Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1) bir türüdür-ben transmembran protein bulunan endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membran (AM). ER-resident STIM1 am Orai1 kanalları bağışıklık yanıtı sürücüler asıl Ca2 + sinyal gönderme işlemi olan işletilen kalsiyum (Ca2 +) girişi saklamak olarak bilinen bir süreç içinde etkinlik düzenlemektedir. STIM1 Ca2 + algılama etki molekülün içinde iki luminal Asn sitelerdeki post-translational N- glikozilasyon uğrar. Ancak, biyokimya, biyofizik, ve N- glikozile STIM1 yapısı biyolojik etkileri kötü kolaylıkla homojen N- glikozile protein yüksek seviyede elde etmek için son zamanlarda bir yetersizlik nedeniyle kadar anladım. Burada, hangi temel N- glikozilasyon protein yapısı ve etkileri mekanizmasını anlamak için ilgili belirli protein sitelere glikoz moieties verdiği bir vitro kimyasal yaklaşım uygulanması açıklanmaktadır. Çözüm Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak değişiklik her iki verimliliğini yanı sıra tek bir örnek glikoz ekli yapısal sonuçlarını değerlendirmek. Bu yaklaşım kolayca doğada bulunan sayısız glikozile proteinler çalışmaya adapte edilebilir.
Giriş
İşletilen kalsiyum (Ca2 +) depolamak girişidir (SOCE) hangi tarafından bağışıklık hücreleri almak Ca2 + sitozol ekstraselüler uzaya üzerinden büyük yol. T lenfositler, plazma zarı (PM) yer alan T hücre reseptör protein tirozin kinaz ( 1,2,3' te gözden) etkinleştirmek antijenleri bağlayın. Bir fosforilasyon çağlayan fosfolifaz-γ (PLCγ) hangi daha sonra diacylglycerol ve inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) hidroliz aracılık eder aktivasyonu yol açar ). IP3 konsantrasyon deg....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR)-site yönettiği mutagenesis Cys birleşme bir bakteriyel evde beslenen hayvan-28a ifade vektör içine aracılı.
- 260 0,020 (μg/mL) cm -1 ultraviyole (UV) nesli katsayısı kullanarak evde beslenen hayvan-28a vektör (Yani çift iplikçikli DNA) konsantrasyonu belirlemek nm.
- Sentez böyle her Cys mutasyon için tamamlayıcı mutajenik astar bir çift ben) tamamlayıcı ilk Bankası uyuşmazlığı ve 15 nukleotid sonra şablonu için tamamlayıcı önce şablon için en az 15 nükleotit son temel uyumsuzluğu, II) toplam astar uzunluğu 45 nukleotid ve III fazla değil) bir guanin veya sitozin her astar (tab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yaklaşımın ilk adım mutagenesis glikoz-5-MTS EFSAM kullanılarak değiştirilebilir olabilir Cys artıkları için aday glikozilasyon kalıntılarının yok endojen Cys artıkları, hiçbir özel hususlar öncesinde yapılması gereken bu yüzden gerektirir mutagenesis. Ancak, yerel Cys artıkları açıklanan kimya gerçekleştirmeden önce değiştirilebilir sigara artıkları mutasyona gerekir. En az yerli yapı etkisi için protein ilgi bir küresel dizi hizalaması yapmak öneririz ve diğer kalıntıları olan belirl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protein glikozilasyon nerede şekerler kovalent polipeptitler öncelikle amino asit yan zincirlerine bağlantıları aracılığıyla eklenen post-translational bir değişiklik olduğunu. Memeli proteinler en çok % 50'si olan glikozile 54, glikozile proteinler daha sonra biyomoleküler bağlama benzeşme değiştirme gelen etkileri çeşitli bir yelpazede içebileceğiniz, katlama, kanal etkinlik değiştirerek, hedefleme protein etkileyen molekülleri bozulması ve hücresel, devletlerde (33değerl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Bu araştırma Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (PBS için 05239), Kanada Vakfı tarafından desteklenmiştir yenilik/Ontario Araştırma Fonu (PBS için) prostat kanseri Vakfı - babama (PBS) ve Ontario Telus gezintiye mücadele Yüksek Lisans Burs (Y.J.C. ve NS).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Phusion DNA Polimeraz | Thermo Fisher Scientific | F530S | Adım 1.3'te kullanın. |
| Generuler 1kb DNA Merdiveni | Thermo Fisher Bilimsel | FERSM1163 | Adım 1.6'da kullanın. |
| DpnI Kısıtlama Enzimi | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Adım 1.8'de kullanın. |
| Presto Mini Plazmid Kiti | GeneAid, Inc. | PDH300 | Adım 1.16'da kullanın. |
| BL21 DE3 kodonu (+) E. coli | Agilent Teknolojileri, Inc. | 230280 | Adım 2.1'de kullanın. |
| DH5a E. coli | Canlandırıcı, Inc. | 18265017 | Adım 1.9'da kullanın. |
| 0.22 mm Şırınga Filtresi | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Adım 2.3'te kullanın. |
| HisPur Ni2+-NTA Agaroz Reçine | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Adım 3.3'te kullanın. |
| 3.500 Da MWCO Diyaliz Tüpü BioDesign | , Inc. | D306 | Adım 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 ve 4.6'da kullanın. |
| Sığır Trombin | BioPharm Laboratuvarları, Inc. | SKU91-055 | Adım 3.9'da kullanın. |
| 5 mL HiTrap Q FF Anyon Değişim Kolonu | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Adım 3.11'de kullanın. |
| Glikoz-5-MTS | Toronto Araştırma Kimyasalları, Inc. | G441000 | Adım 4.1'de kullanın. |
| Vivaspin 20 Ultrafiltrasyon Santrifüj Konsantratörleri | Sartorius, Inc. | VS2001 | Adım 3.11, 4.2, 4.5 ve 4.6'da kullanın. |
| PageRuler Lekesiz Geniş Protein Merdiveni | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Adım 3.7, 3.10 ve 3.15'te kullanın |
| HiTrap Q FF Anyon Değişim Sütunu | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Adım 3.12'de kullanın. |
| AKTA Saf Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Adım 3.14'te kullanın. |
| 600 MHz Varian Inova NMR Spektrometresi | Agilent Technologies, Inc. | Adım 5.2 ve 5.5'te kullanın. |
Kaynaklar
- Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
- Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012). <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
