Summary
Denne teknik beskriver en effektiv screeningsproces for at vurdere bakterier-specifikke optiske billeddannelse agenter inden for ex vivo menneskelige lungevæv af fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi til hurtig identifikation af lille molekyle kemiske sonde-kandidater med oversætbare potentiale.
Abstract
Forbedre hastigheden og nøjagtigheden af bakteriel opdagelse er vigtig for tålmodige stratificeringsniveau og til at sikre en hensigtsmæssig anvendelse af antimikrobielle stoffer. At nå dette mål, udviklingen af diagnostiske teknikker til at genkende bakteriel tilstedeværelse i realtid på punkt af pleje er nødvendig. Optisk tænkelig nemlig direkte identifikation af bakterier i værten er en attraktiv tilgang. Flere forsøg på kemiske sonde design og valideringen er blevet undersøgt, men ingen er endnu blevet korrekt oversat til klinikken. Her beskriver vi en metode for ex vivo validering af bakterier-specifikke sonder til identifikation af bakterier i den distale lunge, afbildet af fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi (FCFM). Vores model anvendes ex vivo menneskelige lungevæv og en klinisk godkendt Konfokal laser endomicroscopy (CLE) platform til skærmen roman bakterier-specifikke imaging forbindelser, nøje efterligne imaging betingelser forventes at blive mødt med patienter. Derfor giver screening forbindelser af denne teknik tillid af potentiel klinisk sporbarhed.
Introduction
Denne teknik beskriver en hurtig screeningsproces for at vurdere bakterier-specifikke optiske billeddannelse agenter inden for ex vivo menneskelige lungevæv af CLE ved hjælp af FCFM til hurtig identificering af forbindelser med potentielle kliniske anvendelighed til at visualisere bakterier i distale lunge in situ.
Der er et presserende globale krav til at rationere antimikrobiel ordination i en tid med stigende antimikrobiel resistens1. Med henblik herpå søgt udviklingen af diagnostiske metoder som act at identificere bakteriel infektion med høj specificitet, sensitivitet, og i realtid er meget2. Aktuelle teknikker til at bekræfte en diagnose af lungebetændelse i kritisk syg patienter, såsom dem i intensivafdelinger (intensivafsnit), afhængige ofte fortolke ikke-specifikke kliniske eller radiologiske funktioner sammen med bakteriekulturen teknikker fra indsugning væsker/væv, hvilket kan tage op til 3 dage til at producere resultater. Derudover bakteriekulturen fra væske indpodet i den distale lunge og hentet er udsat for forurening fra mere proksimale airways3 og er ofte kultur negativ på grund af ledsagende antimikrobiel behandling eller dårlig stikprøver. Derudover er molekylære teknikker såsom polymerase kæde reaktion alt for følsomme, når de anvendes på indsugning væsker, risikere overbehandling af patienter. Nye diagnostiske tilgang er Molekylær optiske billeddannelse, gør i situ Molekylær Patologi af væv en mulighed; udvikling og validering af optiske billeddannelse forbindelser er dog påkrævet. Ikke desto mindre direkte visualisering af bakterier via activatable optisk sonder er potentielt en meget kraftfuld metode til at tillade undersøgelse af tilstedeværelsen og udviklingen af lungebetændelse i patienten, og vigtigere, kunne bruges til at studere vært-patogen interaktioner i svar på terapier i real-time in situ.
CLE er en etableret opsøgende procedure i flere sygdomme4, herunder inden for gastroenterologi5, onkologi6,7, og forhører airways og alveolær sække8, 9. det gør det punkt af pleje strukturel billeddannelse af sygt væv ved hjælp af en fiber imaging bundle, der passerer gennem den arbejdende kanal af en klinisk endoskop og formularer direkte kontakt med væv overfladen til afbildning af Konfokal mikroskopi. Én begrænsning, der er tilbage er imidlertid behovet for generiske kontrastmidler. Derfor kunne brugen af sygdom specifikke sonder, såsom specifikke bakterielle stoffer, langt udvide nytten af denne modalitet ved direkte visualisere bakterier på mistanke om infektionsstedet. Optisk konsulenten tilbyde mange fordele i forhold til andre teknikker ved at aktivere real-time, høj opløsning imaging med diagnostiske potentiale. Derudover tilbyde optisk sonder udsigten til multiplexing til spørgekriterierne flere mål, alle nået til en relativt lav pris. En række af optiske agenter er under udvikling til et sådant formål, men ingen endnu er gennemført med succes inden for klinik10. Vi har syntetiseret et bibliotek med lille molekyle kemiske sonder med specificitet mod bakterier og udviklet en hurtig, effektiv pipeline til evaluering af sonde funktion til at påvise bakteriel lungebetændelse i situ11.
For at identificere egnede sonde kandidater, havde følgende forudsætninger skal opfyldes før forhør af sonde på ex vivo menneskelige lungevæv af FCFM: i) vandig opløselighed, ii) specificitet og selektivitet for hurtigt mærkning klinisk relevante bakterier, iii) et højt signal / støj-forhold, og iv) resistens over for nedbrydning i lunge-miljøet. Sidstnævnte blev vurderet af bronchoalveolar lavage væske (BALF) fra patienter med akut respiratorisk distress syndrom (ARDS), som er en tilstand, der er karakteriseret af proteolytiske og inflammatoriske miljøer i lunge på Intensivafdelinger. Desuden, sonderne skulle have en egnet fluorophore til registrering af et klinisk godkendt optisk CLE imaging enhed inden for menneskelige alveolær lungevæv.
Pipeline afhøre hver af disse forudsætninger var som følger (på hvert stadium, kun sonder, der passerede blev båret frem til næste): (1) et bibliotek af sonder undersøges blev syntetiseret; (2) hver sonde blev føjet til et panel af levende bakterier til Konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) for at sikre bakteriel mærkning; (3) selektivitet bakteriel mærkning over pattedyrsceller i co kulturer med primære human neutrofiler blev etableret af CLSM; (4) stabilitet og vellykket mærkning af bakterier i nærværelse af ARDS patienten BALF blev bestemt ved CLSM og Matrix Assisted Laser Desorption/ionisering-tid for flyvning (MALDI-TOF) massespektrometri; (5) optimal koncentration af kandidater blev bestemt ved CLSM, at sikre selektiviteten for bakterier over pattedyrceller blev opretholdt; (6) kandidater blev afbildet af FCFM i suspension og ex vivo menneskelige alveolær lungevæv at sikre stabilitet og som signal til støj var tilstrækkelig til påvisning. Trin 6 er beskrevet indgående i denne protokol. Metode til trin 1-5 har været tidligere rapporteret11.
Protocol
Alle menneskelige lungevæv blev opnået efter informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af den regionale etiske komité.
1. forberedelse af biologiske prøver
-
Forberedelse af sonder
- Udgør en 1 mM stamopløsning af hver probe (fxCalcein AM, UBI-3, UBI-10, osv.) i sterilt dH2O, ved hjælp af en fin balance for at veje den frysetørrede sonde sammensatte11. Beregne omfanget af dH2O at tilføje baseret på vejede masse og molekylvægt af sonden.
-
Forberedelse af bakteriel kulturer
Bemærk: For denne metode, Staphylococcus aureus blev brugt som den eksemplariske stamme. Enhver passende bakteriel stamme kan vælges. Enhver kommerciel farvestof, der etiketter bakterier med en passende excitation og emission spektre kan vælges at positivt mærke bakterier.- Vælg en enkelt koloni af ønskede bakteriel stamme fra en frisk Lysogeny bouillon (LB) agar plade ved hjælp af en steril løkke. Podes kolonien i 10 mL af LB i et 50 mL centrifugeglas ved at dyppe enden af løkken i kultur medier. Der inkuberes ved 37 ° C, 250 rpm i 16 timer (eller natten over).
- Bestemme OD595 af overnight kultur ved at tilføje 100 µL af overnight kultur til 900 µL LB i en 1 mL kuvette. Måle OD på 595 nm (med en kuvette med 1 mL LB som en tom) i et spektrofotometer. Formere den opnåede OD af 10 få OD for de overnattende kultur.
- Subkultur overnight kultur. Gøre dette ved at justere den optisk tæthed på 595 nm (OD595) 0,1 i 10 ml frisk LB. beregning af det nødvendige volumen af overnight kultur skal føjes til 10 mL frisk LB til at justere OD595 til 0,1. Inkuber kultur ved 37 ° C, 250 rpm indtil kulturen når midten log fase (OD595 0,6 - 0,8), ca 4 h.
- Måle kultur optisk densitet (trin 1.2.2) og høst 1 x 108 kolonidannende enheder (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) af bakteriekulturen til 1,5 mL microtube (f.eks., hvis bakteriekulturen er OD595 0,6, indsamle 1,67 mL). Der centrifugeres kultur på 10.000 x g ved stuetemperatur i 1 minut at sammenpresse bakterier. Vask pellet to gange i phosphat bufferet saltvand (PBS) af resuspending (pipettering op og ned omhyggeligt) pellet i 1 mL PBS, centrifugering som ovenfor, udsmid supernatanten og gentage. Passe på ikke for at løsne den bakterielle pellet, når du fjerner supernatanten. Endelige resuspenderes i 1 mL PBS.
Bemærk: Forberede hver mærkning procedure så mange prøver som krævet. Protokollen kan her stå i pause i op til 1 time, efterfulgt af skridt 1.2.5.1, 1.2.5.2 eller 1.2.5.3. - Bakteriel farvning
- Hvis du vil navngive bakterier med Calcein AM, tilføje farvestoffet til en endelig koncentration på 1 µM i vasket bakteriekulturen. Inkuber kultur i 30 minutter ved 37 ° C under omrystning på 300 rpm. Vask counterstained bakteriel suspension i PBS 3 gange ved centrifugering som i trin 1.2.4 at fjerne overskydende farvestof. Resuspend i 1 mL PBS, fortyndes 100 µL 1:1 i PBS til at skaffe 200 µL af OD595 0,5 Calcein er farvede bakterier. Protokollen kan her stå i pause i op til 1 time.
- Hvis du vil navngive fortyndes bakterier med test sonder (fxUBI-3 eller UBI-10), 100 µL af bakteriekulturen 1:1 i PBS at opnå OD595 0,5 i 200 µL PBS. Tilføj enten af sonder til en slutkoncentration på 10 µM. Vend microtube flere gange for at sikre grundig blanding af bakterier og sonden.
Bemærk: Imaging skal udføres straks efter tilsætning af sonde til at efterligne den kliniske scenario. - For at forberede kontrol unstained bakteriel prøver, fortyndet 100 µL af kultur 1:1 med PBS til at skaffe 200 µL af unstained OD595 0,5 prøve.
-
Forberedelse af ex vivo menneskelige lungevæv
Bemærk: Menneskelige lunge vævsprøver blev indhentet fra patienter, som gennemgår kirurgisk resektion for lunge karcinom. Alt væv, der bruges til billedbehandling blev fremstillet af prøver af normal lungevæv fra kræftknude. Prøverne blev taget frisk fra operationsstuen og gemt i microtubes eller centrifugeres rør ved-80 ° C indtil brug.- Umiddelbart før imaging, skal du fjerne menneskelige lunge vævsprøve fra fryseren på tøris. Ved stuetemperatur, tillade væv til at tø lidt; lige nok til at blive skåret med en skalpel i 1 x 4 mm2 sektioner.
Bemærk: Niveauet for optøning er vigtig; også frosne og vævet vil ikke skær uden skår væk, også optøet og væv er for bløde til at skive. - Bruge pincet, læg skiver menneskelige lungevæv i wells af en 96-godt klare fladbundede vævskultur plade. Returnere eventuelle ubrugte menneskelige lungevæv straks til opbevaringsbeholder og sted på tøris til transport tilbage til-80 ° C fryser.
- Tilføje 100 µL PBS til hver lunge vævsprøve med en pipette. Bruge pipette tip til at sikre alle væv er dækket af PBS (og ikke holdt sig til væggene i brønden). Vævet vil svulme lidt og kan flyde. Forlade PBS på prøve i et par minutter til at tillade enhver blod til at sive ned fra væv i løsningen. Fjern så meget af PBS som muligt. Vævet kan blokere udgangen af pipette tip; Prøv at vinkle plade/tip placering for at forhindre dette.
- Der afpipetteres 100 µL af unstained, Calcein er mærket eller test-sonde mærket bakterier til hver godt indeholdende lungevæv. Også definere kontrolelementer med lungevæv og 100 µL PBS. Til disse kontrolhullerne kan sonder uden bakterier tilføjes for at måle nogen stigning i baggrunden fluorescens og/eller ikke-specifik aktivering af sonden af lungevæv alene. Et godt med lungevæv og PBS skal også medtages.
- Umiddelbart før imaging, skal du fjerne menneskelige lunge vævsprøve fra fryseren på tøris. Ved stuetemperatur, tillade væv til at tø lidt; lige nok til at blive skåret med en skalpel i 1 x 4 mm2 sektioner.
2. imaging med CLE enhed med FCFM
-
Oprettet af CLE enhed
Bemærk: Forberede CLE system 20 min før kalibrering tillade laser til at varme op.- Tryk på tænd/sluk-knappen på bagsiden af transformeren af systemet og vende på den angivne computer. Tryk på on/off-knappen på forsiden af laser scanning enhed (LSU). Bekræfte udseendet af det grønne lys, der angiver, at enheden er tændt.
- Dobbeltklik på ikonet CLE software. Angiv login detaljer og vente på LSU initialisere (10-30 s).
- For anvendelse af nye FCFM imaging fibre, er installationen med den medfølgende CD nødvendige. Indsæt installations-cd'en i computeren CD-drevet og følge instruktionerne på skærmen.
- Ren FCFM fiber stik Trykbilledenheden med en fiber renere. Gnid stikket på rengøring båndet i bevægelse fremad til at fjerne støv/snavs. Fjern den gule beskyttelseshætten fra forsiden af LSU.
- Forbered LSU hub ved forsigtigt roterende hubben sølv mod uret, indtil det stopper. Indsæt FCFM imaging fiber stik til hub'en med den flade side af stikket vender opad. Holder fibrene på plads og rotere hubben sølv med uret, indtil det klikker to gange. Komplet forbindelsen ved at dreje den sølv hub uret ved en yderligere 45°.
Bemærk: Hvis fiber ikke er anerkendt, tjek at FCFM imaging fiber er blevet installeret og forbundet i den rigtige retning. - Følg de instruktioner, der vil pop-up for at færdiggøre FCFM imaging fiber kalibrering. Der er 3 trin: (1) FCFM billeddannelse fiber test (trin 2.1.7 - 2.1.8), (2) baggrund erhvervelse (trin 2.1.9), (3) fiber påvisning (trin 2.1.10).
- Tryk på knappen 'start laser' på skærmen. Laser vil centrere.
- Vælg frisk hætteglas (gul: kalibrere; rød: rengøre; blå: skyl) fra kalibreringen kit og følg instruktionerne på skærmen: placere den distale ende af FCFM imaging fiber i den gule hætteglas og se stigningen i fluorescens på skærmen, og derefter placere den fiber tip til den røde hætteglas (uden omrøring). Afvente fluorescens (som vist på computerskærmen) til at forsvinde. Endelig skyl fiber spids i blå hætteglasset.
Bemærk: Hvis fluorescens ikke forsvinder, rene FCFM imaging fiber med 8% H2O2 og linse rengøring væv og begynde igen. Gentag processen indtil der opnås tilfredsstillende resultater (billedkvaliteten er klar, og ingen mærker fra snavs er tilsyneladende). - Placer FCFM imaging fiber ind i den blå hætteglas. Tryk på 'start laser' efterfulgt af 'beregne', når dette bliver en mulighed.
- Placer FCFM imaging fiber i den gule hætteglas. Tryk på 'start laser' efterfulgt af 'beregne', når dette bliver en mulighed.
- Under den automatiske kalibrering, rense den distale ende af FCFM imaging fiber ved at placere i den røde hætteglas til > 10 s, efterfulgt af den blå hætteglas til > 4 s, som angivet af softwaren.
-
Dataindsamling med CLE
- Efter installation åbnes et vindue til at vælge lagerplaceringen og filen præfiks. Vælg den ønskede mappe til lagring af data, og navnet præfikset i overensstemmelse hermed.
- Placer fodpedaler, så de let kan tilgås af operatøren. Venstre pedal: laser tænd/sluk; Center pedal: pause; højre pedal: Optag/stop.
Bemærk: Knapperne på laser kan også tilgås via på skærmen kontrol. - Klik på 'start' på skærmen eller trykke på den venstre fodpedal at tænde laser. Dette vil starte erhvervelse og få billeder ved hjælp af 100% laser power og en billedfrekvens på 12 rammer/s (standardindstillinger).
Bemærk: Andre programmer, disse indstillinger kan ændres på skærmen hvis det er nødvendigt, afhængigt af hvilken prøve. - Billede hver af bakteriel suspension prøver.
- Indsæt den distale ende af FCFM imaging fiber og flytte fiber langsomt gennem suspension afhøre prøven.
- Optage videoer af enhver længde (op til 10 min.) ved at trykke på den højre fodpedal eller markere kontrolelementerne på skærmen optage som fiber bevæger sig langsomt omkring prøven.
- Ren den distale ende af FCFM imaging fiber med 8% H2O2 og linse rengøring væv mellem prøver.
Bemærk: Typisk video længder af 10-30 s er tilstrækkelig for in vitro- billeddannelse.
- Billede hver lunge væv prøver.
- Indsæt den distale ende af FCFM imaging fiber ind i prøven, at sikre, at direkte kontakt mellem slutningen af fiber og væv er lavet. Forsigtigt flytte ende af billedbehandling fiber omkring afhøre prøven.
Bemærk: Løft slutningen af fiber fra vævet vil fjerne væv fra brændplanet; Dette kan dog bruges til at billedet mærket bakterier, der ikke er levet op til væv. - Optage videoer af enhver længde (op til 10 min.) ved at trykke på den højre fodpedal eller markere kontrolelementerne på skærmen optage som fiber bevæger sig langsomt omkring prøven.
Bemærk: Typisk, video længder 30 s er tilstrækkelig for ex vivo billeddannelse på væv. - Ren den distale ende af FCFM imaging fiber med linse rengøring væv og 8% H2O2 mellem prøver.
- Indsæt den distale ende af FCFM imaging fiber ind i prøven, at sikre, at direkte kontakt mellem slutningen af fiber og væv er lavet. Forsigtigt flytte ende af billedbehandling fiber omkring afhøre prøven.
-
En deaktivering af systemet
- Sluk laser, ved at trykke på den venstre fodpedal eller ved at klikke på den skærmknap.
- Afbryde FCFM imaging fiber fra CLE-enheden ved at dreje den sølv LSU hub mod uret, indtil det stopper. Fjerne FCFM imaging fiber fra hubben LSU ved forsigtigt at trække fiber stik fra LSU.
- Rengøre og desinficere FCFM imaging fiber med 8% H2O2 og linse rengøring væv. Returnere de beskyttende hætte til den proksimale ende af FCFM imaging fiber og forsiden af LSU enhed. Sted fiber forsigtigt i feltet lager.
- Tæt data capture software og kopiere alle gemte filer til en ekstern USB-enhed. Lukke computeren ned og slå LSU enheden ved at trykke på frontpanelet I/O for 3 s indtil det grøn lys forsvinder.
- Bortskaffe menneskelige lungevæv og bakterier ifølge lokale regler.
3. dataanalyse
- Åbn softwaren og importere filer til analyse ved at vælge den relevante mappe på computeren via "Gå til" ikonet på software dashboard. Alternativt, filer kan trækkes og slippes i software instrumentbrættet.
- Dobbeltklik på hver video fil for at åbne dem. Videoer afspilles automatisk med optimeret farve opslagstabel (LUT) og farvetabellen justere. Deaktivere automatisk intensiteten skalering, ved at klikke på knappen tryllestav over baren intensitet skala. Funktionen er deaktiveret, når der er ingen sorte skygger omkring knappen.
Bemærk: Automatisk intensitet skalering skal være deaktiveret for at forhindre kontinuerlig kontrastforbedring hele hver video, hvilket gør det umuligt at sammenligne og analysere videoer fra det samme datasæt. - Vælg den ønskede intensitet skalering ved at flytte de minimums- og barer til at give den bedste kontrast. Brug værktøjet histogram, når du vælger intensiteten skalering for at sikre den bredest mulige dynamikområde er fanget.
Bemærk: Sikre, at den dynamiske område, så billederne ikke er mættet (dvs. begrænse de hvide regioner af billedet, som angiver mætning), således at lav intensitet funktioner ikke er savnet. - Når den ønskede skalering er opnået, højre klik på dropdown menu knappen opført som 'Default (grøn)'. Vælg at gemme LUT. Gemme LUT til et ønsket sted.
- For hinanden video inden for datasættet, gælder samme LUT ved at højreklikke over 'Default (grøn)' drop-down menuen og vælg 'Load LUT'. Vælg den relevante fil at anvende ensartet intensitet skalering til alle videoer i et datasæt.
- Eksportere forarbejdede videoer ved at klikke på knappen 'film reel'. Vælg den ønskede video format, fx 'til præsentation formål', som vil skabe en .mpg-fil. Tryk 'Eksport' og valgte placering til at gemme videofilen. Snapshots af enkeltbilleder kan eksporteres ved at klikke på knappen 'kamera'. Det er muligt at gemme en .png, .bmp eller .jpg fil. Vælg fil destinationen og tryk på Gem.
Bemærk: Videoer kan derefter importeres til enhver software til forberedelse af præsentationer eller yderligere kvantificering. Mærket bakterier er visualiseret som grønne 'blinker' prikker i videoen. Lunge væv struktur vil fremgå som bestilte fluorescerende tråde, med alveolær plads vises sorte.
Representative Results
I denne undersøgelse, har vi vist en metode til hurtig-screening af roman bakterier-specifikke sonder i en ex vivo menneskelige alveolær lunge væv model af infektion ved hjælp af et klinisk godkendt CLE enhed.
CLE af FCFM er velegnet til at opnå strukturelle oplysninger inden for den distale lunge, som denne region (på grund af en høj overflod af elastin og kollagen) er naturligvis stærkt fluorescerende når ophidset med en 488 nm laser8. Omvendt, det alveolære rum fluorescerer ikke, og som sådan giver høj kontrast mellem væv struktur og luftrummet skal visualiseres (figur 1).
Tilsætning af sygdom relateret sonder eller kontrast agenser, såsom bakterier-specifikke sonder bør aktiverer funktionelle oplysninger om sygdomsprocesser fremstilles i realtid. Vi har tidligere beskrevet syntesen og indledende i vitro screening af et bibliotek af bakterier-specifikke sonder11; hvor bakteriel-specificitet, blev proteolytiske stabilitet og opbevaring i den bakterielle membran over tid fastsat. En lovende bakterier-specifikke sonde (UBI-10) blev identificeret i undersøgelsen, som en, der viste dårlig opbevaring inden for den bakterielle cellemembranen (UBI-3). Disse blev sammenlignet med en kontrol af kommercielle counterstaining (Calcein AM), der blev brugt til mærket S. aureus.
Unstained, var Calcein AM, UBI-3 og UBI-10 mærket S. aureus afbildet i suspension af FCFM med 100% 488 nm laser power og en billedfrekvens på 12 rammer/s (figur 2). Hvor umærkede bakterier i PBS var afbildet, var ingen fluorescerende signal påviselig. Dette er i modsætning til når mærket bakterier var afbildet. Hvor bakteriel suspensioner med UBI-3 eller UBI-10 var afbildet af FCFM, var det tydeligt, at den generelle baggrund fluorescens af løsningen blev forhøjet i forhold til PBS eneste kontrolelementer, fordi NBD (probe fluorophore) udsender en lille mængde af Fluorescens signal i vandig opløsning, men punktformet lyspletter er klart synlig i hele løsningen, uden behov for en vask trin. Dette skyldes en stigning i fluorescens signalet udsendes fra NDB i et polar miljø dvs, den bakterielle membran. Calcein AM er ikke en activatable sonde, så vask trin efter bakteriel farvning var forpligtet til at fjerne den høje fluorescerende baggrund af ubundne sonden i løsningen. Ligesom UBI-3 og UBI-10 mærket bakterier, bakterier mærket med Calcein AM blev opdaget i løsning af FCFM som lyse grønne punktformet prikker. Som dataene er indsamlet i video format, vises disse prikker til at 'blinke' når de bevæger sig mellem kerner og og-ud af fokus, en karakteristisk træk af imaging mærket bakterier af denne metode.
Mærket bakterier blev efterfølgende føjet til små skiver af ex vivo menneskelige lungevæv og afbildet igen af FCFM (figur 3). Hvor kun PBS eller umærkede S. aureus blev tilføjet til lungevæv, blev kun lunge væv autofluorescent struktur fundet (ses som lyse grønne tråde af kollagen og elastin og mørke områder af alveolær plads). Ingen punktformet prikker blev fundet for disse kontrol betingelser. På samme måde blev kun lunge væv struktur (og ikke punktformet prikker) visualiseret for lunge væv tilstand med S. aureus plus UBI-3; Angiver, at denne sonde ikke blev bevaret stabilt inden for bakterielle celle membran dvs, det blev vasket ud og/eller er forringet i overværelse af indfødte Proteolytiske enzymer i lungevæv (som tidligere påvist11).
Men punktformet lyspletter var synligt i begge Calcein AM mærket positive kontrolprøve S. aureus , og med den mest lovende bakterier-specifikke sonde (UBI-10) S. aureus prøve. De "funklende" prikker var synlige trods stærk væv autofluorescence (figur 3). Således resultaterne af FCFM var i overensstemmelse med in vitro- pre screening af panelet af bakterier-specifikke sonder af CLSM, og påvist en klinisk relevante påvisningsmetode for imaging infektioner i realtid.
Resultaterne præsenteres her dokumentere, at lungen er et passende organsystem for billedbehandling af FCFM på grund af sin karakteristiske autofluorescence. De lyse karakteristiske strukturer tillade CLE operatør til at bestemme, at de er i den alveolære rum. Disse regioner, kombineret med de mørke alveolær luftsække giver den perfekte kulisse for imaging fluorescently mærket bakterier med høj kontrast.
Selv om påvisning af bakterier præsenteret i denne undersøgelse bestemmes kvalitativt ved at visualisere punktformet lyspletter, kunne det være muligt at opgøre antallet af punktformet prikker indramme af indramme ved hjælp af en sekundær software med henblik på at karakterisere sonden biblioteker.
Figur 1: Statiske billede af menneskelige lunge væv autofluorescence. Konfokal laser endomicroscopy (CLE) billedet af ex vivo menneskelige lungevæv ved hjælp af fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi (FCFM), på 488 nm excitation, 100% laser power og 12 rammer/s. Elastin og kollagen er stærkt fluorescerende (falsk farvet grøn), alveolære rum er ikke og vises som sorte områder. Dette tal er blevet ændret fra Akram mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Konfokal laser endomicroscopy (CLE) billede af mærket S. aureus i suspension. Fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi (FCFM) blev brugt til at afbilde forud mærket bakterier, 488 nm excitation, 100% laser power og 12 rammer/s. mærket bakterier Vis som stærkt fluorescerende punktformet prikker (falsk farvet grøn). Dette tal er blevet ændret fra Akram mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konfokal laser endomicroscopy (CLE) billedet af ex vivo menneskelige lungevæv med mærket S. aureus. Fibered Konfokal Fluorescens mikroskopi (FCFM) blev brugt til billede ex vivo menneskelige lungevæv og mærket S. aureus, 488 nm excitation, 100% laser power og 12 rammer/s. mærket bakterier show som stærkt fluorescerende punktformet prikker (falsk farvet grøn) inden for lunge vævsprøve når mærket med Calcein AM eller UBI-10. Den højeste kontrast er observeret, hvor bakterier er afbildet under det alveolære rum. Dette tal er blevet ændret fra Akram mfl. 11 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Nedre luftvejsinfektioner tegner sig for andet højeste sygdomsbyrden globalt12,13, og en betydelig stigning i antallet af infektioner tilskrives antimikrobielt resistente bakterier har været rapporteret14. Lungebetændelse er en almindelig årsag til hospitalsindlæggelse. På Intensivafdelinger, udviklingen af en lungebetændelse forværres af diagnostisk usikkerhed og er forbundet med en ekstremt høj dødelighed sats15. Under udbrud af lungebetændelse, bakterier formere sig under det alveolære rum af den distale lunge, et område, der er relativt sterile, med minimal mikrobiota i sundhed.
I denne metode beskrives forholdsvis sent stadium ex vivo validering af bakterier-specifikke optiske billeddannelse sonder11, men design, syntese, og sonden evaluering forud for begyndelsen denne valideringstrinet er bydende nødvendigt, som tidligere vist11 .
CLE er en spirende kliniske teknik til spørgekriterierne sygdom i situ i realtid. Det giver mange fordele frem for traditionelle teknikker for at undersøge mistanke om pulmonal patologi, der kan indebære en biopsi og samling af lavage væske. Biopsier er invasive og kan forårsage sygelighed og dødelighed i ventilerede patienter, og indsamlede lavage væske er ofte forurenet med bakterier fra de øvre luftveje. Brugen af CLE i påvisning af lungebetændelse er imidlertid noget begrænset på grund af den dårlige tilgængelighed kompatibel Imaging sonder, som kan oplyse sygdom, trods mange samordnet indsats10funktionelle. Kombinere CLE med optisk agenter giver udsigt til diagnosticering lungebetændelse hurtigere og mindre i forhold invasivt til nuværende standard praksis.
De kritiske trin i denne protokol er i forberedelse af prøver og opsætning af CLE-platformen. Opnåelse af menneskeligt væv er relevante for den endelige kliniske anvendelse er også vigtige, såsom menneskelige lungevæv som påvist i denne undersøgelse. Det er nødvendigt at bruge menneskelige væv, fordi omfanget af væv autofluorescence viser stor inter arter variation, og derfor kan vildlede følsomheden af bakterier-sonden er afbildet. Derudover er at opnå etik for hentning og brug af menneskelige lungevæv afgørende. Fra et teknisk niveau, korrekt rengøring er fastgørelse af imaging fiber til billedbehandling LSU platform og kalibrering afgørende for god opløsning og konsekvent billeddannelse, som er at sikre tilsvarende antal bakterier er føjet til hver lunge vævsprøve. For at udvide yderligere nytte af denne metode til screening paneler af sonder, er det nødvendigt at gentage proceduren med en vifte af patogener, som de sandsynligvis være agenser af lungebetændelse.
Den største begrænsning af denne teknik er at klinisk godkendt CLE enheden har kun én laser (488 nm). I øjeblikket, er udvælgelse af fluorophore for sonden design derfor begrænset til brug med dette system, selvom klinisk godkendt enkelt farve enheder findes med excitation bølgelængder af 660 nm og nær-infrarødt. Det er ønskeligt at have en anden laser linje gennemført inden for den samme enhed til at aktivere en sonde skal udvikles med en spektralt særskilte fluorophore at forbedre bakterier-sonde følsomhed over niveauet af væv autofluorescence. Mens tofarvet CLE enheder er under udvikling, de er enten ikke klinisk godkendt og/eller deres omkostninger er betydelig16.
CLE in vitro- ved hjælp af sygdomsfremkaldende bakterier og ex vivo menneskelige lungevæv til skærmen potentielle sonder bygger bro mellem traditionelle in vitro- teknikker som flowcytometri og CLSM og kliniske anvendelighed. Dette trin giver tillid når du vælger lovende forbindelser til at bære frem for at blive koblet med kliniske CLE imaging; og vil give fingerpeg om, hvorvidt testet sonden fastholder målet specificitet, eller viser nogen off-target mærkning, såsom binding direkte til væv, eller viser ustabilitet med værten Proteolytiske enzymer. Det ville også være relevant at tilføje hver af de activatable sonder direkte til prøver af menneskelige lungevæv plus bakterier, til fuldt ud at beskrive hastigheden af sonden bindende og aktivering i realtid.
Vi mener, at vores pipeline for hurtigt screening roman bakterier-specifikke sonder til at vurdere deres potentiale for billeddannelse i den distale lunge patienter vil resultere i meget hurtigere oversættelse til klinikken. Dette skyldes i vid udstrækning, at bakterier-specifikke sonden kunne leveres lokalt i lungerne gennem et kateter indsættes ned arbejde kanal af en bronchoscope, hvilket betyder, at microdose (< 100 µg) beløb kunne leveres. Systemisk levering og biodistributionen af stoffet er derfor ikke en bekymring, som er tilfældet for mange andre infektion mål inden for kroppen, eller med nukleare billeddannelse. Derudover leverer imaging sonden i sådan en lille dosis reducerer risikoen for toksicitet relaterede komplikationer (selv om toksicitet screening ville være påkrævet for oversættelse). Efter instillation af sonden, kunne kateteret derefter erstattes af FCFM fiber og den samme region af lungen forhørt af CLE, meget på samme måde, vi har udført inden for denne metode. Imaging bør foretages hurtigt efter installation af sonden før sonden vasker væk til målbart koncentrationer.
Det er også vigtigt at bemærke, at screening af identifikation af sygdommen sonder ved denne teknik bør ikke begrænses til bakteriel-imaging agenter, men kunne også udvides til validering af sonder med alternative mål, såsom betændelse. Denne fremgangsmåde bør også tilpasses andre sygdom steder i kroppen hvor imaging via FCFM er tilladt.
Disclosures
KD: Grundlægger direktør for Edinburgh molekylær billeddannelse. Modtaget rådgivning fra Mauna Kea teknologier som rådgiver.
MB: Grundlægger direktør for Edinburgh molekylær billeddannelse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Engineering og Physical Sciences Research Council (EPSRC, Det Forenede Kongerige) tværfaglige forskningssamarbejde grant EP/K03197X/1, Department of Health og Wellcome Trust gennem sundhed Innovation udfordring fond (HICF) . Finansiering referencenummer: 0510-069.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-14 Microfuge | SciQuip | 90616 | Small benchtop microcentrifuge |
| 96-well plate | Corning | 3370 | Assay plate |
| Calcein AM | Sigma Aldrich | 17783 | Commercial fluorescent dye |
| Cellvizio 488 nm Research CLE | Mauna Kea Technologies | LC-0001-488 | Confocal laser endomicroscopy device |
| Cletop-S | Cletop | 14110601 | Fibre cleaner |
| Eppendorf (1.5 mL) | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microfuge tube |
| Eppendorf Research Plus Pipettes | Fisher Scientific | 11568663 | Micro pipettes |
| Falcon tube (50 mL) | Scientific Lab Supplies | 352070 | 50 ml centrifugation tube |
| Gibco Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PBS - wash media |
| IC-Viewer | Mauna Kea Technologies | LW-0001 | Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system |
| Incu-Shake midi | Sciquip | SQ-4020 | Floor standing shaking incubator |
| Lysogeny Broth | Sigma Aldrich (Miller) | L3522 | LB Growth media for S. aureus |
| non-standard research AlveoFlex 488 nm | Mauna Kea Technologies | MP-0002-AF3 | Fibred confocal fluorescence microscopy fibre |
| Quanti Kit 488 nm | Mauna Kea Technologies | LQ-0005 | Calibration kit for the CellVizio 488 system |
| S. aureus ATCC 25923 | ATCC | 25923 | Bacterial strain used in this study |
| Semi-micro spectrophotometry cuvette | Sigma Aldrich | C5416-100EA | For spectrophotometry |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 41102422 | Benchtop heater with shaking |
| UV 1101 Biotech photometer | Biochrom WPA | Spectrophotometer |
References
- O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. , Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016).
- Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).
- Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
- Neumann, H., Kiesslich, R. Yamada's Textbook of Gastroent. , John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).
- Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
- Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
- Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
- Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
- Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
- Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
- Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
- Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
- Chastre, J., Fagon, J. -Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
- Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).
