Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Optisk Screening av romanen bakterier-spesifikke sonder på Ex Vivo menneskelige lungevev av AC Confocal Laser Endomicroscopy

doi: 10.3791/56284 Published: November 29, 2017

Summary

Denne teknikken beskriver en effektiv screening-prosess for evaluering bakterier-spesifikke optisk tenkelig agenter innen ex vivo menneskelige lungevev, av blanke fluorescens AC confocal mikroskopi for rask identifisering av små molekyl kjemiske sonden-kandidater med oversettbare potensial.

Abstract

Forbedre hastigheten og nøyaktigheten av bakteriell oppdagelsen er viktig for pasienten lagdeling og sikre riktig bruk av poesi aksent. Å oppnå dette målet, utviklingen av diagnostiske teknikker for å gjenkjenne bakteriell tilstedeværelse i sanntid på point-of-care er nødvendig. Optisk tenkelig for direkte identifikasjon av bakterier i verten er en attraktiv tilnærming. Flere forsøk på kjemiske sonde design og validering har blitt undersøkt, men ingen har ennå ble oversatt til klinikken. Her beskriver vi en metode for ex vivo validering av bakterier-spesifikke sonder for identifikasjon av bakterier i distale lungene, fotografert av blanke fluorescens AC confocal mikroskopi (FCFM). Vår modell brukes ex vivo menneskelige lungevev og en klinisk godkjent AC confocal laser endomicroscopy (CLE) plattform skjermen romanen bakterier-spesifikke imaging forbindelser, tett etterligne imaging forhold forventes å oppstå med pasienter. Derfor gir screening forbindelser av denne teknikken tillit for potensielle klinisk tractability.

Introduction

Denne teknikken beskriver en rask screening-prosess for evaluering av bakterier-spesifikke optisk tenkelig agenter innen ex vivo menneskelige lungevev av CLE bruker FCFM for rask identifisering av forbindelser med potensielle klinisk verktøy for å visualisere bakterier i distale lunge i situ.

Det er et presserende globale krav til rasjon antimikrobielle forskrivning i tid med stigende resistensutvikling1. Dette søkte utviklingen av diagnostiske metoder som loven å identifisere bakteriell infeksjon med høy spesifisitet, følsomhet og i sanntid er svært2. Gjeldende teknikker å bekrefte diagnosen lungebetennelse i kritisk uvel pasienter, som de i intensivavdelinger (ICUs), er ofte avhengige av tolke uspesifisert klinisk eller radiologiske funksjoner sammen med bakteriell kultur teknikker fra aspirerede væsker/vev, som kan ta opp til 3 dager å produsere resultater. Videre bakteriell kultur fra væske innpodet i distale lungene og er utsatt for forurensning fra mer proksimale airways3 og er ofte kultur negative grunnet samtidig antimikrobielle terapi eller dårlig prøvetaking teknikker. I tillegg, er molekylær teknikker som polymerasekjedereaksjons følsom når den brukes på aspirerede væsker, risikerer overtreatment pasienter. Nye diagnostiske tilnærming er molekylære optisk tenkelig, gjør i situ molekylær patologi av vev en mulighet; utvikling og validering av optisk tenkelig forbindelser er imidlertid nødvendig. Likevel direkte visualisering av bakterier, via activatable optisk sonder er potensielt en veldig kraftig metode å tillate studiet av tilstedeværelse og utviklingen av lungebetennelse i pasienten, og viktigst, kan brukes til å studere vert-patogen interaksjoner i Svar til behandling i sanntid i situ.

PLIKT er en etablert undersøkende prosedyre i flere sykdommer4, inkludert innen feltene gastroenterologi5, onkologi6,7, og for å avhøre airways og alveolar sacs8, 9. kan point-of-care strukturelle bildebehandling av syke vev bruker en fiber imaging bundle, som passerer gjennom kanalen arbeider av en klinisk endoskop og skjemaer direkte kontakt med vevet overflaten til å avbildes av AC confocal mikroskopi. Imidlertid er en begrensning som gjenstår behovet for generell kontrast agenter. Bruk av sykdommen bestemte prober, som bestemt bakteriell agenter, kan derfor vesentlig utvide nytten av denne modaliteten ved å visualisere direkte bakterier på stedet av antatt infeksjon. Optisk agenter har mange fordeler over andre teknikker av aktivering av real-time, høy oppløsning bildebehandling med diagnostiske muligheter. Videre tilbyr optisk sonder utsiktene til multipleksing for avhør flere mål, alle oppnådd til en relativt lav kostnad. En rekke optiske agenter er under utvikling for slike formål, men ingen har ennå blitt implementert i klinikken10. Vi har syntetisert et bibliotek av små molekyl kjemiske sonder med spesifisitet mot bakterier og utviklet en rask, effektiv rørledning for evaluering av sonden-funksjonen for å oppdage bakteriell lungebetennelse i situ11.

For å finne passende sonde kandidater, hadde følgende forutsetninger oppfylles før avhør av sonden på ex vivo menneskelige lungevev av FCFM: i) vandig løselighet, ii) spesifisitet og selektivitet for raskt merking klinisk relevante bakterier, iii) en høy signal-til-støy-forhold og iv) motstand mot fornedrelse i lunge miljøet. Sistnevnte ble vurdert av bronchoalveolar lavage væske (BALF) fra pasienter med akutt respiratory distress syndrom (ARDS), som er en tilstand som er preget av proteolytisk og provoserende miljøer i lungene i ICU. Videre måtte sonder ha en passende fluorophore for deteksjon av en klinisk godkjent optisk CLE bildeenheten i menneskelig alveolar lungevev.

Rørledningen avhøre hver av disse forutsetningene var som følger (på hvert trinn, bare sonder som passerte ble båret frem til neste): (1) et bibliotek av sonder undersøkes ble syntetisert; (2) hver probe ble lagt til et panel av levende bakterier for AC confocal laserskanning mikroskopi (CLSM) for å sikre bakteriell merking; (3) selektivitet av bakteriell merking over pattedyrceller i co kulturer med primære menneskelige nøytrofile ble etablert av CLSM; (4) stabilitet og vellykket merking av bakterier i nærvær av ARDS pasienten BALF ble bestemt av CLSM og Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering-tid på fly (MALDI-TOF) massespektrometri; (5) optimal konsentrasjon av kandidater ble bestemt av CLSM, sikre selektivitet for bakterier over pattedyrceller ble opprettholdt; (6) kandidater ble fotografert av FCFM i suspensjon på ex vivo menneskelige alveolar lungevev å sikre stabilitet og som signal-til-støy var tilstrekkelig for gjenkjenning. Trinn 6 er beskrevet i detalj i denne protokollen. Metodikk for trinn 1-5 er tidligere rapportert11.

Protocol

Alle menneskelige lungevev ble innhentet etter samtykke og studien ble godkjent av Regional komité for etikk.

1. forberedelse av biologiske prøver

  1. Utarbeidelse av sonder
    1. Utgjør en 1 mM lagerløsning for hver probe (f.eksCalcein AM, UBI-3, UBI-10, etc.) i sterilt dH2O, bruker en hårfin balanse for å veie den fryse-tørket sonde sammensatte11. Beregne volumet av dH2O til basert på vektet masse og molekylvekt av sonden.
  2. Utarbeidelse av bakteriekulturer
    Merk: For denne metoden, Staphylococcus aureus ble brukt som exemplar belastningen. Aktuelle bakteriell belastning kan velges. Noen kommersielle fargestoff som etiketter bakterier med excitation riktig og utslipp spectra kan velges positivt merke bakterier.
    1. Velg en enkelt koloni av ønsket bakterielle belastningen fra en fersk Lysogeny kjøttkraft (LB) agar plate med en bakteriefri loop. Vaksinere kolonien i 10 mL av LB i et 50 mL sentrifuge rør av dipping slutten av løkken inn i kulturen-mediene. Inkuber ved 37 ° C, 250 rpm 16 h (eller over natten).
    2. Bestemme OD595 natten kultur ved å legge til 100 µL av natten kultur 900 µL LB i 1 mL søppel. Måle OD på 595 nm (bruker søppel med 1 mL LB som en tom) i et spektrofotometer. Multiplisere innhentet OD med 10 hente OD for natten kultur.
    3. Subkultur natten kultur. Gjør dette ved å justere optisk densitet ved 595 nm (OD595) til 0,1 i 10 mL av fersk lb beregne nødvendig volumet av natten kultur legges til 10 mL frisk LB justere OD595 til 0.1. Inkuber kulturen ved 37 ° C, 250 rpm til kultur når midt Logg fase (OD595 0.6 - 0,8), ca 4 h.
    4. Måle kultur optisk tetthet (trinn 1.2.2) og harvest 1 x 108 kolonien forming enheter (CFU) (OD595 ~ 1-1 x 108 CFU/mL) av bakteriell kultur i en 1,5 mL microtube (f.ekshvis bakteriell kultur er OD595 0,6, samle 1,67 mL). Sentrifuge kulturen på 10.000 x g ved romtemperatur for 1 min til pellets bakterier. Vask pellet to ganger i fosfat bufrede saltvann (PBS) resuspending (pipettering opp og ned nøye) pellet i 1 mL PBS, sentrifugering som ovenfor, forkaster nedbryting og gjenta. Ta vare ikke for å fjerne den bakterielle pellet når du fjerner nedbryting. Resuspend den endelige pellet i 1 mL PBS.
      Merk: Forberede så mange eksempler som kreves for hver merking prosedyre. Protokollen kan pauses her for opptil 1 h, etterfulgt av trinn 1.2.5.1, 1.2.5.2 eller 1.2.5.3.
    5. Bakteriell flekker
      1. Hvis etiketten bakterier med Calcein AM, legge fargestoff til en siste konsentrasjon på 1 µM i vasket bakteriell kulturen. Inkuber kulturen i 30 min på 37 ° C med skjelvende på 300 rpm. Vask counterstained bakteriell suspensjon i PBS 3 ganger med sentrifugering som i trinn 1.2.4 fjerne overflødig fargestoff. Resuspend i 1 mL PBS, fortynne 100 µL 1:1 i PBS å få 200 µL av OD595 0,5 Calcein er farget bakterier. Protokollen kan pauses her for opptil 1 time.
      2. Hvis etiketten fortynne bakterier med test sonder (f.eksUBI-3 eller UBI-10), 100 µL av bakteriell kultur 1:1 i PBS hente OD595 0,5 i 200 µL PBS. Legge til en av sonder til en siste konsentrasjon av 10 µM. invertere microtube flere ganger for å sikre grundig blanding av bakterier og sonden.
        Merk: Imaging skal utføres umiddelbart etter at sonden å etterligne klinisk scenariet.
      3. For å forberede kontrollen OD unstained kvinne bakteriell prøver, fortynnet 100 µL av kultur 1:1 med PBS å få 200 µL av unstained kvinne595 0,5 prøven.
  3. Utarbeidelse av ex vivo menneskelige lungevev
    Merk: Human lunge vev eksempler Hentet fra pasienter som gjennomgår kirurgisk resection for lunge carcinoma. Alle vev brukes til bildebehandling er Hentet fra prøver av normal lungevev fra cancerous vekst. Prøvene ble tatt rett fra operatørselskapene teater og lagret i microtubes eller sentrifuger rør ved-80 ° C før bruk.
    1. Umiddelbart før bildebehandling, fjerne menneskelig lunge vev prøven fra fryseren på tørris. I romtemperatur, tillate vevet å tine litt; akkurat nok skiver med en skalpell i 1 x 4 mm2 seksjoner.
      Merk: Tining er viktig; også frosset vevet vil ikke skjære uten chipping, for Tint og vevet er for myk å skjære.
    2. Ved hjelp av pinsett, plassere skiver menneskelige lungevev i brønner av en 96-brønns klart flat bunn vev kultur plate. Returner alle ubrukte menneskelige lungevev umiddelbart til beholderen og sted på tørris for transport tilbake til-80 ° C fryseren.
    3. Legge til 100 µL PBS hver lunge Vevsprøve med en pipette. Bruk pipette spissen for å sikre alle vev er dekket i PBS (og ikke fast til veggen av brønnen). Vevet vil hovne opp litt og kan flyte. La PBS på prøven i noen minutter å tillate noen blodet lekke fra vevet i løsningen. Fjern så mye av PBS som mulig. Vevet kan blokkere slutten av pipette spissen; Prøv å vinkle plate/tips plassering for å hindre dette.
    4. Pipetter 100 µL av unstained kvinne, Calcein er merket, eller test-sonden merket bakterier hver også inneholder lungevev. Også definere kontroller med lungevev og 100 µL PBS. Disse kontroll brønner, kan sonder uten bakterier legges til å måle noen økning i bakgrunnen fluorescens og/eller ikke-spesifikk aktivering av sonden av lungevev alene. En godt med lungevev og PBS bør også være inkludert.

2. bildebehandling med CLE enheten med FCFM

  1. Definere CLE enhet
    Merk: Forberede CLE systemet 20 min før kalibrering til at laseren å varme opp.
    1. Trykk på på/av-bryteren på baksiden av transformeringen av systemet og slå på den angitte datamaskinen. Trykk på av/på-knappen på forsiden av laser skanning enheten (LSU). Kontrollere utseendet på grønt lys, som indikerer at enheten er slått på.
    2. Dobbeltklikk på ikonet Fjern programvare. Angi innloggingsdetaljer og vente på LSU initialisere (10-30 s).
    3. For bruk av nye FCFM imaging fiber, er installasjon med den medfølgende CDen nødvendig. Sett inn installasjons-CDen i datamaskinen CD-stasjonen og følg instruksjonene.
    4. Rengjør FCFM tenkelig fiber kontakt enheten med en fiber renere. Gni kontakten på rengjøring båndet i fremover bevegelse fjerne noe støv/skitt. Fjern beskyttelseshetten gule fronten i LSU.
    5. Klargjør LSU hub ved varsomt roterende sølv huben mot urviseren til den stopper. Sett inn FCFM tenkelig fiber koblingen til huben med den flate siden av kontakten vendt oppover. Holde fiber på plass og rotere sølv huben med urviseren til den klikker to ganger. Fullføre tilkoblingen ved å rotere sølv huben med en ytterligere 45 °.
      NOTE Hvis fiber ikke, sjekk at FCFM imaging fiber er installert og koblet i riktig retning.
    6. Følg instruksjonene som vises for å fullføre FCFM imaging fiber kalibrering. 3 trinn: (1) FCFM tenkelig fiber test (trinn 2.1.7 - 2.1.8), (2) bakgrunn oppkjøp (trinn 2.1.9), (3) fiber gjenkjenning (trinn 2.1.10).
    7. Trykk 'start laser'-knappen på skjermen. Laser vil sentrum.
    8. Velg frisk ampuller (gul: kalibrere; røde: Rengjør; blå: Skyll) fra kalibreringen kit og følg instruksjonene: plassere distale FCFM imaging fiber i gul ampullen se for økningen i fluorescens på skjermen, og plasser den fiber tips i rød ampullen (uten stirring). Vent til fluorescensen (som vist på dataskjermen) forsvinner. Endelig skyll fiber spissen i blå ampullen.
      Merk: Hvis fluorescensen ikke forsvinner, rengjør FCFM tenkelig fiber med 8% H2O2 og linse rengjøring vev og begynne på nytt. Gjenta prosessen til får tilfredsstillende resultater (bildekvaliteten er klart og ingen merker fra skitt er tilsynelatende).
    9. Plass FCFM imaging fiber i blå ampullen. Trykk "start laser" etterfulgt av "beregne" når dette blir et alternativ.
    10. Plass FCFM imaging fiber i gul ampullen. Trykk "start laser" etterfulgt av "beregne" når dette blir et alternativ.
    11. Under den automatiske kalibreringen, rense distale FCFM imaging fiber ved å plassere i rød ampullen for > 10 s, etterfulgt av blå ampullen for > 4 s, som indikert av programvaren.
  2. Datainnsamling med CLE
    1. Etter installasjonen åpner et vindu for å velge lagringsplassering og filen prefiks. Velg ønsket mappe for lagring av data, og navn prefikset tilsvarende.
    2. Plass pedalene slik at de lett kan nås av operatøren. Venstre pedal: laser/på; Center pedal: pause; høyre pedal: Spill inn/stopp.
      Merk: Laser kontrollene kan også nås via kontroller på skjermen.
    3. Klikk "start" på skjermen eller trykk venstre fot-pedalen aktivere laser. Dette starter oppkjøp og hente bilder med 100% laser makt og en bildefrekvens på 12 rammer/s (standardinnstillingene).
      Merk: For andre applikasjoner, innstillingene kan endres på skjermen om nødvendig avhengig prøven.
    4. Bilde hver av bakteriell suspensjon prøvene.
      1. Sett inn distale FCFM tenkelig fiber og flytte fiber sakte gjennom suspensjon avhøre prøven.
      2. Spille inn videoer av alle lengden (opptil 10 min) ved å trykke høyre fotpedal eller velge posten skjermkontroller, som fiber beveger seg sakte rundt prøven.
      3. Rengjør distale FCFM tenkelig fiber med 8% H2O2 og linse rengjøring vev mellom eksempler.
        Merk: Typisk video lengder av 10-30 s er tilstrekkelig for i vitro bildebehandling.
    5. Bilde hver av lunge vev prøvene.
      1. Sett inn distale FCFM imaging fiber i prøven, slik at direkte kontakt mellom slutten av fiber og vev er laget. Forsiktig flytte slutten av tenkelig fiber rundt avhøre prøven.
        Merk: Løft slutten av fiber fra vev fjerner vev fra fokalplanet; men kan dette brukes å image merket bakterier som ikke følges vevet.
      2. Spille inn videoer av alle lengden (opptil 10 min) ved å trykke høyre fotpedal eller velge posten skjermkontroller, som fiber beveger seg sakte rundt prøven.
        Merk: Vanligvis video lengde 30 s er tilstrekkelig for ex vivo bildebehandling på vev.
      3. Rengjør distale FCFM tenkelig fiber med linse rengjøring vev og 8% H2O2 mellom eksempler.
  3. Slå av systemet
    1. Slå laser ved å trykke venstre fotpedal eller ved å klikke den skjermtast.
    2. Koble FCFM tenkelig fiber fra CLE enheten ved å slå sølv LSU huben mot urviseren til den stopper. Fjern FCFM imaging fiber fra LSU huben ved å trekke forsiktig fiber kontakten fra LSU.
    3. Rengjør og desinfiser FCFM tenkelig fiber med 8% H2O2 og linse rengjøring vev. Returner Beskyttelseshetter den proksimale enden av FCFM bildebehandling fiber og foran LSU enheten. Plass fiber forsiktig i boksen lagring.
    4. Lukk dataene fange programvare og kopiere lagrede filer til en ekstern USB-enhet. Slå av datamaskinen og slår LSU enheten ved å trykke på frontpanelet I/O for 3 s til det grønn lyset forsvinner.
    5. Kast av menneskelig lungevev og bakterier i henhold til lokale forskrifter.

3. dataanalyse

  1. Åpne programvaren og importere filene for analyse ved å velge den aktuelle katalogen på datamaskinen gjennom ikonet 'Gå til' på programvare dashbordet. Alternativt kan filer dras og slippes i programvare dashbordet.
  2. Dobbeltklikk på hver videofil å åpne dem. Videoene spille automatisk med optimalisert farge oppslagstabell (LUT) og farge justere. Deaktivere automatisk intensiteten skalering, ved å klikke på tryllestavknappen over baren intensitet skala. Funksjonen deaktiveres når det er ingen svart skygge rundt knappen.
    Merk: Automatisk intensitet skalering må deaktiveres for å hindre kontinuerlig kontrastforbedring gjennom hver video, gjør det umulig å sammenligne og analysere videoer fra samme datasettet.
  3. Velg ønsket intensitet skalering ved å flytte minimum og maksimum barer å gi best mulig kontrast. Bruk histogramverktøyet da velge intensiteten skalering for å sikre bredest dynamikkområdet er fanget.
    Merk: Kontroller at dynamikkområdet er slik at bildene ikke er mettet (dvs. begrense hvite områdene i bildet, som indikerer metning), slik at lav intensitet funksjoner ikke er savnet.
  4. Når ønsket skaleringen er oppnådd, høyreklikk over dropdown menyknappen oppført som "Standard (grønn)". Velg alternativet Lagre til LUT. Lagre LUT til en ønsket plassering.
  5. Andre video i datasettet, bruke den samme LUT ved å høyreklikke over 'Standard (grønn)' rullegardinmenyen og velg 'Last LUT'. Velg den aktuelle filen gjelder konsekvent intensitet til alle videoer i et datasett.
  6. Eksportere behandlet videoer ved å klikke på knappen "film hjul". Velg ønsket videoformat, f.eks "for presentasjon formål", som vil produsere en MPG-fil. Trykk "Export" og valgte plassering å lagre videofilen. Øyeblikksbilder av enkeltbilder kan eksporteres ved å klikke "kamera". Det er mulig å lagre en PNG, BMP eller jpg. Velg mål og trykk lagre.
    Merk: Videoer kan deretter importeres til programvare for utarbeidelse av presentasjoner eller ytterligere kvantifisering. Merket bakterier er visualisert som grønne "blinker" prikker i videoen. Den lunge vev strukturen vil være som sorterte lysrør tråder, med alveolar plass vises svarte.

Representative Results

I denne studien har vi vist en metode for rask-screening av romanen bakterier-spesifikke sonder i en ex vivo menneskelige alveolar lunge vev modell av infeksjon bruker en klinisk godkjent CLE-enhet.

PLIKT av FCFM er godt egnet for å få strukturinformasjon i distale lungene, som denne regionen (på grunn av en høy overflod av elastin og kollagen) er naturligvis svært fluorescerende når opphisset med 488 nm laser8. Derimot alveolar plassen fluoresce ikke, og Slik aktiverer Høykontrast mellom vevet struktur og luft plass til å bli visualisert (figur 1).

Tillegg av sykdom relatert sonder eller kontrast agenter, som bakterier-spesifikke sonder bør aktivere funksjonelle informasjon om sykdom prosesser innhentes i sanntid. Vi har tidligere beskrevet syntese og første i vitro screening av et bibliotek av bakterier-spesifikke sonder11; hvor bakteriell-spesifisitet, identifiserte proteolytisk stabilitet og oppbevaring innenfor den bakterielle membranen over tid. En lovende bakterier-spesifikke sonde (UBI-10) ble identifisert i studien, samt en som viste dårlig oppbevaring innenfor bakteriell cellemembranen (UBI-3). Dette ble sammenlignet med en kontroll av kommersielle counterstaining (Calcein AM) som ble merket S. aureus.

Unstained kvinne, ble Calcein AM UBI-3 og UBI-10 merket S. aureus fotografert i suspensjon av FCFM med 100% 488 nm laser makt og en bildefrekvens på 12 rammer per sekund (figur 2). Hvor umerkede bakterier i PBS ble fotografert, var ingen fluorescerende signal synlig. Dette er når merket bakterier ble fotografert. Hvor bakteriell suspensjoner UBI-3 eller UBI-10 ble fotografert av FCFM, ble det klart at den generelle bakgrunnen fluorescensen løsningen ble forhøyet sammenlignet med PBS eneste kontrollene, dette er fordi NBD (sonde fluorophore) avgir en liten mengde fluorescens signal i vandig løsning, men vises punctate lyspunkter er tydelig gjennom løsningen, uten behov for en wash trinn. Dette skyldes en økning i fluorescens signal slippes ut fra NDB i polar omgivelser dvs, den bakterielle membranen. Calcein AM er ikke en activatable sonde, så en wash trinn etter bakteriell farging var nødvendig å fjerne høy fluorescerende bakgrunnen av ubundet sonde i løsningen. Som UBI-3 og UBI-10 merket bakterier, bakterier merket med Calcein AM ble oppdaget i løsning av FCFM som lyse grønt vises punctate prikker. Dataene samles i videoformat, vises disse prikkene til "blinke" som de beveger seg mellom kjerner og og ut av fokus, et karakteristisk trekk for bildebehandling merket bakterier av denne metoden.

Merket bakterier ble senere lagt til små sektorer av ex vivo menneskelige lungevev og fotografert igjen av FCFM (Figur 3). Der bare PBS eller umerkede S. aureus ble lagt til lungevev, fant bare lunge vev autofluorescent strukturen (sett som lyse grønne tråder av kollagen og elastin og mørke områder alveolar plass). Prikker vises punctate ble oppdaget for disse kontroll forhold. Tilsvarende var bare lunge vev struktur (og prikker vises punctate) visualisert for lunge vev betingelsen med S. aureus pluss UBI-3; Angir at denne sonde ikke ble beholdt stabilt innen bakterie celle membran dvs, det ble vasket ut og/eller er forringet i nærvær av innfødte proteolytiske enzymer i lungevev (som tidligere viste11).

Men var vises punctate lyspunkter synlig i begge Calcein er merket positiv kontroll S. aureus prøven, og med mest lovende bakterier-spesifikke sonden (UBI-10) S. aureus prøven. "Blinkende" prikker var synlig til tross for den sterke vev autofluorescence (Figur 3). Dermed resultatene av FCFM var i samvirke med i vitro pre screening av panelet av bakterier-spesifikke sonder av CLSM, og viste klinisk relevant oppdagelse metode for imaging infeksjoner i sanntid.

Resultatene presenteres her viser at lungene er en passende organ for imaging av FCFM på grunn av sin karakteristiske autofluorescence. Lyse særegne strukturer la CLE operatøren bestemme at de er i alveolar plass. Disse regionene, kombinert med de mørke alveolar luft sacs gir den perfekte bakgrunnen for imaging fluorescently merket bakterier med høy kontrast.

Selv om påvisning av bakterier presentert i denne studien bestemmes kvalitativt ved å visualisere vises punctate lyspunkter, kan det være mulig å tallfeste antallet vises punctate punkt bilde for bilde ved hjelp av en sekundær programvare for å fremme karakterisere sonde biblioteker.

Figure 1
Figur 1: Statisk bilde av menneskelig lunge vev autofluorescence. AC confocal laser endomicroscopy (CLE) bildet av ex vivo menneskelige lungevev med blanke fluorescens AC confocal mikroskopi (FCFM), på 488 nm eksitasjon, 100% laser makt og 12 rammer/s. Elastin og kollagen er svært fluorescerende (USANN farget grønn), mens alveolar plass er ikke, og vises som svarte områder. Dette tallet er endret fra Akram et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: AC confocal laser endomicroscopy (CLE) bilde av merket S. aureus i suspensjon. Blanke fluorescens AC confocal mikroskopi (FCFM) ble brukt til bilde forhåndsinnstilte merket bakterier, på 488 nm eksitasjon, 100% laser makt og 12 rammer/s. merket Vis bakterier som svært fluorescerende vises punctate prikker (falske grønn). Dette tallet er endret fra Akram et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3: AC confocal laser endomicroscopy (CLE) bildet av ex vivo menneskelige lungevev med merket S. aureus. Blanke fluorescens AC confocal mikroskopi (FCFM) ble brukt til bildet ex vivo menneskelige lungevev og merket S. aureus, på 488 nm eksitasjon, 100% laser makt og 12 rammer/s. merket bakterier Vis som svært fluorescerende vises punctate prikker (falske farget grønne) i lunge vev prøven når merket med Calcein AM eller UBI-10. Høyeste kontrasten er observert hvor bakterier er fotografert innen alveolar. Dette tallet er endret fra Akram et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.  

Discussion

Nedre luftveisinfeksjoner utgjør nest høyeste byrden av sykdom globalt12,13, og en betydelig økning i antall infeksjoner tilskrevet antimikrobielle-resistente bakterier har vært rapportert14. Lungebetennelse er en vanlig årsak til sykehusinnleggelse. I ICU, utviklingen av en lungebetennelse er forsterket av diagnostiske usikkerhet og er forbundet med en svært høy dødelighet frekvensen15. Under utbruddet av lungebetennelse spre bakterier innen alveolar distale lungene, et område som er relativt sterilt, med minimal bakterieflora i helse.

Denne metoden beskriver relativt sent stadium ex vivo validering av bakterier-spesifikke optisk tenkelig sonder11, men design, syntese, og sonde evaluering før begynnelsen dette valideringstrinnet er viktig, som tidligere vist11 .

PLIKT er en nye kliniske teknikk for avhør sykdom stater i situ i sanntid. Det gir mange fordeler over tradisjonelle teknikker for å undersøke mistenkt lunge patologi, noe som kan innebære en biopsi og samling av lavage væsken. Biopsier er invasiv og kan forårsake sykelighet og dødelighet i ventilert pasienter, og samlet lavage væske er ofte forurenset med bakterier fra øvre luftveiene. Bruk av CLE i deteksjon av lungebetennelse er men litt begrenset på grunn av dårlig tilgjengeligheten av kompatibel imaging sonder som kan gi funksjonelle informasjon av sykdom, til tross for mange felles innsats10. Kombinere CLE med optisk agenter tilbyr utsiktene for diagnostisering lungebetennelse raskere og mindre forhold invasively til dagens standard praksis.

Punktene kritisk til denne protokollen er i prøven forberedelse og installasjon av CLE-plattformen. Innhenting av menneskelig vev gjelder for den endelige klinisk anvendelsen er også viktig, for eksempel menneskelige lungevev som vist i denne studien. Det er nødvendig å bruke menneskelig vev fordi omfanget av vev autofluorescence viser store Inter-arter variasjoner, og kan derfor villede sensitiviteten av bakterier-sonden blir fotografert. I tillegg er det viktig å skaffe etikk for innhenting og bruk av menneskelige lungevev. Fra et teknisk nivå, riktig rengjøring er vedlegg av tenkelig fiber tenkelig LSU plattform og kalibrering avgjørende for god oppløsning og konsistent avbildning, som er å sikre tilsvarende antall bakterier legges til hver lunge Vevsprøve. For å ytterligere utvide nytten av denne metoden for screening panelene av sonder, er gjenta prosedyren med en rekke patogener, som de sannsynligvis forårsaker agenter av lungebetennelse nødvendig.

Den største begrensningen for denne teknikken er at klinisk godkjent CLE enheten har bare én laser (488 nm). Derfor er valg av fluorophore for sonden design foreløpig begrenset til bruk med dette systemet, men klinisk godkjent én farge enheter eksisterer med eksitasjon bølgelengder av 660 nm og nær infrarød. Det er svært ønskelig å ha en ny laser linje gjennomført innenfor den samme enheten til å aktivere en sonde utvikles med en spectrally distinkte fluorophore å forbedre bakterier-sonden følsomhet over nivået på vev autofluorescence. Mens dual-farge CLE enheter er under utvikling, de er heller ikke klinisk godkjent og/eller kostnadene er betydelig16.

PLIKT i vitro med patogene bakterier og ex vivo menneskelige lungevev til skjermen potensielle sonder broer mellom konvensjonelle i vitro teknikker som flowcytometri og CLSM og klinisk nytte. Dette trinnet tilbyr tillit når du velger lovende forbindelser å videreføre å være kombinert med klinisk CLE imaging; og gir indikasjon om testet sonden opprettholder målet spesifisitet, eller viser alle off-målet merking, for eksempel binding direkte til vev, eller viser ustabilitet med vert proteolytiske enzymer. Det ville også være relevant å legge hver av activatable sonder direkte til eksempler på menneskelig lungevev og bakterier, for fullt karakterisere sonde bindende og aktivisering i sanntid.

Vi tror at vår rørledning for raskt screening romanen bakterier-spesifikke sonder for å vurdere deres potensial for bildebehandling i distale lungene pasienter vil føre mye raskere oversettelse til klinikken. Dette er hovedsakelig fordi bakterier-spesifikke proben kan leveres lokalt i lungene gjennom et kateter settes inn ned arbeider kanalen av en bronchoscope, betyr at microdose (< 100 µg) beløp kan leveres. Derfor er systemisk levering og biodistribution av sammensatt ikke et problem, som er tilfelle for mange andre infeksjon mål i kroppen, eller med kjernefysiske bildebehandling. Videre leverer tenkelig sonden i slike en liten dose reduserer risiko for forgiftning tilknyttede komplikasjoner (selv om toksisitet screening ville være nødvendig for oversettelse). Etter instillasjon av sonden, kateter kan deretter bli erstattet av FCFM fiber og den samme regionen i lungene avhørt av CLE, mye på samme måte som vi har utført i denne metoden. Imaging skal utføres raskt etter installasjonen av sonden før sonden vasker bort til undetectable konsentrasjoner.

Det er også viktig å merke seg at screening av sykdom-identifiserende sonder av denne teknikken bør ikke begrenses til bakteriell-imaging agenter, men kan også utvide til validering av sonder med alternative mål som betennelse. Denne tilnærmingen skal tilpasses andre sykdom steder i kroppen hvor tenkelig via FCFM er tillatt.

Disclosures

KD: Grunnleggeren direktør for Edinburgh molekylær Imaging. Mottatte rådgivning Mauna Kea teknologi rådgiver.

MB: Grunnleggeren direktør for Edinburgh molekylær Imaging.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Engineering og Physical Sciences Research Council (EPSRC, Storbritannia) tverrfaglig forskningssamarbeid gi EP/K03197X/1, Department of Health og Wellcome Trust gjennom helse innovasjon utfordring Fund (HICF) . Finansiering referansenummer: 0510-069.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-14 Microfuge SciQuip 90616 Small benchtop microcentrifuge
96-well plate Corning 3370 Assay plate
Calcein AM Sigma Aldrich 17783  Commercial fluorescent dye
Cellvizio 488 nm Research CLE Mauna Kea Technologies LC-0001-488 Confocal laser endomicroscopy device
Cletop-S Cletop 14110601 Fibre cleaner
Eppendorf (1.5 mL) Eppendorf 30120086 1.5 mL microfuge tube
Eppendorf Research Plus Pipettes Fisher Scientific 11568663 Micro pipettes
Falcon tube (50 mL) Scientific Lab Supplies 352070 50 ml centrifugation tube
Gibco Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific 10010023 PBS - wash media
IC-Viewer Mauna Kea Technologies LW-0001 Data collection and processing software for the research CellVizio 488 nm system
Incu-Shake midi Sciquip SQ-4020 Floor standing shaking incubator
Lysogeny Broth  Sigma Aldrich (Miller) L3522 LB Growth media for S. aureus
non-standard research AlveoFlex 488 nm Mauna Kea Technologies MP-0002-AF3 Fibred confocal fluorescence microscopy fibre
Quanti Kit 488 nm Mauna Kea Technologies LQ-0005 Calibration kit for the CellVizio 488 system
S. aureus ATCC 25923 ATCC 25923 Bacterial strain used in this study
Semi-micro spectrophotometry cuvette Sigma Aldrich  C5416-100EA For spectrophotometry 
Thermomixer comfort Eppendorf 41102422 Benchtop heater with shaking
UV 1101 Biotech photometer Biochrom WPA Spectrophotometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Neill, J. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations. London: H M Government/Wellcome Trust. Available from: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf (2016).
  2. Caliendo, A. M., et al. Better Tests, Better Care: Improved Diagnostics for Infectious Diseases. Clin. Infect. Dis. 57, (suppl_3) 139-170 (2013).
  3. Zumla, A., et al. Rapid point of care diagnostic tests for viral and bacterial respiratory tract infections-needs, advances, and future prospects. Lancet Infect. Dis. 14, (11), 1123-1135 (2014).
  4. Neumann, H., Kiesslich, R. Yamada's Textbook of Gastroent. John Wiley & Sons. Ltd. 2944-2949 (2015).
  5. Chauhan, S. S., et al. Confocal laser endomicroscopy. Gastrointest Endosc. 80, (6), 928-938 (2014).
  6. Goetz, M., Malek, N. P., Kiesslich, R. Microscopic imaging in endoscopy: endomicroscopy and endocytoscopy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, (1), 11-18 (2014).
  7. Abbaci, M., et al. Confocal laser endomicroscopy for non-invasive head and neck cancer imaging: A comprehensive review. Oral Oncol. 50, (8), 711-716 (2014).
  8. Thiberville, L., et al. Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy. Eur Respir J. 33, (2009).
  9. Thiberville, L., et al. Confocal fluorescence endomicroscopy of the human airways. Proc Am Thorac Soc. 6, (5), 444-449 (2009).
  10. Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical imaging of bacterial infections. Clin. Transl. Imaging. 4, (3), 163-174 (2016).
  11. Akram, A. R., et al. A labelled-ubiquicidin antimicrobial peptide for immediate in situ optical detection of live bacteria in human alveolar lung tissue. Chem. Sci. 6, (12), 6971-6979 (2015).
  12. Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Huffnagle, G. B. Towards an ecology of the lung: new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis. Lancet Respir Med. 2, (3), 238-246 (2014).
  13. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, (9859), 2095-2128 (2012).
  14. Magiorakos, A. P., et al. The rise of carbapenem resistance in Europe: just the tip of the iceberg. Antimicrob Resist Infect Control. 2, (1), 6 (2013).
  15. Chastre, J., Fagon, J. -Y. Ventilator-associated Pneumonia. Am. J. Respir Crit Care Med. 165, (7), 867-903 (2002).
  16. Krstajić, N., et al. Two-color widefield fluorescence microendoscopy enables multiplexed molecular imaging in the alveolar space of human lung tissue. J Biomed Opt. 21, (4), 046009-046009 (2016).
Optisk Screening av romanen bakterier-spesifikke sonder på <em>Ex Vivo</em> menneskelige lungevev av AC Confocal Laser Endomicroscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).More

Mills, B., Akram, A. R., Scholefield, E., Bradley, M., Dhaliwal, K. Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy. J. Vis. Exp. (129), e56284, doi:10.3791/56284 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter