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Immunology and Infection

Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf Ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie

doi: 10.3791/56284 Published: November 29, 2017

Summary

Dieses Verfahren beschreibt ein effizientes Screening-Verfahren für die Bewertung der Bakterien-spezifische optische Bildgebung Agents in ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie für die schnelle Identifizierung von chemischen kleines Molekül Sonde-Kandidaten mit Potenzial übersetzbar.

Abstract

Verbesserung der Geschwindigkeit und Genauigkeit der bakteriellen Erkennung ist wichtig für Patienten Schichtung und die geeignete Verwendung antimikrobieller Mittel sicherzustellen. Zur Erreichung dieses Ziels, die Entwicklung von diagnostischen Techniken, um bakterielle Anwesenheit zu erkennen in Echtzeit am Point-of-Care ist erforderlich. Optische Verfahren zur direkten Identifizierung von Bakterien in den Host ist ein attraktiver Ansatz. Mehrere Versuche, chemische Sonde Design und Validierung wurden untersucht, aber keine noch erfolgreich in der Klinik umgesetzt haben. Hier beschreiben wir eine Methode für die ex-Vivo Validierung von Bakterien-spezifischen Sonden zur Identifizierung von Bakterien innerhalb der distalen Lunge durch geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) abgebildet. Unser Modell verwendet ex Vivo menschlichen Lungengewebe und als klinisch zugelassenen konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) Plattform für Bildschirm Roman Bakterien-spezifischen imaging Verbindungen, eng imitiert Image Bedingungen voraussichtlich mit Patienten angetroffen werden. Daher stellt die Abschirmung von Verbindungen durch diese Technik Vertrauen der potenziellen klinischen Lenkbarkeit.

Introduction

Dieses Verfahren beschreibt eine schnelle Screening-Verfahren für die Bewertung der Bakterien-spezifische optische Bildgebung Agents in ex Vivo menschlichen Lungengewebe von CLE mit potenziellen klinischen Nutzens für die Visualisierung von FCFM für die schnelle Identifizierung von Verbindungen Bakterien in der distalen Lunge in Situ.

Es ist eine dringende globale Voraussetzung zu rationieren, antimikrobielle Verschreibung im Zeitalter der steigenden Antibiotikaresistenzen1. Zu diesem Zweck suchte die Entwicklung diagnostischer Methoden welche Akt, bakterielle Infektion mit hoher Spezifität, Sensitivität, und in Echtzeit zu identifizieren sind hoch2. Aktuelle Techniken zur Bestätigung der Diagnose einer Lungenentzündung in kritisch krank Patienten, wie Sie in Intensivstationen (Intensivstationen), verlassen sich oft auf Interpretation von unspezifischen klinischen oder radiologischen Eigenschaften neben Bakterienkultur Techniken aus abgesaugte Flüssigkeiten/Gewebe, die zu Ergebnissen führen bis zu 3 Tage dauern kann. Darüber hinaus Bakterienkultur von Flüssigkeit in die distale Lunge eingeflößt und ist anfällig für Verunreinigungen von mehr proximalen Airways3 und ist oft Kultur negativ durch antimikrobielle Begleittherapie oder schlechte Probenahmetechniken abgerufen. Darüber hinaus sind molekulare Techniken wie Polymerasekettenreaktion überempfindlich auf angesaugten Flüssigkeiten, riskieren Überbehandlung von Patienten verwendet. Ein aufstrebender diagnostischer Ansatz ist molekulare optische Bildgebung machen in Situ molekulare Pathologie der Gewebe eine Möglichkeit; die Entwicklung und Validierung von optischen Bildgebung Verbindungen ist jedoch erforderlich. Dennoch, direkter Visualisierung der Bakterien über aktivierbare Einkoppeloptiken ist potenziell eine sehr leistungsfähige Methode, um die Studie der Präsenz ermöglichen und Entwicklung an einer Lungenentzündung in den Patienten, und wichtiger, könnte verwendet werden, um Wirt-Pathogen Interaktionen in der Studie als Reaktion auf Therapien in Echtzeit- in-situ.

CLE ist ein etabliertes investigative Verfahren in mehreren Krankheiten4, auch in den Bereichen Gastroenterologie5, Onkologie6,7, sowie für Abfragen Airways und alveoläre Sacs8, 9. ermöglicht es Point-of-Care strukturelle Bildgebung von erkranktem Gewebe mit einer Faser imaging-Bundle, das durch den Arbeitskanal eines klinischen Endoskopes geht und Formen direkter Kontakt mit der Gewebeoberfläche, konfokale Mikroskopie abgebildet werden. Eine Einschränkung, die bleibt ist jedoch die Notwendigkeit einer generischen Kontrastmitteln. Daher könnte die Verwendung von Krankheit spezifischen Sonden, wie bestimmte Bakterien Agents, das Dienstprogramm dieser Modalität erheblich ausweiten, indem direkt visualisiert Bakterien am Ort der vermuteten Infektion. Optische Agenten bieten viele Vorteile gegenüber anderen Techniken, indem Sie in Echtzeit, hochauflösende Bildgebung mit diagnostische Potenzial aktivieren. Darüber hinaus bieten optische Sonden die Perspektive von multiplexing für Verhören mehrere Ziele, alles auf einem relativ niedrigen Kosten erreicht. Eine Reihe von optischen Agenten sind in der Entwicklung für einen solchen Zweck aber keiner noch innerhalb der Klinik10erfolgreich umgesetzt worden sind. Wir haben eine Bibliothek von niedermolekulare chemische Sonden mit Spezifität gegenüber Bakterien synthetisiert und eine schnelle, effektive Pipeline für die Bewertung der Probe-Funktion zur Erkennung von bakteriellen Pneumonie in Situ11entwickelt.

Um geeignete Sonde Kandidaten zu identifizieren, die folgenden Voraussetzungen mussten vor dem Verhör der Sonde auf ex Vivo menschlichen Lungengewebe von FCFM erfüllt werden: (i) wässrige Löslichkeit, Ii) Spezifität und Selektivität für die Beschriftung schnell klinisch relevanten Bakterien, Iii) ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und iv) Widerstand zu einer Verschlechterung in der Lunge-Umgebung. Letzteres wurde alvéolaire Lavage Fluid (BALF) anhand von Patienten mit akutem Atemnotsyndrom (ARDS), das ist eine Bedingung, die durch proteolytische und entzündlichen Umgebungen in der Lunge auf der Intensivstation auszeichnet. Darüber hinaus mussten die Sonden einen geeigneten Fluorophor für Erkennung durch ein klinisch zugelassenen optischen CLE imaging-Gerät innerhalb von menschlichen alveoläre Lungengewebe.

Die Pipeline, jede dieser Voraussetzungen zu befragen wurde wie folgt (in jeder Phase nur Sonden, die übergeben wurden vorgetragen zum nächsten): (1) eine Bibliothek mit Sonden zu untersuchenden wurde synthetisiert; (2) jede Sonde wurde ein Panel lebender Bakterien für konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) um zu gewährleisten, bakterielle Kennzeichnung hinzugefügt; (3) die Selektivität der bakterielle Kennzeichnung in Säugetierzellen in Ko-Kulturen mit primären menschlichen Neutrophilen gründete CLSM; (4) Stabilität und erfolgreiche Kennzeichnung von Bakterien im Beisein des ARDS-Patienten BALF wurde durch CLSM und Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) Mass Spectrometry bestimmt; (5) optimale Konzentration der Kandidaten wurden ermittelt, indem CLSM, Gewährleistung Selektivität für Bakterien in Säugetierzellen wurde beibehalten; (6) Kandidaten wurden von FCFM abgebildet, in der Schwebe und auf ex Vivo menschlichen alveoläre Lungengewebe, Stabilität und das gewährleisten der Signal-Rausch-war ausreichend für den Nachweis. Schritt 6 ist innerhalb dieses Protokoll ausführlich beschrieben. Methodik für die Schritte 1 bis 5 wurde bereits berichtet11.

Protocol

Alle menschlichen Lungengewebe wurde nach Einwilligung erhalten und die Studie wurde von der regionalen Ethik-Kommission genehmigt.

1. Vorbereitung von biologischen Proben

  1. Vorbereitung der Sonden
    1. Eine Stammlösung 1 mM von jeder Probe Make-up (z.B., Calcein AM, UBI-3, UBI-10, etc.) in sterilen dH2O, eine feine Balance, die gefriergetrockneten wiegen mit Sonde zusammengesetzte11. Berechnen Sie das Volumen der dH2O hinzufügen aufgrund der gewogene Masse und Molekulargewicht der Sonde.
  2. Vorbereitung von Bakterienkulturen
    Hinweis: Für diese Methode war Staphylococcus Aureus als Vorbild Belastung verwendet. Geeignete Bakterienstamm kann ausgewählt werden. Jede kommerzielle Farbstoff, die Bakterien mit einer entsprechenden Erregung und Emissionsspektren Etiketten kann ausgewählt werden, um die Bakterien positiv zu beschriften.
    1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von gewünschten Bakterienstamm aus einer frischen Lysogeny Brühe (LB) Agarplatte mit einer sterilen Schleife. Impfen Sie die Kolonie in 10 mL LB in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen durch Eintauchen am Ende der Schleife in den Nährmedien. Inkubation bei 37 ° C, 250 u/min für 16 h (oder über Nacht).
    2. Bestimmen Sie die OD-595 der Nacht Kultur durch Zugabe von 100 µL der Übernacht-Kultur zu 900 µL LB in eine Küvette 1 mL. Messen Sie die OD bei 595 nm (mit einer Küvette mit 1 mL LB als Rohling) in einem Spektrophotometer. Multiplizieren Sie die erhaltenen OD mit 10 OD für die Übernachtung Kultur zu erhalten.
    3. Subkultur der Nacht Kultur. Tun Sie dies durch eine Anpassung der optischen Dichte bei 595 nm (OD595) bis 0,1 in 10 mL frisches lb berechnen Sie die erforderliche Menge über Nacht Kultur hinzugefügt werden 10 mL frisches LB OD595 auf 0,1 anpassen. Inkubation die Kultur bei 37 ° C, 250 u/min, bis die Kultur Mid Log-Phase (OD595 0,6 - 0,8), erreicht ca. 4 h.
    4. Messen Sie die Kultur optische Dichte (Schritt 1.2.2) und Ernte 1 x 108 Koloniebildenden Einheiten (KBE) (OD595 ~ 1: 1 x 108 KBE/mL) für die Bakterienkultur in einem 1,5 mL Reaktionscup (z. B., wenn die bakterielle Kultur OD595 0,6, sammeln 1,67 mL). Zentrifugieren Sie die Kultur bei 10.000 x g bei Raumtemperatur für 1 min um die Bakterien zu Pellets. Waschen das Pellet zweimal in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch resuspending (Pipettieren oben und unten vorsichtig) das Pellet in 1 mL PBS, wie oben beschrieben zentrifugieren, überstand verwerfen und wiederholen. Achten Sie darauf, nicht um die bakterielle Pellet zu vertreiben, wenn den Überstand zu entfernen. Die letzte Tablette in 1 mL PBS aufzuwirbeln.
      Hinweis: Bereiten Sie so viele Proben nach Bedarf für jede Kennzeichnung Prozedur. Das Protokoll kann hier bis zu 1 h, gefolgt von Schritt 1.2.5.1, 1.2.5.2 oder 1.2.5.3 angehalten werden.
    5. Bakterielle Färbung
      1. Fügen Sie den Farbstoff um die Bakterien mit Calcein AM Etikett hinzu, eine Endkonzentration von 1 µM in die gewaschenen Bakterienkultur. Inkubieren Sie die Kultur für 30 min bei 37 ° C mit Schütteln bei 300 u/min. Waschen der counterstained Bakteriensuspension in PBS 3 Mal durch Zentrifugation wie in Schritt 1.2.4, überschüssige Farbe zu entfernen. In 1 mL PBS aufzuwirbeln, 100 µL 1:1 mit PBS-Puffer zu 200 µL OD595 0,5 Calcein bin gefärbten Bakterien zu verdünnen. Das Protokoll kann hier bis zu 1 Stunde angehalten werden.
      2. Zum Beschriften Verdünnen der Bakterien mit Prüfspitzen (z.B.UBI-3 oder UBI-10), 100 µL der Bakterienkultur 1:1 in PBS, OD595 0,5 in 200 µL PBS zu erhalten. Fügen Sie entweder der Sonden, eine Endkonzentration von 10 µM. die Reaktionscup mehrmals umkehren, um guten Durchmischung der Bakterien und die Sonde zu gewährleisten.
        Hinweis: Bildgebung sollte sofort nach der Zugabe der Sonde, die klinische Szenario imitieren durchgeführt werden.
      3. Zur Vorbereitung der Kontrolle OD ungefärbte bakterielle Proben, verdünnte 100 µL der Kultur 1:1 mit PBS zu 200 µL des ungefärbten595 0,5 Probe.
  3. Vorbereitung der ex Vivo menschlichen Lungengewebe
    Hinweis: Patienten, die eine chirurgische Resektion für Lungenkarzinom wurden menschliche Lunge Gewebeproben entnommen. Alle Gewebe, die für die Bildgebung verwendet wurden Proben von normalem Lungengewebe entfernt das Krebsgeschwür entnommen. Proben wurden frisch vom OP-Saal und bis zur Verwendung in Mikroröhrchen oder Zentrifuge Röhren bei-80 ° C gelagert.
    1. Unmittelbar vor der Bildgebung, entfernen der menschlichen Lunge Gewebeprobe aus der Tiefkühltruhe auf Trockeneis. Erlauben Sie bei Raumtemperatur das Gewebe leicht Auftauen; gerade genug, um mit einem Skalpell in 1 x 4 mm2 Abschnitte geschnitten werden.
      Hinweis: Das Auftauen ist wichtig; auch eingefroren und das Gewebe wird nicht schneiden, ohne Absplitterungen, auch aufgetaut und das Gewebe ist zu weich, zu schneiden.
    2. Mit Zange, legen Sie die in Scheiben geschnittenen menschlichen Lungengewebe in Vertiefungen einer 96-Well klar flach-Boden Gewebekultur-Platte. Schicken Sie ungenutzten menschlichen Lungengewebe sofort an den Vorratsbehälter und Ort auf Trockeneis für den Transport zurück zu-80 ° C Gefrierschrank.
    3. Jede Lunge Gewebeprobe mit einer Pipette 100 µL PBS hinzufügen. Verwenden Sie die Pipettenspitze, um sicherzustellen, dass alle das Gewebe in der PBS behandelt (und nicht auf die Wände des Brunnens stecken). Das Gewebe wird leicht anschwellen und schweben kann. Verlassen Sie die PBS auf Probe für ein paar Minuten Blut aus dem Gewebe in die Lösung Leach ermöglichen. So viel des öffentlich-rechtlichen Rundfunks wie möglich entfernen. Das Gewebe kann zum Jahresende die Pipettenspitze blockieren; versuchen Sie, die Platte/Tip-Platzierung Winkel um dies zu verhindern.
    4. Pipette 100 µL ungefärbten, Calcein bin beschriftet oder Test-Sonde mit der Bezeichnung Bakterien zu jeder gut mit Lungengewebe. Auch Kontrollen mit Lungengewebe und 100 µL PBS eingerichtet. Diese Kontroll-Vertiefungen können Sonden ohne Bakterien hinzugefügt werden alle Hintergrundfluoreszenz und/oder unspezifische Aktivierung der Sonde lässt sich von Lungengewebe allein. Ein Brunnen mit Lungengewebe und PBS sollten auch enthalten sein.

(2) Bildgebung mit dem CLE-Gerät mit FCFM

  1. CLE-Gerät einrichten
    Hinweis: Bereiten Sie die CLE-System 20 min vor der Kalibrierung des Lasers zum Aufwärmen zu ermöglichen.
    1. Drücken Sie den ein-/Ausschalter auf der Rückseite des Transformators des Systems und den dafür vorgesehenen Computer einschalten. Drücken Sie den ein-/Ausschalter auf der Vorderseite von der Laser-scanning-Unit (LSU). Bestätigen Sie das Erscheinungsbild des grünen Lichts, darauf hinweist, dass das Gerät eingeschaltet ist.
    2. Klicken Sie doppelt auf das Icon CLE. Geben Sie die Login-Daten und warten der LSU (10-30 s) zu initialisieren.
    3. Für den Einsatz der neuen FCFM imaging Fasern ist Installation mit der mitgelieferten CD erforderlich. Legen Sie die Installations-CD in das CD-Laufwerk des Computers, und folgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm.
    4. Reinigen Sie die FCFM Faser Connector Belichtungseinheit mit einer Faser Reiniger. Reiben Sie den Stecker an der Reinigung Band in einer Vorwärtsbewegung Staub/Schmutz entfernen. Entfernen Sie die Schutzkappe gelbe von der Vorderseite des der LSU.
    5. Bereiten Sie die LSU-Hub durch leichtes Drehen der silberne Nabe gegen den Uhrzeigersinn bis zum Anschlag. Einfügen Sie FCFM imaging LWL Stecker in die Nabe mit der flachen Seite des Steckers nach oben Halten Sie die Faser und drehen Sie die silberne Nabe im Uhrzeigersinn, bis es zweimal klickt. Füllen Sie die Verbindung durch den silbernen Hub im Uhrzeigersinn um weitere 45° drehen.
      Hinweis: Wenn die Faser nicht erkannt wird, überprüfen Sie, dass die FCFM imaging Faser wurde installiert und in der richtigen Ausrichtung verbunden.
    6. Folgen Sie den Anweisungen, die Pop-up für den Abschluss der FCFM imaging Faser Kalibrierung werden. Gibt es in 3 Schritten: (1) FCFM imaging Faser Test (Schritte 2.1.7 - 2.1.8), (2) Hintergrund Erwerb (Schritt 2.1.9), (3) Faser Erkennung (Schritt 2.1.10).
    7. Drücken Sie die "Start" Lasertaste auf dem Bildschirm. Der Laser wird zentriert.
    8. Wählen Sie frische Fläschchen (gelb: kalibrieren; rot: reinigen; blau: Spülen) aus der Kalibrierung kit und folgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm: das distale Ende der Faser in die gelbe Flasche imaging FCFM Platz und für die Erhöhung der Fluoreszenz auf dem Monitor zu sehen, dann legen Sie die Faserspitze in die rote Flasche (ohne Rühren). Warten Sie auf die Fluoreszenz (wie auf dem Computermonitor dargestellt) zu verschwinden. Zum Schluss Ausspülen der Faserspitze in der blauen Flasche.
      Hinweis: Wenn die Fluoreszenz nicht verschwindet, die FCFM Image Faser mit 8 % H2O2 und Linsenreinigung Gewebe zu reinigen und wieder beginnen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis zufriedenstellende Ergebnisse erzielt werden (die Bildqualität ist klar, und keine Spuren von Schmutz sind sichtbar).
    9. Legen Sie die imaging-Faser in der blauen Flasche FCFM. Drücken Sie die Taste "start Laser" gefolgt von "berechnen", wenn dies eine Option ist.
    10. Legen Sie die imaging-Faser in der gelben Flasche FCFM. Drücken Sie die Taste "start Laser" gefolgt von "berechnen", wenn dies eine Option ist.
    11. Während der automatischen Kalibrierung, reinigen Sie das distale Ende der Faser durch die Platzierung in der roten Flasche für imaging FCFM > 10 s, gefolgt von dem blauen Fläschchen für > 4 s, wie von der Software angegeben.
  2. Datenerfassung mit CLE
    1. Nach der Einrichtung öffnet sich ein Fenster, Lagerort und Datei-Präfix wählen. Wählen Sie den gewünschten Ordner zum Speichern von Daten, und benennen Sie das Präfix entsprechend.
    2. Legen Sie die Fußpedale, so dass sie leicht durch den Operator zugegriffen werden kann. Linkes Pedal: Laser ein/aus; Zentrum-Pedal: anhalten; rechten Pedal: Record/Stop.
      Hinweis: Die Laser-Steuerung können auch über Steuerelemente zugegriffen werden.
    3. Klicken Sie auf "Start" auf dem Bildschirm oder drücken Sie die linke Fußpedal zum Einschalten des Lasers. Dies startet Übernahme und Bilder mit 100 % Laserleistung und eine Bildrate von 12 Bilder/s (Default Einstellung) erhalten.
      Hinweis: Für andere Anwendungen können diese Einstellungen auf dem Bildschirm ggf. je nach Probentyp verändert werden.
    4. Jedes Bild der Bakteriensuspension Proben.
      1. Einfügen Sie das distale Ende der bildgebenden Faser FCFM und verschieben Sie die Faser langsam durch die Suspension, die Probe zu befragen.
      2. Videos von beliebiger Länge (bis zu 10 min) durch Drücken der rechten Fuß-Pedal oder Auswahl der Steuerelemente auf dem Bildschirm aufnehmen, da die Faser bewegt sich langsam um die Probe.
      3. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM imaging Faser mit 8 % H2O2 und Linsenreinigung Gewebe zwischen Proben.
        Hinweis: Typische video Längen von 10-30 s sind ausreichend für in-vitro- Bildgebung.
    5. Jedes Bild von der Lunge Gewebeproben.
      1. Legen Sie das distale Ende des FCFM imaging-Faser in die Probe, um sicherzustellen, dass direkter Kontakt zwischen dem Ende der Faser und des Gewebes erfolgt. Sanft bewegen Ende der bildgebenden Faser rund um die Probe zu verhören.
        Hinweis: Heben das Ende der Faser vom Gewebe wird das Gewebe von der Fokalebene entfernen; jedoch kann dies zur Bild beschrifteter Bakterien, die das Gewebe nicht eingehalten werden.
      2. Videos von beliebiger Länge (bis zu 10 min) durch Drücken der rechten Fuß-Pedal oder Auswahl der Steuerelemente auf dem Bildschirm aufnehmen, da die Faser bewegt sich langsam um die Probe.
        Hinweis: In der Regel video Längen von 30 s sind ausreichend für die ex-Vivo Bildgebung auf Gewebe.
      3. Reinigen Sie das distale Ende der FCFM imaging Faser mit Linsenreinigung Gewebe und 8 % H2O2 zwischen Proben.
  3. Ausschalten des Systems
    1. Schalten Sie den Laser aus, durch Drücken der linken Fußpedal oder indem Sie auf das On-Screen-Taste.
    2. Die CLE-Gerät trennen Sie die FCFM Image Faser durch Drehen des silbernen LSU Hubs gegen den Uhrzeigersinn bis zum Anschlag. Entfernen Sie die imaging-Faser aus der LSU-Hub durch leichtes Ziehen des LWL-Steckers von der LSU FCFM.
    3. Reinigen und desinfizieren der FCFM imaging Faser mit 8 % H2O2 und Linsenreinigung Gewebe. Das proximale Ende der FCFM imaging Faser und der Vorderseite des Referats LSU Schutzkappen zurückzukehren. Legen Sie die Faser sanft in die Aufbewahrungsbox.
    4. In der Nähe die Daten capture-Software und alle gespeicherten Dateien auf ein externes USB-Gerät kopieren. Fahren Sie den Computer herunter und schalten Sie die LSU-Gerät durch Drücken der Frontplatte I/O für 3 s bis das grüne Licht verschwindet.
    5. Menschliche Lungengewebe und Bakterien gemäß den örtlichen Bestimmungen entsorgen.

(3) Datenanalyse

  1. Öffnen Sie die Software und importieren Sie die Dateien für die Analyse, indem Sie das entsprechende Verzeichnis auf dem Computer durch das Symbol "Gehe zu" auf dem Dashboard Software auswählen. Alternativ können Dateien gezogen und ließ sich in der Software-Dashboard.
  2. Doppelklick auf jede Videodatei zu öffnen. Die Videos werden automatisch mit optimierten Color Lookup-Tabelle (LUT) spielen und Farbtabelle anpassen. Deaktivieren Sie die automatische Intensität skalieren, indem Sie auf die Schaltfläche "Zauberstab" oberhalb der Intensität Skala Bar. Die Funktion ist deaktiviert, wenn es gibt keine schwarzen Schatten um den Knopf.
    Hinweis: Automatische Intensität Skalierung muss deaktiviert werden, um zu verhindern, dass kontinuierliche Kontrastverstärkung in jedem Video, macht es unmöglich, vergleichen und analysieren Videos aus den gleichen Datenbestand.
  3. Wählen Sie die gewünschte Intensität Skalierung durch Verschieben der minimalen und maximalen Bars, den besten Kontrast zu geben. Verwenden Sie die Histogramm-Werkzeug, wenn Auswahl die Intensität Skalierung um den weitesten Dynamikbereich sicherzustellen erfasst wird.
    Hinweis: Sicherstellen, dass der dynamische Bereich ist derart, dass die Bilder nicht gesättigt sind (d. h. begrenzen die weißen Bereiche des Bilds, die Sättigung angeben), so dass niedrige Intensität Funktionen nicht übersehen werden.
  4. Sobald die gewünschte Skalierung erreicht worden ist, einen Rechtsklick über die Drop-Down-Menü-Taste als "Default (grün)" aufgeführt. Wählen Sie die Option zum Speichern der LUT. Speichern Sie die LUT an einem gewünschten Speicherort.
  5. Gelten Sie für jeden anderen video im Dataset die gleichen LUT mit der rechten Maustaste auf "Default (grün)" Dropdown-Menü und wählen Sie 'Load LUT'. Wählen Sie die entsprechende Datei anzuwendende einheitliche Intensität Skalierung auf alle Videos in ein Dataset.
  6. Exportieren Sie bearbeiteten Videos durch Klicken auf die Schaltfläche "Film Reel". Wählen Sie die gewünschte video-Format, z. B. "für Präsentationszwecke", die wird eine .mpg-Datei erzeugen. Tippe auf "Exportieren" und wählen Sie den Speicherort der Datei, die video-Datei zu speichern. Schnappschüsse von Einzelbildern können exportiert werden, klicken Sie auf "Kamera". Es ist möglich, eine .png, .bmp oder .jpg-Datei speichern. Wählen Sie die Datei und drücken Sie auf speichern.
    Hinweis: Videos können dann in jede Software für die Vorbereitung von Präsentationen oder weitere Quantifizierung importiert werden. Beschriftete Bakterien werden als grüne "blinken" Punkte im Video dargestellt. Die Lunge Gewebestruktur werden mit alveoläre Raum erscheinen schwarze als bestellten Fluoreszierende Fasern sichtbar.

Representative Results

In dieser Studie haben wir eine Methode für das Rapid-Screening der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden in einem ex-Vivo menschlichen alveoläre Lunge Gewebe Modell der Infektion mit einem klinisch zugelassenen CLE-Gerät gezeigt.

Von FCFM CLE eignet sich gut für den Erhalt der strukturellen Informationen innerhalb der distalen Lunge wie dieser Region (aufgrund einer hohen Häufigkeit von Elastin und Kollagen) ist natürlich stark fluoreszierende mit 488 nm Laser8angeregt. Umgekehrt, der alveoläre Raum nicht fluoreszieren und als solche ermöglicht hohe Kontrast zwischen Gewebestruktur und Luftraum sein dargestellt (Abbildung 1).

Die Zugabe von Krankheit bezogene Sonden oder Kontrastmittel, wie Bakterien-spezifischen Sonden funktionelle Informationen über Krankheitsprozesse in Echtzeit abgerufen werden sollen. Wir haben zuvor beschrieben die Synthese und erste in-vitro- Screening aus einer Bibliothek von Bakterien-spezifischen Sonden11; wo bakterielle-Spezifität, wurde proteolytischen Stabilität und Retention in der bakteriellen Membran im Laufe der Zeit ermittelt. Eine viel versprechende Bakterien-spezifischen Sonde (UBI-10) wurde innerhalb der Studie sowie die schlechte Bindung innerhalb der bakteriellen Zellmembran (UBI-3) zeigte identifiziert. Diese wurden zu einer Kontrolle der kommerziellen Gegenfärbung (Calcein AM) verglichen, die verwendet wurde, S. Aureuszu kennzeichnen.

Unbefleckt, wurden Calcein AM, UBI-3 und UBI-10 mit der Bezeichnung S. Aureus in der Schwebe von FCFM mit 100 % 488 nm Laserleistung und eine Bildrate von 12 Bilder/s (Abbildung 2) abgebildet. Wo unbeschriftete Bakterien in PBS abgebildet waren, war kein Fluoreszenzsignal nachweisbar. Dies steht im Gegensatz zu wann beschriftete Bakterien abgebildet waren. Wo bakterielle Suspensionen mit UBI-3 oder UBI-10 FCFM abgebildet waren, war es offensichtlich, dass die allgemeine Hintergrundfluoreszenz der Lösung wurde erhöht im Vergleich zu PBS nur Kontrollen, denn am nächsten Arbeitstag (die Sonde Fluorophor) eine kleine Menge emittiert Fluoreszenzsignal in wässriger Lösung, jedoch hellen punctata Punkte sind deutlich sichtbar in der gesamten Lösung, ohne die Notwendigkeit für ein Waschschritt. Dies ist durch einen Anstieg der Fluoreszenzsignal ausgesendet von NDB in einer polaren Umgebung also, die Bakterienmembran. Calcein AM ist keine aktivierbare Sonde, so dass ein Waschschritt nach bakteriellen Färbung erforderlich war, um den hohen fluoreszierende Hintergrund der ungebundene Prüfspitze in der Lösung zu entfernen. Wie UBI-3 und UBI-10 Bakterien mit Calcein AM beschriftet mit der Bezeichnung in Lösung von FCFM als helle grüne punctata Punkte erkannt wurden. Wie im video-Format die Daten erhoben werden, werden diese Punkte zu "funkeln", wie sie bewegen sich zwischen Kernen und der Fokus, ein charakteristisches Merkmal der bildgebenden beschrifteten Bakterien durch diese Methode-and-out angezeigt.

Die beschrifteten Bakterien wurden nachträglich hinzugefügt kleine Scheiben von ex-Vivo menschlichen Lungengewebe und wieder durch FCFM (Abbildung 3) abgebildet. Wo nur PBS oder unbeschrifteten S. Aureus des Lungengewebes hinzugefügt wurde, wurde nur die Lunge Autofluorescent Gewebestruktur erkannt (als helle grüne Stränge von Kollagen und Elastin und dunkle Bereiche des alveolären Raum gesehen). Keine punktförmige Punkte wurden für diese Kontrolle Bedingungen festgestellt. In ähnlicher Weise wurde nur Lungenkrebs Gewebe Struktur (und keine punktförmige Punkte) für die Lungenerkrankung Gewebe mit S. Aureus plus UBI-3 visualisiert; darauf hinweist, dass diese Sonde nicht stabil innen beibehalten wurde die bakterielle Zelle Membrane d.h., es wurde ausgewaschen und/oder wird in Anwesenheit von native proteolytische Enzyme innerhalb des Lungengewebes (als zuvor nachgewiesene11) abgebaut.

Allerdings waren helle punctata Punkte sichtbar in beide die Calcein AM Positivkontrolle S. Aureus Probe beschriftet und mit der vielversprechendsten Bakterien-spezifischen Sonde (UBI-10) S. Aureus Probe. Die "funkeln" Punkte waren sichtbar, trotz der starken Gewebe Autofluoreszenz (Abbildung 3). So die Ergebnisse von FCFM wurden in Übereinstimmung mit dem in-vitro- pre-Screening des Panels der Bakterien-spezifischen Sonden durch CLSM, und zeigte eine klinisch relevante Nachweismethode für Infektionen in Echtzeit-Bildgebung.

Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die Lunge eine entsprechende Organ-System für die Bildgebung von FCFM aufgrund seiner markanten Autofluoreszenz. Die hellen markante Strukturen ermöglichen dem CLE Bediener zu bestimmen, dass sie in den alveolären Raum. Diese Regionen, gepaart mit der dunklen alveoläre Luftsäcke bieten die perfekte Kulisse für imaging Eindringmittel beschriftete Bakterien mit hohem Kontrast.

Obwohl der Nachweis von Bakterien, die im Rahmen dieser Studie präsentiert qualitativ durch die Visualisierung hellen punctata Punkte bestimmt ist, könnte es möglich sein, beziffern die Zahl der punctata Punkte charakterisieren Frame für Frame mit einer sekundären Software um weitere Sonde Bibliotheken.

Figure 1
Abbildung 1: Statisches Bild der menschlichen Lunge Gewebe Autofluoreszenz. Konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) Bild der ex Vivo menschlichen Lungengewebe mit kurzfaserigen konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM), bei 488 nm Anregung, 100 % Laserleistung und 12 Frames/s. Elastin und Kollagen sind stark fluoreszierend (false grün gefärbt), während alveoläre Raum nicht, und als schwarzer Regionen erscheint. Diese Zahl wurde von Akram Et al.modifiziert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) Bild von beschrifteten S. Aureus in der Schwebe. Geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) wurde verwendet, um bereits beschriftete Bakterien Bild, bei 488 nm Anregung, 100 % Laserleistung und 12 Frames/s. etikettierte Bakterien zeigen als stark fluoreszierende punctata Punkte (falsche grün eingefärbt). Diese Zahl wurde von Akram Et al.modifiziert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Figure 3
Abbildung 3: Konfokale Laser Endomikroskopie (CLE) Bild der ex Vivo menschlichen Lungengewebe mit beschrifteten S. Aureus. Geädert konfokale Fluoreszenzmikroskopie (FCFM) wurde verwendet, um Bild ex Vivo menschlichen Lungengewebe und S. Aureus, bei 488 nm Anregung, 100 % Laserleistung und 12 Frames/s. etikettierte Bakterien zeigen als stark fluoreszierende punctata Punkte (falsche farbig gekennzeichnet grüne) innerhalb der Lunge Gewebeprobe wenn mit Calcein AM oder UBI-10 bezeichnet. Der höchste Kontrast wird beobachtet, wo Bakterien innerhalb der alveolären Raum abgebildet werden. Diese Zahl wurde von Akram Et al.modifiziert. 11 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.  

Discussion

Infektionen der unteren Atemwege entfallen die zweite höchste Krankheitslast weltweit12,13, und ein wesentlicher Anstieg der Zahl der Infektionen antimikrobiell resistenter Bakterien zugeschrieben gemeldeten14wurde. Lungenentzündung ist eine häufige Ursache für Krankenhausaufenthalte. Auf der Intensivstation die Entwicklung einer Lungenentzündung wird durch diagnostische Unsicherheit verstärkt und eine extrem hohe Sterblichkeit Rate15zugeordnet ist. Während der Beginn der Pneumonie vermehren sich Bakterien alveoläre innerhalb der distalen Lunge, ein Gebiet, das relativ steril, mit minimalen Mikrobiota in Gesundheit.

Diese Methode beschreibt relativ späten Stadium ex Vivo Validierung von Bakterien-spezifische optische bildgebende Sonden11, aber das Design, Synthese und Sonde Bewertung vor Beginn dieser Überprüfungsschritt ist zwingend erforderlich, als bisher gezeigte11 .

CLE ist eine aufstrebende klinische Technik für Verhören Krankheit in Situ in Echtzeit. Es bietet viele Vorteile gegenüber traditionellen Techniken für die Untersuchung von mutmaßlichen pulmonale Pathologie, die eine Biopsie und Ansammlung der Lavage-Flüssigkeit mit einbeziehen kann. Biopsien sind invasiv und Morbidität und Mortalität bei beatmeten Patienten verursachen können, und gesammelten Lavage-Flüssigkeit ist oft verseucht mit Bakterien aus den oberen Atemwegen. Die Verwendung von CLE bei der Erfassung der Lungenentzündung ist allerdings etwas begrenzt verfügbar, wegen der schlechten Verfügbarkeit von kompatiblen Bildgebung Sonden die Krankheit trotz viele gemeinsame Anstrengungen10funktionelle informieren kann. Kombination von CLE mit optischen Mitteln bietet die Aussicht auf eine Diagnose von Pneumonie schneller und weniger invasiv im Vergleich zu aktuellen gängige Praxis.

Die entscheidenden Schritte zu diesem Protokoll sind in die Vorbereitung der Probe und das Setup der CLE-Plattform. Erlangung von menschlichem Gewebe für die endgültige klinische Anwendung relevant ist auch wichtig, wie menschliche Lungengewebe wie im Rahmen dieser Studie gezeigt. Es ist notwendig, menschliches Gewebe zu verwenden, weil das Ausmaß der Gewebe Autofluoreszenz große Inter-Spezies-Variation zeigt, und kann daher in die Irre führen die Empfindlichkeit der Bakterien-Sonde wird abgebildet. Darüber hinaus ist es wichtig, Ethik für Abruf und Nutzung von menschlichen Lungengewebe zu erhalten. Aus einer technischen Ebene, korrekte Reinigung ist die Befestigung der bildgebenden Faser an der LSU Bildgebungsplattform und Kalibrierung wichtig für gute Auflösung und konsequente Bildgebung, da sichergestellt ist, dass jede Lunge Gewebeprobe gleichwertigen Anzahl von Bakterien hinzugefügt werden. Um das Dienstprogramm dieser Methode für das screening von Platten der Sonden zu erweitern, ist es notwendig, wiederholen das Verfahren mit einer Reihe von Krankheitserregern, wie die Erreger von Lungenentzündung voraussichtlich.

Die größte Einschränkung dieser Technik ist, dass die klinisch zugelassene CLE-Gerät nur einen Laser hat (488 nm). Daher beschränkt sich derzeit, die Auswahl der Fluorophor für Sonde Design für den Einsatz mit diesem System, obwohl klinisch Einzelfarbe zugelassen, was mit Erregung Wellenlängen von 660 nm und Nah-Infrarot-Geräte vorhanden sind. Es ist höchst wünschenswert, eine zweite Laserlinie innerhalb des gleichen Gerätes ermöglichen eine Sonde mit einem spektral unterschiedliche Fluorophor Verbesserung der Empfindlichkeit der Bakterien-Sonde über die Höhe der Gewebe Autofluoreszenz entwickelt werden umgesetzt haben. Während zwei-Farben-CLE-Geräte in der Entwicklungsphase befinden, sie sind entweder nicht klinisch zugelassen und/oder ihre Kosten sind bedeutende16.

CLE in Vitro mit pathogenen Bakterien und ex Vivo menschlichen Lungengewebe zu potenziellen Sonden Bildschirm schließt die Lücke zwischen herkömmlichen in-vitro- Techniken wie Durchflusszytometrie und CLSM und klinischen Nutzen. Dieser Schritt bietet Vertrauen bei der Auswahl der vielversprechender Verbindungen, voranzutreiben, um Verbindung mit klinischen CLE imaging; und geben Hinweis darauf, ob die getestete Sonde unterhält Ziel Spezifität oder zeigt Ziel-Kennzeichnung, z. B. Bindung direkt an Gewebe, oder zeigt Instabilität mit proteolytische Enzymen. Es wäre auch für jede der aktivierbare Sonden direkt Proben menschlichen Lungengewebe sowie Bakterien, zur vollständigen Charakterisierung die Geschwindigkeit der Sonde Bindung und Aktivierung in Echtzeit hinzufügen.

Wir glauben, dass unsere Pipeline für das screening von rasch neue Bakterien-spezifischen Sonden um ihr Potenzial für die Bildgebung in der distalen Lunge des Patienten beurteilen viel schneller Übersetzung in die Klinik führt. Dies ist vor allem, weil die Bakterien-spezifischen Sonde innerhalb der Lunge durch Katheter nach unten den Arbeitskanal des ein Bronchoskop, was bedeutet, dass Microdose lokal zugestellt werden konnte (< 100 µg) Mengen geliefert werden könnte. Daher ist systemische Liefer- und Bioverteilung der Verbindung kein Anliegen, wie für viele andere Ziele Infektion innerhalb des Körpers oder mit nuklearen Bildgebung der Fall ist. Darüber hinaus liefert die bildgebende Sonde in eine kleine Dosis verringert das Risiko von Toxizität im Zusammenhang mit Komplikationen (obwohl Toxizität Screening für Übersetzung erforderlich wäre). Nach Instillation von der Sonde könnte der Katheter dann ersetzt werden, von FCFM Faser und der gleichen Region der Lunge verhört von CLE, viel die gleiche Weise, die wir innerhalb dieser Methode ausgeführt haben. Bildgebung sollte schnell nach Einbau der Sonde, bevor die Sonde nicht nachweisbare Konzentrationen wäscht durchgeführt werden.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass Screening der Identifizierung von Krankheiten Sonden durch diese Technik sollte nicht auf bakterielle-Bildgebung Agenten beschränkt sein, sondern könnte erstreckt sich auch auf die Validierung der Sonden mit alternative Ziele, wie z. B. Entzündung. Dieser Ansatz muss auch an andernorts Krankheit innerhalb des Körpers angepasst werden wo Bildgebung über FCFM zulässig ist.

Disclosures

KD: Gründer-Direktor des Edinburgh molekulare Bildgebung. Empfangene Beratung von Mauna Kea Technologies als Berater.

MB: Gründer-Direktor des Edinburgh molekulare Bildgebung.

Acknowledgments

Wir möchten danken Engineering und interdisziplinären Forschungszusammenarbeit Physical Sciences Research Council (EPSRC, Vereinigtes Königreich) Zuschuss EP/K03197X/1, das Department of Health und Wellcome Trust durch Health Innovation Challenge Fund (HICF) . Finanzierung Referenznummer: 0510-069.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

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References

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Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf <em>Ex Vivo</em> menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie
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Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).More

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

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