Biokjemiske og strukturelle analyser av glycosylated proteiner krever relativt store mengder homogen prøver. Her presenterer vi en effektiv kjemisk metode for områdespesifikke glykosylering rekombinante proteiner renset fra bakterier av målretting reaktive Cys thiols.
Stromal samhandling molekyl-1 (STIM1) er en type-jeg transmembrane protein ligger på endoplasmatiske retikulum (ER) og plasma membraner (PM). ER-resident STIM1 regulerer aktiviteten til PM Orai1 kanaler i en prosess kjent som lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføring som er viktigste Ca2 + signalnettverk prosessen som driver immunrespons. STIM1 gjennomgår post-translasjonell N– glykosylering på to luminal Asn steder på Ca2 + sensing domenet for molekylet. Men den biokjemiske, Biofysiske, og strukturen biologiske effekter av N– glycosylated STIM1 var dårlig forstått til nylig på grunn av en manglende evne til å lett få høye nivåer av homogen N– glycosylated protein. Her beskriver vi gjennomføringen av i vitro kjemiske tilnærming som festes glukose moieties bestemt protein områder for forstå underliggende effekten av N– glykosylering på proteinstruktur og mekanisme. Bruke løsning kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi vurdere vi både effektiviteten av endring og strukturelle konsekvensene av glukose vedlegget med et enkelt utvalg. Denne tilnærmingen kan lett tilpasses for å studere utallige glycosylated proteiner som finnes i naturen.
Lagre styres kalsium (Ca2 +) oppføringen (SOCE) er den store sti som immunceller tar opp Ca2 + fra ekstracellulære plass i stoffer. I T-lymfocytter binde T celle reseptorer på plasma membranen (PM) antigener som aktiverer protein tyrosin kinaser (omtalt i 1,2,3). En fosforylering cascade fører til aktivering av fosfolipase-γ (PLCγ) som senere formidler hydrolyse av membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) i diacylglycerol og inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 ). IP3 er en liten diffusible budbringer som binder til IP3 reseptorer (IP3R) på det endoplasmatiske retikulum (ER) og dermed åpne denne reseptoren kanal og tillater Ca2 + å strømme ned konsentrasjon gradient fra ER lumen til stoffer (omtalt i 4). Reseptor signalering fra G protein kombinert og tyrosin kinase reseptorer i en rekke andre nervøs og ikke-nervøs cellen typer føre til samme produksjon av IP3 og aktivering av IP3Rs.
På grunn av begrenset Ca2 + lagringskapasiteten er, IP3-mediert utgivelsen og resulterende økning i cytosolic Ca2 + er bare forbigående; men denne uttømming av ER luminal Ca2 + dypt effekter stromal samhandling molekyl-1 (STIM1), en type-jeg transmembrane (TM) protein hovedsakelig funnet på ER membran 5,6,7. STIM1 inneholder et lumen orienterte Ca2 + sensing domene en EF-hånd par og sterile α-motiv (EFSAM). Tre cytosolic orienterte kveilet-coil domener er atskilt fra EFSAM av enkelt TM domenet (omtalt i 8). På ER luminal Ca2 + utarming gjennomgår EFSAM en destabilisering-kombinert oligomerization 7,9 som forårsaker strukturelle rearrangements TM og kveilet-coil domener 10. Disse strukturelle endringer kulminerte i en overlapping av STIM1 ER-PM veikryss 11,12,13,14 gjennom interaksjoner med PM phosphoinositides 15, 16 og Orai1 underenheter 17,18. Orai1 proteiner er PM underenheter som monterer skjemaet Ca2 + kanaler 19,20,21,22. STIM1-Orai1 vekselsvirkningene på ER-PM veikryss lette en åpen Ca2 + utgivelsen aktivert Ca2 + (CRAC) kanal konformasjon som gjør denne bevegelsen av Ca2 + stoffer fra de høye konsentrasjonene av den ekstracellulære plass. I immunceller, den vedvarende cytosolic Ca2 + høyder via CRAC kanaler indusere av Ca2 +– calmodulin/calcineurin avhengige dephosphorylation av den kjernefysiske faktoren av aktivert T-celler som senere går inn i kjernen og begynner transcriptional regulering av gener fremme T-celle aktivering 1,3. Prosessen med CRAC kanal aktivering av STIM1 23,24 via agonist-indusert ER luminal Ca2 + uttømming og den resulterende vedvarende cytosolic Ca2 + høyden kalles samlet SOCE 25. Den viktige rollen SOCE i T-celler er tydelig ved studier viser at arvelige mutasjoner i både STIM1 og Orai1 kan forårsake alvorlig kombinert immunsvikt syndromer 3,19,26, 27. EFSAM starter SOCE etter sensing ER luminal Ca2 + uttømming via tapet av Ca2 + koordinering på kanonisk EF-hånd, til slutt fører til destabilisering-kombinert selv association 7, 28,29.
Glykosylering er kovalente vedlegg og behandling av oligosaccharide strukturer, også kjent som glykaner, gjennom biosyntetiske trinnene i ER og Golgi (omtalt i 30,32,33). Det er to dominerende typer glykosylering i eukaryoter: N-koblede og O-koblet, avhengig av spesifikke aminosyre og atom bygge bro sammenhengen. I N– glykosylering, legges glykaner side kjede amid av Asn, og i de fleste tilfeller oppstår innledes trinn i ER som polypeptid kjeden flytter inn lumen 34. Det første trinnet i N– glykosylering er overføring av en fjorten-sukker kjernen struktur består av glukose (Glc), mannose (mann) og N– acetylglucosamine (GlcNAc) (dvs. Glc3Man9GlcNAc2) fra en ER membran lipid av en oligosaccharyltransferase 35,36. Ytterligere skritt, for eksempel spalting eller overføring av glukose rester, er katalysert på Akutten av spesifikke glycosidases og glycosyltransferases. Noen proteiner som la ER og flytte til Golgi kan bli ytterligere behandlet 37. O– glykosylering refererer til tillegg av glykaner, vanligvis til side kjede hydroksyl gruppe Ser eller Thr rester, og denne endringen oppstår helt i Golgi komplekset 33,34. Det er flere O– glycan strukturer som kan bestå av N– acetylglucosamine, fucose, galaktose, og sialic syre med hver enkle sukkerarter lagt sekvensielt 33.
Mens ingen bestemt sekvens har blitt identifisert som forutsetning for mange typer O– glykosylering, en felles konsensus-sekvens har blitt assosiert med N-koblet endring: Asn-X-Ser/Thr/Cys, hvor X kan alle aminosyre unntatt Pro 33. STIM1 EFSAM inneholder to av disse konsensus N– glykosylering: Asn131-Trp132-Thr133 og Asn171-Thr172-Thr173. Faktisk har tidligere studier vist at EFSAM kan være N– glycosylated i pattedyrceller på Asn131 og Asn171 38,39,40,41. Men tidligere studier av konsekvensene av N– glykosylering på SOCE er incongruent, tyder undertrykt, kraftig eller ingen effekt av denne post-translasjonell modifikasjon på SOCE aktivisering 38,= “xref” > 39,40,41. Dermed er forskning på de underliggende Biofysiske biokjemiske og strukturelle konsekvensene av EFSAM N– glykosylering viktig å forstå de regulatoriske effektene av denne endringen. På behovet for høye nivåer av homogen proteiner i disse i vitro eksperimenter, ble en område-selektiv tilnærming til covalently fest glukose moieties til EFSAM brukt. Interessant, forårsaket Asn131 og Asn171 glykosylering strukturelle endringer som samles i EFSAM kjernen og forbedre egenskapene Biofysiske som fremmer STIM1-mediert SOCE 42.
Kjemisk vedlegget glycosyl grupper på Cys thiols er blitt godt etablert av banebrytende arbeid som første gang påvist nytten av dette enzymet-fri tilnærming til å forstå det stedsspesifikke effekten av glykosylering på protein funksjonen 43 , 44. nylig og med hensyn til STIM1, Asn131 og Asn171 rester ble mutert til Cys og glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] ble brukt covalently koble glukose til gratis thiols 42. Her beskriver vi denne tilnærmingen som ikke bare bruker mutagenese for å innlemme området bestemte Cys rester for endring, men også gjelder løsning kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) spektroskopi å raskt vurdere endring effektivitet og strukturelle forstyrrelser som følge av glykosylering. Spesielt denne generelle metodikk er lett tilpasses studere virkningene av enten O– eller N– glykosylering av recombinantly produsert protein.
Protein glykosylering er en post-translasjonell modifikasjon der sukker covalently knyttet til polypeptides primært gjennom sammenhengene til aminosyre siden kjeder. Så mange som 50% av pattedyr proteiner er glycosylated 54, der glycosylated proteinene kan senere har et variert utvalg av effekter fra endre biomolecular forpliktende tilhørighet, påvirke protein folding, endre kanal aktivitet, målretting molekyler for fornedrelse og cellular handel, for å nevne noen (omtalt i…
Denne forskningen ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (05239 til P.B.S.), kanadiske fundament for innovasjon/Ontario Research Fund (til P.B.S.), prostata kreft bekjempe Foundation – Telus Ride for far (til P.B.S.) og Ontario Graduate Scholarship (til Y.J.C. og født).
Phusion DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | Use in step 1.3. |
Generuler 1kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1163 | Use in step 1.6. |
DpnI Restriction Enzyme | New England Biolabs, Inc. | R0176 | Use in step 1.8. |
Presto Mini Plasmid Kit | GeneAid, Inc. | PDH300 | Use in step 1.16. |
BL21 DE3 codon (+) E. coli | Agilent Technologies, Inc. | 230280 | Use in step 2.1. |
DH5a E. coli | Invitrogen, Inc. | 18265017 | Use in step 1.9. |
0.22 mm Syringe Filter | Millipore, Inc. | SLGV033RS | Use in step 2.3. |
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin | Thermo Fisher Scientific | 88221 | Use in step 3.3. |
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing | BioDesign, Inc. | D306 | Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6. |
Bovine Thrombin | BioPharm Laboratories, Inc. | SKU91-055 | Use in step 3.9. |
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5156-01 | Use in step 3.11. |
Glucose-5-MTS | Toronto Research Chemicals, Inc. | G441000 | Use in step 4.1. |
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators | Sartorius, Inc. | VS2001 | Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6. |
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26630 | Use in step 3.7, 3.10 and 3.15 |
HiTrap Q FF Anion Exchange Column | GE Healthcare, Inc. | 17-5053-01 | Use in step 3.12. |
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System | GE Healthcare, Inc. | 29018224 | Use in step 3.14. |
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | Use in step 5.2 and 5.5. |