Biokemiske og strukturelle analyser af glykosyleret proteiner kræver relativt store mængder af homogene prøver. Her præsenterer vi en effektiv kemisk metode for lokationsspecifikke glykosylering af rekombinante proteiner renset fra bakterier ved at målrette reaktive Cys dithioler.
Stromale interaktion molekyle-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein beliggende på endoplasmatiske reticulum (ER) og plasma membraner (PM). ER hjemmehørende STIM1 regulerer aktiviteten af PM Orai1 kanaler i en proces kendt som lagre drives calcium (Ca2 +) post, som er den vigtigste Ca2 + signaling proces, der drev immunresponset. STIM1 gennemgår posttranslationelle N– glykosylering på to luminale Asn websteder inden for Ca2 + sensing domæne af molekylet. Men de biokemiske, Biofysisk, og struktur biologiske virkninger af N– glykosyleret STIM1 var dårligt forstået indtil for nylig på grund af manglende evne til at let opnå høje niveauer af homogene N– glykosyleret protein. Her, beskriver vi gennemførelsen af en in vitro- kemiske tilgang, som lægger glukose fraspaltning til specifikke protein websteder gælder for forståelsen af de underliggende effekter af N– glykosylering på protein struktur og mekanisme. Ved hjælp af løsning Kernemagnetisk resonans-spektroskopi vurdere vi både effektiviteten af ændringen og de strukturelle konsekvenser af glucose vedhæftet fil med en enkelt prøve. Denne tilgang kan let tilpasses for at studere de utallige glykosyleret proteiner findes i naturen.
Gemme drives calcium (Ca2 +) post (SOCE) er den store vej som immunceller tage op Ca2 + fra det ekstracellulære rum i cytosol. I T-lymfocytter binder T-cellereceptorer placeret på plasma membran (PM) antigener, der aktiverer protein tyrosin kinaser (gennemgik i 1,2,3). En fosforylering kaskade fører til aktivering af fosfolipase-γ (PLCγ), som efterfølgende medierer hydrolyse af membran phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) til diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en små diffusible messenger, som binder til IP3 receptorer (IP3R) på det endoplasmatiske reticulum (ER) dermed åbne denne receptor kanal og tillader Ca2 + til at flyde ned koncentration gradient fra Skadestuen lumen til cytosol (gennemgik i 4). Receptor signalering fra G-protein koblet og tyrosin kinase receptorer i en lang række andre overgearet og ikke-overgearet celle typer bly til den samme produktion af IP3 og aktivering af IP3Rs.
På grund af finite Ca2 + lagerkapacitet på Skadestuen, IP3-medieret frigivelse og deraf følgende stigning i cytosole Ca2 + er kun forbigående; men denne udtynding ER luminale Ca2 + dybt effekter stromale interaktion molekyle-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein for det meste findes på ER membran 5,6,7. STIM1 indeholder en lumen-orienterede Ca2 + sensing domæne der består af en EF-hand par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosole-orienterede rullet coil domæner er adskilt fra EFSAM af domænet enkelt TM (gennemgik i 8). Efter ER luminale Ca2 + udtynding gennemgår EFSAM en destabilisering-kombineret oligomerisering 7,9 , som medfører strukturelle rearrangementer af TM og rullet coil domæner 10. Disse strukturelle ændringer kulminerer i en diffusering af STIM1 på ER-PM vejkryds 11,12,13,14 gennem interaktioner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 subunits 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheder, som samles til form Ca2 + -kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 interaktioner i ER-PM vejkryds lette en åben Ca2 + release aktiveret Ca2 + (CRAC) kanal kropsbygning som muliggør bevægelse af Ca2 + i cytosol fra de høje koncentrationer af den ekstracellulære rum. I immunceller, de vedvarende cytosole Ca2 + højder via CRAC kanaler fremkalde den Ca2 +– calmodulin/calcineurin afhængige dephosphorylation af den nukleare faktor af aktiverede T-celler, der efterfølgende ind kernen og begynder transkriptionel regulering af gener fremme T-celle aktivering 1,3. Processen med CRAC kanal aktivering af STIM1 23,24 via agonist-induceret ER luminale Ca2 + udtynding og den deraf følgende vedvarende cytosole Ca2 + højde kaldes kollektivt SOCE 25. SOCE i T-celler afgørende rolle fremgår af undersøgelser viser, at arvelige mutationer i både STIM1 og Orai1 kan forårsage svær kombineret immundefekt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM indleder SOCE efter sensing ER-luminale Ca2 + nedbrydning via tabet af Ca2 + koordinering på den kanoniske EF-side, i sidste ende fører til destabilisering-kombineret selvstændig forening 7, 28,29.
Glykosylering er kovalent udlæg og forarbejdning af oligosaccharid strukturer, også kendt som glycans, gennem forskellige biosyntetiske trin i ER og Golgi (gennemgik i 30,32,33). Der er to fremherskende typer af glykosylering i eukaryoter: N-sammenkædet og O-linket, afhængigt af den specifikke aminosyre og atom bridging koblingen. I N– glykosylering, glycans er knyttet til side kæde AMID af Asn, og i de fleste tilfælde opstår trinnet indledning på Skadestuen som polypeptid kæde flytter ind i lumen 34. Det første trin i N– glykosylering er overførsel af en fjorten-sukker core struktur bestående af glukose (Mona), mannose (mand) og N– acetylglukosamin (GlcNAc) (dvs. Ole3mand9GlcNAc2) fra en ER membran lipid af en oligosaccharyltransferase 35,36. Yderligere skridt, såsom kavalergang eller overførsel af glucose restkoncentrationer, er katalyseret på Skadestuen af specifikke glykosidaser og glycosyltransferases. Nogle proteiner, der forlader på Skadestuen og flytte ind i Golgi kan være yderligere forarbejdede 37. O– glykosylering refererer til tilsætning af glycans, normalt til side kæde hydroxylgruppe Ser eller Thr restkoncentrationer, og denne ændring forekommer udelukkende i Golgi kompleks 33,34. Der er flere O– glycan strukturer, som kan bestå af N– acetylglukosamin, fucose, galactose, og sialic syre med hver monosakkarid tilføjet sekventielt 33.
Mens ingen bestemt sekvens er blevet identificeret som forudsætning for mange typer af O– glykosylering, en fælles konsensus sekvens har været forbundet med N-forbundet ændring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan være enhver aminosyre undtagen Pro 33. STIM1 EFSAM indeholder to af disse konsensus N– glykosylering sites: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Tidligere undersøgelser har vist, at EFSAM kan være N– glykosyleret i pattedyrceller ved Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere undersøgelser af konsekvenserne af N– glykosylering på SOCE har været inkongruente, foreslår undertrykt, forstærkede eller ingen effekt af denne posttranslationel modifikation på SOCE aktivering 38,= “xref” > 39,40,41. Forskning på de underliggende biofysiske, biokemiske og strukturelle konsekvenser af EFSAM N– glykosylering er således afgørende at begribe de regulerende virkninger af denne ændring. På grund af kravet om, at høje niveauer af ensartede proteiner i disse in vitro- eksperimenter, blev en site-selektiv tilgang til kovalent tillægger EFSAM glukose fraspaltning anvendt. Det er interessant, forårsaget Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle ændringer, der konvergerer inden for EFSAM kernen og forbedre de biofysiske egenskaber, som fremmer STIM1-medieret SOCE 42.
Glycosyl grupper kemiske tillægger Cys dithioler har været veletablerede af en skelsættende arbejde, som første gang demonstreret nytte af dette enzym-fri tilgang til forståelsen af de lokationsspecifikke effekter af glykosylering på protein funktion 43 , 44. for nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester var muteret til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] blev brugt kovalent linke glukose til gratis dithioler 42. Her, beskriver vi denne tilgang, som ikke kun bruger mutagenese for at indarbejde site specifikke Cys restkoncentrationer for ændring, men gælder også løsning Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi til at hurtigt at vurdere både ændring effektivitet og struktur forstyrrelser som følge af glykosylering. Især denne generelle metode er let at tilpasse til at studere virkningerne af enten O– eller N– glykosylering af nogen recombinantly produceret protein.
Protein glykosylering er en posttranslationel modifikation hvor sukker er kovalent knyttet til polypeptider primært gennem forbindelser til aminosyre sidekæder. Så mange som 50% af pattedyr proteiner er glykosyleret 54, hvor glykosyleret proteiner kan efterfølgende har en bred vifte af effekter fra at ændre Biomolekylær bindende affinitet, påvirke protein foldning, ændre kanal aktivitet, målretning molekyler nedbrydning og cellulære handel, for at nævne et par stykker (gennemgik i<sup c…
Denne forskning blev støttet af naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (05239 til PBS), canadiske Foundation for Innovation/Ontario forskningsfond (til PBS), Prostata Cancer kæmpe Foundation – Telus Ride for far (til PBS) og Ontario Graduate stipendium (til Y.J.C. og N.S.).
Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |