Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על לשעבר Vivo רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy

Published: November 29, 2017 doi: 10.3791/56284
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1EPSRC Proteus Hub, MRC Centre of Inflammation Research, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2School of Chemistry, EaStChem, University of Edinburgh

Summary

טכניקה זו מתארת תהליך סינון יעיל להערכת סוכני דימות אופטי חיידקים ספציפיים בתוך שמחוץ רקמת הריאה האנושי, על-ידי קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית fibered מיקרוסקופ עבור זיהוי מהיר של מולקולה כימית קטנה בדיקה-מועמדים בעלי פוטנציאל לתרגום.

Abstract

לשפר את המהירות והדיוק של זיהוי חיידקים חשוב עבור המטופל ריבוד ולהבטיח שימוש נאות antimicrobials. כדי להשיג מטרה זו, התפתחות טכניקות אבחון לזהות נוכחות חיידקים בזמן אמת-הנקודה של הטיפול נדרש. הדמיה אופטית עבור זיהוי ישיר של חיידקים בתוך המארח היא גישה אטרקטיבית. מספר ניסיונות אימות ועיצוב בדיקה כימית נחקרו, אולם אף אחד עדיין בהצלחה תורגמו המרפאה. כאן נתאר שיטת אימות ex-vivo של חיידקים ספציפיים זונדי זיהוי של החיידקים בתוך הריאות הדיסטלי, עם תמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה fibered (FCFM). המודל שלנו משמש שמחוץ רקמת הריאה אנושי ובעל פלטפורמה endomicroscopy (לנקות) לייזר קונפוקלי רפואית אישרה מסך הרומן חיידקים ספציפיות הדמיה תרכובות, מקרוב מחקה הדמיה תנאים צפוי נתקל עם מטופלים. לכן, הקרנת תרכובות באמצעות הטכניקה הזו מספקת ביטחון של פוטנציאל קליני ללקוחות שלנו.

Introduction

טכניקה זו מתארת תהליך מיון מהיר להערכת סוכני דימות אופטי חיידקים ספציפיים בתוך שמחוץ רקמת הריאה האנושית על ידי לנקות באמצעות FCFM עבור זיהוי מהיר של תרכובות עם פוטנציאל קליני כלי להמחשת חיידקים הריאות דיסטלי בתוך באתרו.

אין הדרישה העולמית דחוף לקצוב יגרור מיקרוביאלית בעידן של עמידות מיקרוביאלית העולה1. למטרה זו, פיתוח שיטות אבחון איזה מעשה כדי לזהות זיהום חיידקי עם ירידה לפרטים גבוהה, רגישות, בזמן אמת הם מאוד ביקשו2. טכניקות הנוכחי כדי לאשר אבחנה של דלקת ריאות בחולים אנושות ברע, כגון אלה בתוך יחידות טיפול נמרץ (וההשתלות), לעיתים קרובות לסמוך על לפרש תכונות קליני או רדיולוגית שאינם ספציפיים לצד התרבות חיידקי טכניקות מן aspirated נוזלים/רקמות, אשר יכול לקחת עד 3 ימים כדי להפיק תוצאות. יתר על כן, התרבות חיידקי של נוזל שהוחדרו לתוך הריאה הדיסטלי, לאחזר נוטה זיהום איירווייז יותר מקורב3 לעתים קרובות תרבות שליליות עקב טיפול מיקרוביאלית והמצוות או שיטות הדגימה המסכן. בנוסף, טכניקות מולקולריות כגון תגובת שרשרת פולימראזית רגישים יתר על המידה בעת שימושו aspirated נוזלים, מסכן overtreatment של חולים. גישה אבחון המתעוררים היא הדמיה אופטית מולקולרית, עושה בחיי עיר פתולוגיה מולקולרית של רקמות אפשרות; עם זאת, הפיתוח ואת האימות של תרכובות דימות אופטי נדרש. למרות זאת, פריט חזותי ישיר של חיידקים, דרך activatable הגששים אופטי הוא פוטנציאל שיטה רבת עוצמה כדי לאפשר המחקר של הנוכחות, התפתחות דלקת ריאות אצל המטופל, וחשוב, ניתן להשתמש ללמוד באינטראקציה פתוגן-פונדקאי בתגובה טיפולים בזמן אמת באתרו.

דוד הוא הליך חקירה הוקמה מספר מחלות4, כולל בתוך השדה של גסטרואנטרולוגיה5, אונקולוגיה6,7, ועבור חוקרים איירווייז ושקי מכתשי8, 9. זה מאפשר בשלב של טיפול המבניות של רקמה חולה באמצעות סיבים הדמיה הצרור, העובר דרך ערוץ עבודה של אנדוסקופ קליני ולכוון טפסים עם המשטח רקמות לדימות מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית. אולם, מגבלה אחת הנשאר הוא בצורך סוכנים בניגוד כלליים. לכן, השימוש של הגששים ספציפי למחלה, כגון סוכנים חיידקי ספציפי, יכול להרחיב במידה רבה את. התועלת הזה מודאליות ישירות דמיין חיידקים באתר של חשד לזיהום. סוכנים אופטי מציעים יתרונות רבים על פני שיטות אחרות על-ידי הפיכת הדמיה ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת עם אבחון פוטנציאל. יתר על כן, הגששים אופטי מציעים הסיכוי ריבוב לחקירת מטרות מרובות, כל מושגת בעלות נמוכה יחסית. מספר סוכני אופטי נמצאים בפיתוח למטרה כזו, אולם אף אחד עדיין בהצלחה יושמו במסגרת מרפאת ה-10. לנו יש מסונתז ספריה של הגששים כימי מולקולה קטנה עם ירידה לפרטים לקראת חיידקים ופיתח קו צינור מהירה, יעילה להערכת הפונקציה בדיקה לזיהוי דלקת ריאות חיידקית בחיי עיר11.

כדי לזהות את המועמדים בדיקה מתאימה, הדרישות המוקדמות הבאות היה צריך למלא לפני חקירתם של המכשיר ב- ex-vivo רקמת הריאה האנושי FCFM: מסיסות מימית i), ירידה לפרטים ii), סלקטיביות במהירות סימון קלינית חיידקים הרלוונטיים, iii) יחס אות לרעש גבוה, ו- iv) התנגדות השפלה בסביבת ריאות. האחרון היה מוערך על ידי נוזל שטיפה bronchoalveolar (BALF) של חולים עם תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), אשר היא מחלה המאופיינת וסביבות הפרוטאוליטי דלקתי בריאה בטיפול נמרץ. יתר על כן, הגששים היה fluorophore מתאים לגילוי על ידי רפואית אישרה אופטי לנקות הדמיה מכשיר בתוך רקמת מכתשי אמבריולוגיה.

הצינור לחקור כל אחד את הדרישות המוקדמות הבאות היתה כדלקמן (בכל שלב, רק הגששים שעברה בוצעו קדימה הבא): (1) ספרייה של הגששים להיחקר היה מסונתז; (2) כל בדיקה נוספה על פאנל של חיידקים חיים לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) כדי להבטיח תיוג חיידקי; (3) סלקטיביות של תיוג חיידקים בתרבית של תאים בתרבויות שיתוף עם ראשי נויטרופילים אנושי נוסדה על ידי CLSM; (4) יציבות ולקרוא מוצלחת של חיידקים בנוכחות המטופל ARDS BALF נקבע ע י CLSM / מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון-שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית; (5) ריכוז אופטימלי של מועמדים נקבע ע י CLSM, להבטיח סלקטיביות עבור חיידקים בתרבית של תאים נשמר; (6) המועמדים היו עם תמונה על-ידי FCFM ההשעיה, ב- ex-vivo האנושי מכתשי רקמת הריאה כדי להבטיח יציבות וכי האות לרעש היה הולם לצורך זיהוי. שלב 6 מתואר בפירוט בתוך פרוטוקול זה. מתודולוגיה שלבים 1-5 כבר שדווחה בעבר11.

Protocol

כל רקמת הריאה האנושי הושג בעקבות הסכמה מדעת, המחקר אושרה על ידי ועדת האתיקה אזוריים.

1. הכנת דגימות ביולוגיות

  1. הכנה של הגששים
    1. להמציא פתרון מניות 1 מ מ של כל בדיקה (למשל, Calcein AM, UBI-3, UBI-10, וכו) dH סטרילי2O, באמצעות איזון עדין לשקול את הליחה בדיקה מורכבת11. חישוב הנפח של dH2O להוספת בהתבסס על מסה שנשקל משקל מולקולרי של המכשיר.
  2. הכנת תרביות חיידקים
    הערה: עבור שיטה זו, Staphylococcus aureus שימש המתח המיתר. ניתן לבחור כל זן חיידקי המתאים. ניתן לבחור כל צבע מסחרי שמתייג חיידקים המתאימים עירור, ספקטרום הפליטה לתייג באופן חיובי את החיידקים.
    1. בחר מושבה בודדת של זן חיידקי הרצוי מתוך צלחת אגר Lysogeny מרק (LB) טריים באמצעות לולאה סטרילי. לחסן את המושבה לתוך 10 מ"ל של ק ג בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל בטבילת סוף הלולאה לתוך תרבות התקשורת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד עבור 16 h (או לילה).
    2. לקבוע את יתר595 של התרבות לילה על-ידי הוספת 100 µL של התרבות לילה µL 900 ק ג ב cuvette 1 מ"ל. למדוד OD-595 nm (באמצעות cuvette של 1 מ ל LB ריקים) בספקטרופוטומטר. הכפל OD שהושג ב- 10 כדי להשיג OD לתרבות לילה.
    3. תת-תרבות התרבות בין לילה. עושים זאת על ידי התאמת הצפיפות האופטית-595 nm (OD595) עד 0.1 ב 10 מ"ל של טרי LB. לחשב את הנפח הנדרש של תרבות לילה להוסיף 10 מ ל LB טריים כדי להתאים את יתר595 ל 0.1. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד עד התרבות מגיע שלב אמצע יומן (OD-595 0.6 - 0.8) כ- 4 שעות.
    4. מודדים את צפיפות אופטית תרבות (שלב 1.2.2) והמושבה קציר 1 x 108 ויוצרים יחידות (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) של התרבות חיידקים לתוך 1.5 mL microtube (למשל, אם התרבות חיידקי OD595 0.6, לאסוף מ ל 1.67). Centrifuge התרבות ב g x 10,000 בטמפרטורת החדר במשך 1 דקה הצניפה החיידקים. לשטוף גלולה פעמיים בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) על ידי resuspending (pipetting למעלה ולמטה בזהירות) בגדר 1 מ"ל PBS, צריך שתוציאו לעיל, השמטת את תגובת שיקוע ו חוזרות. . שמור על עצמך לא להוציא בגדר חיידקי בעת הסרת את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר הסופי ב 1 מ"ל PBS.
      הערה: להכין דוגמאות רבות כנדרש עבור כל פרוצדורה תיוג. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה לשעה עד ואחריו שלב 1.2.5.1, 1.2.5.2 או 1.2.5.3.
    5. צביעת חיידקי
      1. להוספת תווית החיידקים עם Calcein AM, להוסיף לצבוע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר לתוך התרבות חיידקי שטף. דגירה התרבות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-300 סל ד. לשטוף את המתלים חיידקי counterstained PBS 3 פעמים על ידי צנטריפוגה כמו שלב 1.2.4 כדי להסיר צבע עודף. Resuspend ב 1 מ"ל PBS, לדלל 100 µL 1:1 ב- PBS כדי לקבל 200 µL של יתר595 0.5 Calcein אני מוכתם חיידקים. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה עבור עד 1 h.
      2. להוספת תווית החיידקים עם מבחן רגשים (למשל, UBI-3 או UBI-10), לדלל 100 µL של התרבות חיידקי 1:1 ב- PBS להשיג OD-595 -0.5 ב 200-µL PBS. הוסף שבאחת הגששים כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. להפוך את microtube מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי של החיידק, החללית.
        הערה: הדמיה צריכה להתבצע מיד לאחר התוספת של המכשיר כדי לחקות את התרחיש קליניים.
      3. כדי להכין את הפקד דגימות בקטריאליות וללא רבב, שתדללו 100 µL של תרבות 1:1 עם PBS כדי לקבל 200 µL של וללא רבב כמנת מדגם595 0.5.
  3. הכנה של ex-vivo רקמת הריאה אנושי
    הערה: דגימות רקמה אמבריולוגיה, התקבלו חולים שעברו כריתה כירורגית עבור קרצינומה של הריאה. כל רקמה המשמש הדמיה הושג מדגימות של רקמת הריאה נורמלי מן הגידול הסרטני. דוגמאות שצולמו טריים מן התיאטרון ההפעלה ומאוחסנים צינורות microtubes או צנטריפוגה ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
    1. מיד לפני הדמיה, הסר את דגימת רקמה אמבריולוגיה מהמקפיא בקרח יבש. בטמפרטורת החדר, לאפשר את הרקמה להפשיר מעט; רק מספיק כדי להיות פרוס עם איזמל למקטעים2 1 x 4 מ מ.
      הערה: רמת מפשיר חשובה; גם קפוא הרקמה לא יחתוך ללא סתתים, גם הקרת ואת הרקמה רכה מדי לחתוך.
    2. באמצעות מלקחיים, למקם את רקמת הריאה האנושי הפרוס בארות של צלחת תרביות רקמה 96-ובכן ברור שטוח התחתונה. לחזור כל רקמה מהריאה אנושיים שאינם בשימוש מיד למכולה והמקום בקרח יבש למשלוח חזרה אל המקרר-80 ° C.
    3. להוסיף 100 µL PBS כל מדגם רקמת הריאה עם פיפטה. שימוש בקצה פיפטה כדי להבטיח כל הרקמה הוא מכוסה מגניב (וגם לא תקועות דפנות הבאר). הרקמה יתנפח מעט ואני יכול לעוף. להשאיר את PBS המדגם לכמה דקות לאפשר דם תסנן מן הרקמות אל הפתרון. להסיר כמה שיותר טוב, מגניב. הרקמה עלול לחסום את הסוף של קצה פיפטה; לנסות זווית הצבת צלחת/טיפ על מנת למנוע זאת.
    4. פיפטה µL 100 של וללא רבב, Calcein אני עם התווית או מבחן-בדיקה שכותרתו לחיידקים כל טוב המכיל רקמת הריאה. גם להגדיר את הפקדים עם רקמת הריאה, 100 µL PBS. כדי שליטה הבארות הללו ניתן להוסיף הגששים ללא חיידקים כדי למדוד כל גידול פלורסצנטיות רקע ו/או שאינם ספציפיים ההפעלה של המכשיר על ידי רקמת הריאה לבד. טוב עם רקמת הריאה, PBS גם צריך להיות כלול.

2. הדמיה עם המכשיר לנקות עם FCFM

  1. להגדיר את המכשיר לנקות
    הערה: להכין את המערכת לנקות 20 דקות לפני הכיול כדי לאפשר את הלייזר להתחמם.
    1. הקש את מתג הפעלה/כיבוי על הגב של השנאי של המערכת, הפעל את המחשב המיועד. לחץ על לחצן הפעלה/כיבוי על החלק הקדמי של הלייזר סריקה יחידה (LSU). לאשר את המראה של אור ירוק, המציין כי היחידה פעילה.
    2. לחץ פעמיים על סמל התוכנה לנקות. הזן את פרטי ולחכות LSU לאתחל (10-30 s).
    3. לשימוש FCFM חדש הדמיה סיבים, הכרחי התקנה עם התקליטור שסופקו. להכניס את תקליטור ההתקנה לכונן התקליטורים של המחשב, בצע את ההוראות שעל-גבי המסך.
    4. נקה FCFM הדמיה סיבים מחבר היחידה עם בד נקי יותר. לשפשף את המחבר ברצועת הכלים ניקוי בתנועה קדימה כדי להסיר אבק/לכלוך. הסר את המכסה המגן צהוב בחזית LSU.
    5. הכן את הרכזת LSU על ידי בעדינות סיבוב נגד כיוון השעון הרכזת כסף עד לעצירתו. הכנס את מחבר סיבים הדמיה FCFM לתוך ה-hub עם הצד השטוח של המחבר כלפי מעלה. מחזיקים הסיבים במקומו וסובב הרכזת כסף עם כיוון השעון עד שתינעל פעמיים. להשלים את החיבור על-ידי סיבוב בכיוון השעון הרכזת כסף מאת נוספת 45°.
      הערה: אם הסיבים אינו מזוהה, בדוק כי FCFM הדמיה סיבים הותקנה והיתה מחובר לכיוון הנכון.
    6. בצע את ההוראות כי מוקפץ להשלמת את FCFM הדמיה סיבים כיול. יש 3 שלבים: (1) FCFM הדמיה סיבים מבחן (שלבים 2.1.7 - 2.1.8 תגובה על), (2) רקע רכישה (שלב 2.1.9), (3) סיבים זיהוי (שלב 2.1.10).
    7. לחץ על לחצן 'התחל לייזר' על המסך. הלייזר יהיה מרכז.
    8. בחר בקבוקונים טריים (צהוב: לכייל; אדום: לנקות; כחול: שטיפה) מ הכיול ערכת ובצע את ההוראות שעל-גבי המסך: מקום בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון צהוב, לצפות לגידול זריחה על הצג ולאחר מכן מקם עצה סיבים לתוך הבקבוקון אדום (ללא ערבוב). המתן קרינה פלואורסצנטית (כפי שמוצג על מסך המחשב) להיעלם. סוף סוף יש לשטוף את הטיפ סיבים בבקבוקון כחול.
      הערה: אם ידי קרינה פלואורסצנטית אינה נעלמת, לנקות FCFM סיבים הדמיה עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות ולהתחיל שוב. חזור על התהליך עד תוצאות משביעות רצון מתקבלים (איכות התמונה לא ברורה, אין סימני לכלוך ניכרים).
    9. מניחים את FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון כחול. לחץ על "התחל לייזר" ואחריו "לחשב" הזה הופך אופציה.
    10. מניחים את FCFM הדמיה סיבים לתוך הבקבוקון צהוב. לחץ על "התחל לייזר" ואחריו "לחשב" הזה הופך אופציה.
    11. במהלך הכיול האוטומטי, נקה בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים על-ידי הצבת בבקבוקון אדום עבור > 10 s, ואחריו את המבחנה כחול עבור > 4 s, כמצוין על-ידי התוכנה.
  2. איסוף הנתונים עם דוד
    1. לאחר ההתקנה, יפתח חלון לבחירת מיקום האחסון של קובץ קידומת. בחר את התיקיה הרצויה עבור אחסון הנתונים, ותנו שם את הקידומת בהתאם.
    2. המקום דוושות רגל על כך שהם ניתן לגשת בקלות על ידי המפעיל. הדוושה השמאלית: לייזר/ביטול; מרכז הדוושה: להשהות; נכון פדלים: שיא/הפסק.
      הערה: הפקדים לייזר ניתן גם לגשת באמצעות הפקדים על-גבי המסך.
    3. לחץ על 'התחל' על המסך או לחץ על הדוושה כף הרגל השמאלית כדי להפעיל את הלייזר. זה להתחיל רכישה ולקבל תמונות באמצעות עוצמת הלייזר 100% וקצב 12 מסגרות לשנייה (הגדרות ברירת המחדל).
      הערה: עבור יישומים אחרים, הגדרות אלה ניתן לשנות על המסך במידת הצורך, בהתאם לסוג הדגימה.
    4. תמונה כל הדגימות ההשעיה חיידקי.
      1. הכנס בקצה הדיסטלי של סיבים הדמיה FCFM ולהעביר סיבים באיטיות דרך ההשעיה לחקור את הדגימה.
      2. להקליט קטעי וידאו בכל אורך (עד 10 דקות) על-ידי לחיצה על דוושת רגל ימין או בחירת רשומה הפקדים על-גבי המסך, כמו הסיבים נע לאט סביב המדגם.
      3. נקה הסוף דיסטלי של סיבי FCFM הדמיה עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות בין הדגימות.
        הערה: אורכי וידאו אופייני של 10-30 s מספיקים עבור הדמיה במבחנה .
    5. תמונה כל הדגימות רקמת הריאה.
      1. הכנס בקצה הדיסטלי של FCFM הדמיה סיבים לתוך הדגימה, כדי להבטיח כי נוצר קשר ישיר בין הסוף של סיבי הרקמה. להניע בעדינות את הקצה של סיבים הדמיה סביב לחקור את הדגימה.
        הערה: הרמת הסוף של סיבי מן הרקמה יהיה להסיר את הרקמה מהמטוס מוקד; עם זאת, זה עשוי לשמש לשיקוף שכותרתו חיידקים, כי הם לא דבקו הרקמה.
      2. להקליט קטעי וידאו בכל אורך (עד 10 דקות) על-ידי לחיצה על דוושת רגל ימין או בחירת רשומה הפקדים על-גבי המסך, כמו הסיבים נע לאט סביב המדגם.
        הערה: בדרך כלל, וידאו אורך 30 s מספיקים עבור ex-vivo הדמיה על רקמות.
      3. נקה בקצה הדיסטלי של סיבים הדמיה FCFM עם עדשה ניקוי רקמות ו- 8% H2O2 בין הדגימות.
  3. כיבוי המערכת
    1. כבה את הלייזר. על-ידי לחיצה על דוושת רגל שמאל או על-ידי לחיצה כפתור על המסך.
    2. נתק סיבים הדמיה FCFM לנקות את המכשיר על-ידי הפעלת ה-hub LSU כסף התרחקותו עד לעצירתו. הסר את FCFM הדמיה סיבים מהרכזת LSU על ידי משיכה עדינה המחבר סיב מ LSU.
    3. לנקות ולחטא סיבים הדמיה FCFM עם 8% H2O2 ו עדשה ניקוי רקמות. להחזיר את כובעי מגן סוף סיבים הדמיה FCFM הפרוקסימלית של החלק הקדמי של יחידת LSU. מקום הסיבים בעדינות תיבת אחסון.
    4. סגור הנתונים ללכוד התוכנה והעתק קבצים שנשמרו אל התקן USB חיצוני. כבה את המחשב וכבה את המכשיר LSU על ידי לחיצה על הלוח הקדמי קלט/פלט עבור 3 s עד האור הירוק נעלם.
    5. תשליך רקמת הריאה האנושי וחיידקים על פי תקנות מקומיות.

3. ניתוח נתונים

  1. לפתוח את התוכנה וייבא את הקבצים עבור ניתוח על-ידי בחירת הספריה המתאימה במחשב דרך הסמל 'ללכת' על לוח המחוונים בתוכנה. לחלופין, קבצים יכולים להיות הנגררת ומשוחררת לתוך לוח המחוונים בתוכנה.
  2. לחץ פעמיים על כל קובץ וידאו כדי לפתוח אותם. קטעי וידאו יופעלו באופן אוטומטי עם טבלת בדיקת מידע צבע ממוטב (LUT) ולהתאים טבלת צבע. בטל את עוצמת אוטומטי שינוי קנה מידה, על ידי לחיצה על לחצן שרביט מעל סרגל קנה מידה בעוצמה. התכונה אינה זמינה כאשר אין צל שחור סביב הלחצן.
    הערה: שינוי גודל אוטומטי בעוצמה לבטלו כדי למנוע שיפור ניגודיות רציפה לאורך כל וידאו, ואי אפשר להשוות ולנתח את קטעי וידאו מ מאותה ערכת נתונים.
  3. בחר את העוצמה הרצויה שינוי גודל על-ידי הזזת פסי מינימום ומקסימום לתת את הניגודיות הטובה ביותר. הכלי היסטוגרמה בעת בחירת עוצמת שינוי קנה מידה כדי להבטיח את הטווח הדינמי הרחב ביותר הוא נתפס.
    הערה: ודא כי הטווח הדינמי הוא כזה כי התמונות לא רוויים (דהיינו להגביל את האזורים הלבנים של התמונה, אשר מצביעים על רוויה), כך תכונות בעצימות נמוכה הם לא החמיצו.
  4. לאחר שינוי הגודל הרצוי השיגה, הימני, לחץ על לחצן התפריט הנפתח מופיע בתור 'ברירת מחדל (ירוק)'. בחר באפשרות כדי לשמור על פבואר. שמור את LUT במיקום הרצוי.
  5. אחד לשני הסרטונים בתוך ערכת הנתונים, להחיל את LUT אותו על ידי לחיצה ימנית על התפריט הנפתח 'ברירת מחדל (ירוק)', בחר "טען LUT". בחר את הקובץ המתאים כדי להחיל בעוצמה עקבי דרוג כל וידאו בתוך dataset.
  6. ייצוא וידאו מעובד על-ידי לחיצה על לחצן 'קטע סרט'. בחר תבנית הווידאו הרצוי, למשל 'למטרות מצגת', אשר יהיה לייצר קובץ במקרים רבים. לחצו על 'ייצוא' ובחרת מיקום הקובץ כדי לשמור את קובץ הווידאו. ניתן לייצא תמונות של מסגרות יחיד על-ידי לחיצה על לחצן 'מצלמה'. זה אפשרי לשמור קובץ. png, bmp או. jpg. בחר את מיקום היעד של הקובץ ולחץ על שמור.
    הערה: סרטונים ואז ניתן לייבא לתוך תוכנה הכנת מצגות או יותר כמת. חיידקים שכותרתו הם דמיינו כנקודות ירוק 'מהבהב' וידאו. מבנה רקמת הריאה יהיו לכאורה כמו גדילי פלורסנט מסודרות, עם שטח מכתשי המופיעים שחור.

Representative Results

במחקר זה, הראו שיטה המהירה-הקרנת הרומן הגששים חיידקים ספציפיות במודל שמחוץ אמבריולוגיה מכתשי רקמות של זיהום באמצעות התקן לנקות רפואית אישרה.

דוד מאת FCFM הוא גם מתאים להשגת מידע מבניים בתוך הריאות הדיסטלי, כמו אזור זה (בגלל שפע גבוהה אלסטין וקולגן) הוא באופן טבעי מאוד פלורסנט כשהוא מתרגש עם 488 ננומטר לייזר8. לעומת זאת, הרווח מכתשי לא לזרוח, ובתור שכזה מאפשר חדות גבוהה בין מבנה רקמות המרחב האווירי להיות דמיינו (איור 1).

התוספת של מחלות הקשורות הגששים או סוכנים בניגוד, כגון חיידקים ספציפיים הגששים צריך לאפשר פונקציונלי מידע על תהליכי מחלה ואפשר להשיג בזמן אמת. בעבר תארנו את הסינתזה של ההקרנה הראשונית במבחנה של ספריה של חיידקים ספציפיים רגשים11; איפה בקטריאלי-ירידה לפרטים, נקבע הפרוטאוליטי יציבות ושמירה בתוך קרום חיידקי לאורך זמן. בדיקה ספציפית חיידקים מבטיח (UBI-10) זוהה בתוך המחקר, כמו גם אחד הראה השמירה המסכן בתוך קרום התא חיידקי (UBI-3). אלה הושוו לפקד של המסחרי counterstaining (Calcein AM) שבה השתמשת כדי הנקרא S. aureus.

מוכתם. Calcein AM, UBI-3 ו- UBI-10 שכותרתו S. aureus היו עם תמונה ההשעיה מאת FCFM עם 100% 488 ננומטר לייזר כוח, קצב 12 מסגרות לשנייה (איור 2). שם חיידקים ללא תווית ב- PBS היו עם תמונה, אין אות ניאון היה לזיהוי. זאת בניגוד כאשר היו חיידקים שכותרתו עם תמונה. איפה המתלים חיידקי UBI-3 או UBI-10 היו עם תמונה על-ידי FCFM, היה ברור כי קרינה פלואורסצנטית רקע כללי של הפתרון היה גבוה בהשוואה ל- PBS רק שולטת, זאת משום להארכה (fluorophore בדיקה) פולטים כמות קטנה של קרינה פלואורסצנטית אות ב תמיסה מימית, עם זאת, הבהיר נקודות punctate הם נראים בבירור לאורך כל הפתרון, ללא צורך צעד לשטוף. זאת בשל עלייה אות פלורסצנטיות הנפלטים NDB בסביבה קוטבי קרי, את קרום החיידק. Calcein AM היא לא בדיקה activatable, כך צעד לשטוף לאחר צביעת חיידקי נדרש להסיר את הרקע פלורסנט גבוהה של החללית לא מאוגד בפתרון. כמו UBI-3 ו- UBI-10 אותרו שכותרתו חיידקים, חיידקים המסומנת Calcein AM ב פתרון על-ידי FCFM כנקודות punctate ירוק בהיר. כאשר הנתונים נאספים בפורמט וידאו, והנקודות הללו מופיעים ' בבקשה ' כאשר הם עוברים בין הליבות, ולצאת מיקוד, תכונה אופיינית של חיידקים שכותרתו הדמיה בשיטה זו.

החיידק שכותרתו היו לאחר מכן הוסיף לפרוסות של ex-vivo רקמת הריאה האנושי, עם תמונה שוב על-ידי FCFM (איור 3). שם רק PBS או ללא תווית S. aureus נוספה רקמת הריאה, זוהה רק הריאות autofluorescent מבנה רקמות (נראה כמו קווצות ירוק בהיר של קולגן ואלסטין, אזורים כהים של שטח מכתשי). אין נקודות punctate אותרו עבור תנאים אלה שליטה. באופן דומה, רק ריאות רקמות מבנה (, אין נקודות punctate) היה מדמיין עבור התנאי רקמת הריאה עם S. aureus בתוספת UBI-3; המציין כי המכשיר הזה אינו נשמר stably בהישג בקטריאלי התא ממברנה קרי, זה היה נשטף החוצה ו/או יורד בנוכחות אנזימים הפרוטאוליטי מקורי בתוך רקמת הריאה (כפי שהוכח בעבר11).

אולם הבהיר נקודות punctate היו גלויים הן Calcein את AM תוויות. מדגם S. aureus בקרה חיובית, ועם המכשיר הספציפי חיידקים המבטיחים ביותר מדגם (UBI-10) S. aureus . הנקודות 'והזכיר' היו גלויים למרות autofluorescence רקמת חזקה (איור 3). לכן, התוצאות המתקבלות על-ידי FCFM היו במטה במבחנה לפני הקרנת הסרט הלוח של הגששים חיידקים ספציפיים על-ידי CLSM, הדגימו שיטה לזיהוי הרלוונטית קלינית הדמיה זיהומים בזמן אמת.

התוצאות המובאות כאן מדגימים כי הריאות הוא מערכת איברים המתאים עבור הדמיה מאת FCFM עקב autofluorescence הייחודי שלה. המבנים ייחודי בהיר מאפשרות למפעיל דוד לקבוע כי הם בחלל מכתשי. אזורים אלה, בשילוב עם שקי האוויר מכתשי כהה לספק התפאורה המושלמת עבור הדמיה חיידקים fluorescently שכותרתו עם ניגודיות גבוהה.

למרות הגילוי של חיידקים תוך מחקר זה נקבע איכותית דמיין נקודות punctate בהיר, זה יכול להיות אפשרי לכמת את מספר הנקודות punctate תמונה באמצעות תוכנה המשני על מנת לקדם לאפיין בדיקה ספריות.

Figure 1
איור 1: תמונה סטטית של אמבריולוגיה רקמות autofluorescence. לייזר קונפוקלי endomicroscopy (לנקות) תמונה של ex-vivo רקמת הריאה האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונאפוקלית fibered (FCFM), על עירור 488 ננומטר, עוצמת הלייזר 100% ו- 12 מסגרות/ס אלסטין וקולגן הם מאוד פלורסנט (false בצבע ירוק), ואילו שטח מכתשי אינו, ומופיע אזורים שחורים. איור זה השתנה מ אכרם ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: לייזר קונפוקלי endomicroscopy (לנקות) דימוי שכותרתו S. aureus ההשעיה. מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה fibered (FCFM) שימש תמונה חיידקים מראש עם תוויות, עירור 488 ננומטר, עוצמת הלייזר 100%, ו 12 מסגרות/ס Labeled חיידקים מופיעים כנקודות punctate מאוד פלורסנט (שווא בצבע ירוק). איור זה השתנה מ אכרם ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 3
איור 3: לייזר קונפוקלי endomicroscopy (לנקות) תמונה של ex-vivo רקמת הריאה האנושי עם תוויות S. aureus. מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה fibered (FCFM) שימש התמונה שמחוץ רקמת הריאה האנושי ומתויגים S. aureus-עירור 488 ננומטר, עוצמת הלייזר 100% ו- 12 מסגרות/ס Labeled חיידקים הצג כנקודות punctate מאוד פלורסנט (שווא בצבע . ירוק) בתוך המדגם רקמת הריאה כאשר המסומנת Calcein AM או UBI-10. הניגוד הגבוה ביותר הוא ציין היכן חיידקים הם עם תמונה בתוך החלל מכתשי. איור זה השתנה מ אכרם ואח. 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.  

Discussion

זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה בחשבון השני נטל הגבוה ביותר של המחלה ברחבי העולם12,13, ו משמעותית עליית המספר של זיהומים לייחס חיידקים עמידים מיקרוביאלית כבר דווח על14. דלקת ריאות נשאר גורם שכיח עבור אשפוז. בטיפול נמרץ, התפתחות דלקת ריאות מורכב אבחון חוסר ודאות והיא קשורה עם מטוס שיעור התמותה גבוה במיוחד15. במהלך הופעת דלקת ריאות, להתרבות חיידקים בתוך החלל מכתשי של הריאות הדיסטלי, שטח סטרילי יחסית, עם microbiota מינימלי בבריאות.

שיטה זו מתארת בשלב מאוחר יחסית שמחוץ אימות של חיידקים ספציפיים אופטי הדמיה הגששים11, אבל העיצוב, סינתזה ו הערכה בדיקה לפני תחילת שלב אימות זה הוא הכרחי, כפי שמוצג בעבר11 .

דוד הוא המתעוררים הטכניקה קליניים עבור חוקר מחלת קובע בחיי עיר בזמן אמת. הוא מציע יתרונות רבים על פני טכניקות מסורתיות על חקירת חשודים פתולוגיה ריאתי, אשר עשויה להיות כרוכה של ביופסיה ואוסף של נוזל שטיפה. ביופסיות פולשניות, יכול לגרום תחלואה ותמותה בחולים מאוורר, נוזל שטיפת שנאספו נגוע לעיתים קרובות עם חיידקים מן דרכי הנשימה העליונות. השימוש לנקות זיהוי של דלקת ריאות הוא אולם מעט מוגבלת בשל הזמינות המסכן של הדמיה תואם רגשים אשר עשויים לספק מידע פונקציונלי של המחלה, למרות מאמצים למיגור רבים10. שילוב לנקות עם סוכנים אופטי מציע הסיכוי לאבחן דלקת ריאות מהר יותר, פחות פולשנית לעומת ונוהגין סטנדרטי.

השלבים הקריטיים פרוטוקול זה הם הכנת הדוגמא, תוכנית ההתקנה של פלטפורמת לנקות. קבלת רקמה אנושית הרלוונטיים ליישום קליני הסופי הוא גם חשוב, כגון רקמת הריאה האנושי כפי שמתואר במסגרת מחקר זה. יש צורך להשתמש רקמה אנושית כי היקף רקמת autofluorescence מציגה וריאציה בין מינים גדולים, לכן עלול להטעות את הרגישות של החיידקים-החללית להיות עם תמונה. בנוסף, קבלת אתיקה אחזור ושימוש של רקמת הריאה אנושי חיוני. מ טכני ברמה, נכון ניקוי, מצורף של סיבי הדמיה הדימות LSU פלטפורמה וכיול הוא חיוני עבור רזולוציה טובה והדמיה עקבית, כמו זה להבטיח שוות ערך מספרי של חיידקים נוספים כל דגימה של רקמת הריאה. להרחבה נוספת השירות של שיטה זו על הקרנת לוחות של הגששים, לחזור על התהליך עם מגוון של פתוגנים, כגון אלה עשוי להיות סוכנים סיבתי של דלקת ריאות היא הכרחית.

המגבלה הגדולה של טכניקה זו היא כי המכשיר לנקות רפואית אישרה יש לייזר אחת בלבד (488 ננומטר). לכן, כיום, הבחירה של fluorophore לעיצוב בדיקה מוגבל לשימוש במערכת זו, למרות קלינית אושרה צבע אחד התקנים קיימים עם אורכי גל עירור של 660 ננומטר, אינפרא אדום. רצוי מאוד קו לייזר השני להגשמה באותו התקן כדי לאפשר בדיקה שפותחה עם fluorophore spectrally נפרדות כדי לשפר רגישות חיידקים-בדיקה מעל הרמה של הרקמה autofluorescence. בזמן כפול-צבע לנקות התקנים נמצאים בפיתוח, גם לא קלינית לאישור ו/או העלות משמעותית16.

לנקות במבחנה באמצעות חיידקים פתוגניים ו- ex-vivo רקמה אמבריולוגיה הגששים פוטנציאליים מסך מגשרת על הפער בין קונבנציונאלי במבחנה טכניקות כגון cytometry זרימה CLSM, כלי קליני. שלב זה מציע ביטחון בעת בחירת תרכובות מבטיח להעביר כדי להיות ביחד עם דוד קליניים הדמיה; יספק אינדיקציה אם המכשיר נבדק שומרת על היעד ירידה לפרטים, או מדגים כלשהו את המטרה תיוג, כגון איגוד ישירות אל רקמות, או מראה יציבות עם המארח הפרוטאוליטי אנזימים. זה גם יהיה רלוונטי כדי להוסיף כל אחד הגששים activatable ישירות דגימות של רקמת הריאה האנושי פלוס חיידקים, לאפיין באופן מלא את המהירות של החללית איגוד והפעלה בזמן אמת.

אנו מאמינים כי הצינור לסינון במהירות הרומן הגששים חיידקים ספציפיים כדי להעריך את הפוטנציאל שלהם עבור הדמיה בתוך הריאה דיסטלי של חולים וכתוצאה מכך הרבה יותר מהר תרגום למרפאה. זה בעיקר כי המכשיר הספציפי חיידקים יכול להיגאל מקומית בתוך הריאות דרך קטטר למטה ערוץ עבודה של ברונכוסקופ, כלומר microdose הזה (< 100 µg) יכול להיות מועברת כמויות. לכן, biodistribution של המתחם והספקת מערכתית היא לא דאגה, כמו במקרה של רבים מטרות נוספות של זיהום בתוך הגוף, או עם הדמיה גרעינית. יתר על כן, מסירת המכשיר ההדמיה במנה קטנה מפחיתה את הסיכון של רעילות סיבוכים הקשורים (למרות רעילות ההקרנה יהיה צורך לתרגום). בעקבות החדרה של המכשיר, הקטטר ואז ניתן להחליף על ידי סיבים FCFM באותו האזור של הריאה שנחקרו על-ידי דוד, בדומה לאופן ערכנו בתוך שיטה זו. הדמיה צריכה להתבצע במהירות בעקבות ההתקנה של המכשיר לפני המכשיר עובר לא לגילוי ריכוזי.

חשוב גם לציין את ההקרנה של זיהוי המחלה הגששים באמצעות הטכניקה הזו לא צריכה להיות מוגבלת הדמיה בקטריאלי סוכנים, אבל אפשר גם להרחיב את האימות של הגששים עם מטרות חלופיות, כגון דלקת. גישה זו צריך להיות גם יכולת הסתגלות למקומות אחרים המחלה בתוך הגוף שבו מותר הדמיה באמצעות FCFM.

Disclosures

KD: מנהל מייסד של הדמיה מולקולרית של אדינבורו. ייעוץ שהתקבלה מטכנולוגיות מאונה קיאה כיועץ.

MB: מנהל מייסד הדמיה מולקולרית של אדינבורו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות גרנט שיתוף פעולה מחקרי בין-תחומית המועצה למחקר מדעי (EPSRC, ארצות הברית) והנדסה EP/K03197X/1, מחלקת הבריאות וטרסט דרך קרן אתגר חדשנות בריאות (HICF) . מספר האסמכתא מימון: 0510-069.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. , Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016).
  2. Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).
  3. Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14 (11), 1123-1135 (2014).
  4. Neumann, H., Kiesslich, R. Yamada's Textbook of Gastroent. , John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).
  5. Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80 (6), 928-938 (2014).
  6. Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 11-18 (2014).
  7. Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50 (8), 711-716 (2014).
  8. Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
  9. Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6 (5), 444-449 (2009).
  10. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4 (3), 163-174 (2016).
  11. Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6 (12), 6971-6979 (2015).
  12. Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2 (3), 238-246 (2014).
  13. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  14. Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2 (1), 6 (2013).
  15. Chastre, J., Fagon, J. -Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165 (7), 867-903 (2002).
  16. Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21 (4), 046009-046009 (2016).

Tags

אימונולוגיה גיליון 129 בדיקה אופטית זיהום חיידקי לייזר קונפוקלי endomicroscopy ריאות הדיסטלי תרגום נמרץ הדמיה אופטית.
הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על <em>לשעבר Vivo</em> רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, B., Akram, A. R.,… More

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter