Summary

استهداف ثيولس سيستين في المختبر جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف

Published: October 04, 2017
doi:

Summary

التحليلات الكيميائية الحيوية والهيكلية للبروتينات الغليكوزيلاتي تتطلب كميات كبيرة نسبيا من عينات متجانسة. وهنا نقدم طريقة كيميائية فعالة جليكوسيليشن الخاصة بالموقع من البروتينات المؤتلف تنقيته من البكتيريا باستهداف رد الفعل Cys ثيولس.

Abstract

تفاعل stromal جزيء-1 (STIM1) نوع–أنا transmembrane البروتين الموجود على هيولى (ER) وأغشية البلازما (بعد الظهر). STIM1 ER-المقيم ينظم نشاط قنوات Orai1 م في عملية تعرف باسم مخزن الإدخال تعمل الكالسيوم (Ca2 +) الذي هو الرئيسي Ca2 + مما يشير إلى العملية التي تقود الاستجابة المناعية. يخضع STIM1 نبوستترانسلاشونال-جليكوسيليشن في موقعين Asn لومينال ضمن Ca2 + الاستشعار عن المجال للجزيء. ومع ذلك، الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية، والآثار البيولوجية هيكل من N-الغليكوزيلاتي STIM1 كانت غير مفهومة حتى مؤخرا بسبب عدم القدرة على سهولة الحصول على مستويات عالية من البروتين-الغليكوزيلاتي نمتجانسة. وهنا يصف لنا التنفيذ في المختبر الكيميائي النهج الذي تولي مويتيس الجلوكوز لمواقع البروتين محددة تنطبق على فهم آثار N-جليكوسيليشن الكامنة في بنية البروتين وآلية. استخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الحل نقوم بتقييم كفاءة كلا من التعديل، فضلا عن عواقب الهيكلي المرفق الجلوكوز مع عينة واحدة. هذا النهج يمكن تكييفها مع سهولة لدراسة البروتينات الغليكوزيلاتي العديدة الموجودة في الطبيعة.

Introduction

تخزين الكالسيوم تعمل (Ca2 +) إدخال (سوسي) هو الطريق الرئيسية التي تأخذ الخلايا المناعية يصل Ca2 + من الفضاء خارج الخلية إلى سيتوسول. في الخلايا اللمفية تي، ربط مستقبلات خلية تي يقع في غشاء البلازما (م) مولدات المضادات التي تنشيط بروتين تيروزين مؤنزم (استعرض في 1،،من23). سلسلة الفسفرة يؤدي إلى تنشيط phospholipase-γ (PLCγ) الذي يتوسط التحلل المائي لغشاء فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) فيما بعد إلى دياسيلجليسيرول واينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3 ). الملكية الفكرية3 هو رسول ديفوسيبلي صغيرة التي تلزم للملكية الفكرية3 مستقبلات (IP3R) في هيولى (ER) مما فتح هذه القناة مستقبلات وسمحت Ca2 + تدفق أسفل التدرج تركيز لائحة التجويف إلى سيتوسول (استعرض في 4). مستقبلات الإشارات من البروتين ز إلى جانب وتيروزين كيناز مستقبلات في مجموعة متنوعة من الرصاص أنواع منفعل وغير منفعل خلية أخرى لإنتاج نفس IP3 والتنشيط للملكية الفكرية3روبية.

سبب المحدودة Ca2 + السعة التخزينية للائحة، الملكية الفكرية3-الإفراج عن الوساطة والزيادة الناتجة في كاليفورنيا سيتوسوليك2 + فقط عابر؛ ومع ذلك، آثار هذا استنفاد ER لومينال Ca2 + عميقا نوع التفاعل stromal جزيء-1 (STIM1)،–أنا ترانسميمبراني (TM) العثور على البروتين معظمها على غشاء ER 5،،من67. STIM1 يحتوي على المنحى التجويف Ca2 + الاستشعار عن مجال تتكون من زوج EF-اليد والعقيمة α-عزر (أفسام). يتم فصل ثلاثة مجالات لفائف ملفوف المنحى سيتوسوليك من أفسام بالمجال TM واحد (في 8استعراض). عند ER Ca2 + نضوب لومينال، يخضع أفسام9 7،أوليجوميريزاتيون إلى جانب زعزعة الاستقرار التي تسبب ترتيبات هيكلية جديدة من الخرائط المواضيعية والمجالات لفائف ملفوف 10. تتوج هذه التغييرات الهيكلية في تعويض STIM1 في ER-م تقاطعات 11،12،،من1314 من خلال التفاعلات مع فوسفوينوسيتيديس الساعة 15، 16 و Orai1 مفارز 17،18. Orai1 البروتينات هي مفارز م فيها تجميع للنموذج Ca2 + قنوات 19،20،،من2122. تسهيل التفاعلات STIM1-Orai1 في تقاطعات ER-م فتح Ca2 + الإفراج عن تنشيط Ca2 + (قلعة) قناة المطابقة التي تمكن الحركة من Ca2 + في سيتوسول من تركيزات عالية الفضاء خارج الخلية. في الخلايا المناعية، حمل سيتوسوليك المطرد Ca2 + المرتفعات عبر قنوات قلعة Ca2 +-كالمودولين/calcineurin تعتمد ديفوسفوريليشن للعامل النووي من خلايا تي المنشط الذي يدخل بعد ذلك النواة و يبدأ تنظيم النسخي الجينات تعزيز تي خلية التنشيط 1،3. ما يسمى عملية التنشيط قناة قلعة STIM1 23،24 عن طريق فعل مؤثر ER لومينال Ca2 + نضوب والناتجة عن المطرد سيتوسوليك Ca2 + الارتفاع جماعي سوسي 25. يتضح الدور الحيوي الذي تؤديه سوسي في خلايا تي بدراسات تثبت أن الطفرات الموروثة في كل من STIM1 و Orai1 يمكن أن تسبب نقص المناعة المشتركة الشديد المتلازمات 3،،من1926، 27-يبدأ أفسام سوسي بعد الاستشعار ER لومينال Ca2 + استنفاد عبر فقدان Ca2 + التنسيق على يد EF الكنسي، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى رابطة الذاتي إلى جانب زعزعة الاستقرار 7، 28،29.

جليكوسيلاتيون هو مرفق التساهمية وتجهيز الهياكل oligosaccharide، ويعرف أيضا باسم جليكانس، من خلال مختلف الخطوات السكروز في ER وغولجي (استعرض في 30،،من3233). هناك نوعين الغالب من جليكوسيلاتيون في حقيقيات النوى: N-مرتبط و يا-مرتبطة، اعتماداً على الأحماض الأمينية المحددة وذرة سد الربط. ترفق أميد سلسلة جانبية من Asn في N-جليكوسيليشن، جليكانس، وفي معظم الحالات، يحدث خطوة البدء لائحة ببتيد سلسلة التحركات في التجويف 34. وتتمثل الخطوة الأولى من N-جليكوسيليشن نقل بنية أساسية أربعة عشر-السكر تتكون من الجلوكوز (الأخضر)، ويطلق (رجل) و نون-أسيتيلجلوكوساميني (جلكناك) (أي الأخضر3رجل9جلكناك2) من ER غشاء الدهن 35،أوليجوساكتشاريلترانسفيراسي36. مزيد من الخطوات، مثل الانقسام أو نقل مخلفات السكر، التي تحفزها لائحة محددة جليكوسيداسيس وجليكوسيلترانسفيراسيس. يمكن أن تكون بعض البروتينات التي تترك لائحة وأن تنتقل غولجي كذلك المجهزة 37. س-جليكوسيلاتيون يشير إلى إضافة جليكانس، عادة إلى مجموعة الهيدروكسيل سلسلة الجانب بقايا سر أو منتدى المجالس الرومانسية، ويحدث هذا التعديل تماما في 33،مجمع غولجي34. وهناك العديد من الهياكل-جليكان سالتي يمكن أن تتكون من N-أسيتيلجلوكوساميني، فوكوسي، واللبن، وإضافة حمض اللعابي مع كل أحادي التسلسل 33.

في حين تم التعرف على لا تسلسل معين كشرط أساسي لأنواع عديدة من س-جليكوسيلاتيون، ارتبط تسلسل آراء مشتركة N-يرتبط التعديل: Asn-X-Ser/الثريونين/Cys، حيث X يمكن أن يكون أي من الأحماض الأمينية ما عدا المحترفين 33. أفسام STIM1 يحتوي على اثنين من هذه المواقع-glycosylation توافق N: Asn131-Trp132-Thr133 و Asn171-Thr172-Thr173. وفي الواقع، أظهرت الدراسات السابقة أن أفسام ن-الغليكوزيلاتي في خلايا الثدييات في Asn131 و Asn171 38،39،،من4041. بيد أن الدراسات السابقة المترتبة على N-جليكوسيليشن على سوسي كانت تتعارض، مما يوحي بقمعها، بوتينتياتيد أو أي تأثير من هذا التعديل بوستترانسلاشونال في، سوسي التنشيط 38= “xref” >40،،3941. وهكذا، البحوث المتعلقة بآثار أفسام N-جليكوسيليشن الفيزيائية-الحيوية والكيمياء الحيوية والهيكلية الكامنة وراء أمر حيوي لفهم الآثار التنظيمية لهذا التعديل. بسبب الحاجة إلى مستويات عالية من البروتينات متجانسة في هذه التجارب في المختبر ، تم تطبيق نهج موقع انتقائي لإرفاق الجلوكوز مويتيس أفسام تساهمي. من المثير للاهتمام، جليكوسيليشن Asn131 و Asn171 بسبب التغييرات الهيكلية التي تتقارب داخل نواة أفسام وتحسين الخصائص الفيزيائية-الحيوية التي تنهض بوساطة STIM1 سوسي 42.

ملحق الكيميائية من جماعات glycosyl ثيولس Cys كانت راسخة بعمل المنوي التي أثبتت فائدة هذا النهج خال من إنزيم لفهم آثار خاصة بالموقع جليكوسيلاتيون على وظيفة البروتين 43 أولاً , 44-في الآونة الأخيرة، وفيما يتعلق STIM1، كانت تحور بقايا Asn131 و Asn171 إلى Cys و glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] وكان يستخدم لربط تساهمي الجلوكوز ثيولس الحرة 42. وهنا، يمكننا وصف هذا النهج الذي لا يستخدم الطفرات لإدراج موقع بقايا Cys محددة لتعديل فحسب، بل ينطبق أيضا على حل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) لسرعة تقييم كفاءة التعديل والهيكلية الاضطرابات نتيجة جليكوسيليشن. جدير بالذكر أن هذه المنهجية العامة يمكن تكييفها بسهولة دراسة آثار أما O-أو N-جليكوسيليشن أي ريكومبينانتلي إنتاج البروتين.

Protocol

1-تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)-وساطة الطفرات موقع الموجه لإدماج Cys في ناقل تعبير بكتيرية الحيوانات الأليفة-28 ألف- تحديد تركيز ناقلات الحيوانات الأليفة-28 ألف (أي دنا الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) معامل انقراض سم (ميكروغرام/مل) 0.020 <s…

Representative Results

الخطوة الأولى من هذا النهج يتطلب الطفرات مخلفات glycosylation المرشح لبقايا Cys التي يمكن أن تكون قابلة للتعديل باستخدام أفسام الجلوكوز-5-mts. قد لا توجد بقايا Cys الذاتية، حيث لا توجد اعتبارات خاصة بحاجة إلى بذل قبل الطفرات. بيد يجب أن تحور أصلي Cys بقايا لبقايا غير قابلة للتعديل قبل …

Discussion

جليكوسيليشن البروتين تعديل بوستترانسلاشونال حيث تساهمي المرفقة السكريات البروتينية أساسا عن طريق الروابط إلى سلاسل الحمض الأميني الجانبية. ما يصل إلى 50% بروتينات الثدييات هي الغليكوزيلاتي 54، حيث أن البروتينات الغليكوزيلاتي فيما بعد يمكن أن يكون مجموعة متنوعة من التأثيرات …

Acknowledgements

أيد هذا البحث العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية (05239 إلى P.B.S.)، والمؤسسة الكندية لصندوق بحوث الابتكار/أونتاريو (إلى P.B.S.)، ومؤسسة محاربة البروستات سرطان-ركوب تيلوس لأبي (ل P.B.S.) واونتاريو الحصول على منحة الدراسات العليا (ل Y.J.C. ونوفاسكوتيا).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

Play Video

Cite This Article
Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

View Video