des échantillons de plusieurs patients (résultats originaux en Liu et al. 17). tous les six DQB1 peptides (en gras) réactives aux anticorps chez les patients #2, #3, #5 sont trouvent au segment « hotspot » β1 ( b: pointé par la flèche rouge). Ce chiffre est une adaptation de Liu et al. 17. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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La conception du tableau SPOT décrit ici est pour une étude expérimentale de la spécificité des alloanticorps dans la transplantation contre les antigènes HLA du donneur de l’organe. Contrairement à l’essai de SAB existante, largement utilisé en clinique, la méthode array et antigène a un avantage majeur dans sa conception flexible pouvant accueillir les séquences HLA vrais du donateur individuel. La nouvelle plateforme exploite le potentiel de la technologie de séquençage ADN essor rapide qui sera bientôt en mesure de produire des lectures précises de séquence allélique HLA sans ambiguïté16,27 et le potentiel des bases de données désignés pour le référentiel HLA séquences15 dans la population mondiale. Notre protocole de dépistage tableau actuel a été développé basé sur le succès de plusieurs études pilotes de sérums de transplantation. Soulignons ici que, à ce stade, nos tableaux de prototype sont construits uniquement pour la recherche, pas pour les applications de diagnostic dans la pratique clinique.

Une autre distinction notable entre SAB et notre gamme d’antigène, c’est que ce dernier a une résolution plus élevée pour distinguer les possibles épitopes d’antigène dans les 15 segments aa des séquences HLA, qui pourraient fournir des informations précieuses sur alloantigenicity18 . Cependant, contrairement à Sam qui présente des antigènes de protéines entières pour adapter leurs structures plissées, le tableau de l’antigène intègre seulement petits peptides, qui exclut les informations sur pliage conformationnelle. Par conséquent, les baies ne peut pas détecter des anticorps qui ne reconnaissent des épitopes conformationnels, dont certains croient constituent la majorité de tous les épitopes fonctionnelles pertinentes au anticorps médiée par rejet28,29. Pourtant, dans d’autres contextes, des actions contre les épitopes linéaires, tels que ceux en petits peptides, anticorps sont exploitées dans les réponses de l’antigène viral et au vaccin design30,31. Il faut aussi noter que, dans le nombre limité d’échantillons de patients testés, les performances de sensibilité de détection de notre tableau dépassaient celui des CCS et a permis la détection d’anticorps spécifiques au donneur tôt17 au cours de la progression clinique de rejet humoral. Cela est dû à la forte concentration molaire des peptides antigène locales sur le tableau par rapport à SAB Cette fonctionnalité a été particulièrement utile dans les cas quand SAB ne détecté aucune réactivité alors que des preuves cliniques et pathologiques de rejet humoral était évident, comme nous l’avons montré précédemment17. Toutefois, il est important de souligner que ce test personnalisé est plus de temps que le test standard de la SAB. Le tableau tuberculination obtenir l’orgue séquences HLA du donneur et du receveur (proposé) avant de commencer à concevoir des peptides de l’antigène. Puis, il faut plusieurs jours pour produire le tableau et un autre 7-8 heures pour obtenir des résultats anticorps. Par conséquent, la longue procédure n’est pas adaptée pour la greffe de donneur décédé, à moins que le but principal de l’essai d’anticorps est pour déterminer l’apparition d’anticorps spécifiques au donneur TRANSPLATATION, plutôt que pour l’évaluation pré-transplantatoire des anticorps existants.

La méthode array a eu une amélioration majeure de l’essai SAB existant dans la détection de l’antigène épitopes. En outre, nous avons fait une tentative de mapper des épitopes réactives chez cinq patients de transplantation à une structure de template de HLA-DQ, dans lequel nous avons remarqué au moins un épitope éminent « hotspot » dans son brin de β1 qui sont survenus dans trois sur les cinq patients17. Curieusement, les brins de β1 de HLA-DQA1 et - DQB1 sont situés au niveau de la rainure de la concave d’antigène-présentation (Figure 8), un endroit connu pour être antigénique dans le contexte de la greffe rejet32. Par conséquent, nous prévoyons que l’exploration future de notre méthode de tableau personnalisé de l’antigène dans les études de cohortes de transplantation étendu donneront des indications précieuses sur les hotspots antigéniques dans des molécules HLA. Un catalogue de ces points chauds identifiés, lorsqu’examiné conjointement avec ultra-précises typage du séquençage ADN des gènes HLA entre donateurs potentiels et les bénéficiaires, aidera finalement pré-transplantatoire décisions par le biais de programmes de décalage acceptable 33, destiné à mieux éviter certaines incompatibilités à proximité de hotspots catalogués.

En résumé, notre original d’étude17 dans l’exploration de la conception personnalisée d’un tableau d’antigène pour la détection des allo-anticorps anti-HLA spécifique a été le premier de son genre. De l’étude portaient sur la faisabilité de conception du tableau et mise en œuvre, qui a servi de prototype pour la technologie future potentielle. Notre étude pilote non seulement généré des résultats provenant d’échantillons cliniques encourageants, mais nous a aussi permis d’estimer le coût global et la vitesse de l’essai. Le coût de production d’un tableau personnalisé dans notre laboratoire actuel est inférieur à 1 000 USD, qui est un coût unique, étant donné que le tableau peut ensuite être utilisé dans le temps jusqu'à 20 tours de sondage cycles sans perte de performance. Il est possible que des tests supplémentaires du protocole tableau auprès d’une cohorte plus large des sujets de la transplantation vont simplifier davantage la méthode qui pourrait un jour être utilisée en pratique clinique.

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Disclosures

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs Shawn Li et Li Xing de Western University au Canada pour leur aimable collaboration avec SPOT array production. Nous sommes reconnaissants aux membres du personnel, au cœur d’histocompatibilité et à la complète Transplant Center de l’Université Northwestern de fournir des services de l’échantillon. Ce travail a été en partie soutenu par le Conseil d’administration auxiliaire de Northwestern Memorial Hospital et par un fonds de démarrage Faculté fournies par la Northwestern University à J.J..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peptide array INTAVIS Bioanalytical Instruments
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Ponceau S solution Sigma-Aldrich P7170
Non-fat milk Bio Rad Laboratories 1706404
TBST Santa Cruz Biotechnology 10711454001
Goat anti-human IgG–HRP  ThermoFisher Scientific A18811
Clarity Western ECL Substrate Bio Rad Laboratories 1705061
Restore Western Blot Stripping Buffer Thermo Scientifics 21059
ChemiDoc gel imaging system Bio Rad Laboratories 1708265 

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Personnalisés de microéchantillons de peptides pour la détection des allo-anticorps HLA dans la Transplantation d’organes
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Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).More

Liu, P., Souma, T., Wei, A. Z. S., Xie, X., Luo, X., Jin, J. Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation. J. Vis. Exp. (127), e56278, doi:10.3791/56278 (2017).

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