Summary

Direcionamento de tióis cisteína para in Vitro site-specific glicosilação de proteínas recombinantes

Published: October 04, 2017
doi:

Summary

Análises bioquímicas e estruturais das proteínas glicosilados requerem relativamente grandes quantidades de amostras homogêneas. Aqui, apresentamos um método químico eficiente para site-specific glicosilação de proteínas recombinantes purificado a partir de bactérias pela segmentação reativa Cys tióis.

Abstract

Do estroma interação molécula-1 (STIM1) é um tipo-eu proteína transmembrana localizado no retículo endoplasmático (ER) e membranas de plasma (PM). ER-residente STIM1 regula a atividade de PM Orai1 canais em um processo conhecido como armazenar entrada operado de cálcio (Ca2 +), que é o principal Ca2 + sinalização processo que orienta a resposta imune. STIM1 sofre N– glicosilação pós-traducional em dois locais de Asn luminal dentro do Ca2 + sensoriamento domínio da molécula. No entanto, a bioquímica, biofísica, e efeitos biológicos de estrutura de N– glicosilados STIM1 foram mal compreendidos até recentemente devido a uma incapacidade para obter facilmente altos níveis de proteína de – glicosilados homogênea N. Aqui, descrevemos a implementação de uma em vitro abordagem química que une partes de glicose para sites de proteína específica aplicáveis para entender os efeitos subjacentes do N– glicosilação na estrutura da proteína e mecanismo. Usando a espectroscopia de ressonância magnética nuclear de solução avaliamos tanto eficiência da modificação, bem como as consequências estruturais do acessório glicose com uma única amostra. Esta abordagem pode ser adaptada facilmente para estudar as proteínas miríade glicosilados encontradas na natureza.

Introduction

Armazene operado de cálcio (Ca2 +) entrada (SOCE) é a principal via pela qual as células imunes ocupam Ca2 + do espaço extracelular para o citoplasma. Em linfócitos T, células T receptores situados na membrana plasmática (PM) ligam antígenos que ativam quinases de proteína tirosina (revistos em 1,2,3). Uma cascata de fosforilação leva à ativação da fosfolipase-γ (PLCγ), que posteriormente, Medeia a hidrólise da membrana fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) em diacilglicerol e inositol 1, 4,5-triphosphate (IP3 ). IP3 é um pequeno mensageiro diffusible que liga ao IP3 receptores (IP3R) sobre o retículo endoplasmático (ER), assim, abrindo este canal receptor e permitindo Ca2 + para fluir para baixo o gradiente de concentração da emergência lúmen para o citosol (revisto em 4). Receptor de sinalização da proteína G acoplada e receptores de tirosina quinase em uma variedade de outra células não-excitáveis e excitável tipos chumbo para a mesma produção de IP3 e a ativação do IP3Rs.

Devido a Ca2 + armazenamento capacidade finita do PS, o IP3-liberação mediada e resultante aumento citosólico Ca2 + é apenas transitório; no entanto, esta depleção do ER luminal Ca2 + profundamente efeitos do estroma interação molécula-1 (STIM1), um tipo-eu transmembrana (TM) proteína encontrada principalmente no ER membrana 5,6,7. STIM1 contém um lúmen-orientado Ca2 + sensoriamento domínio composto por um par de EF-mão e estéril α-motif (EFSAM). Três domínios coiled-coil citosólica orientado são separados da EFSAM pelo domínio do TM único (revisto em 8). Em cima de ER luminal Ca2 + da prostração, EFSAM sofre uma desestabilização acoplados oligomerização 7,9 que faz com que rearranjos estruturais do TM e domínios coiled-coil 10. Estas mudanças estruturais culminaram em uma captura de STIM1 ER-PM entroncamentos 11,12,13,14 através de interações com remodelamento PM 15, 16 e de Orai1 subunidades 17,18. Orai1 proteínas são as subunidades de PM que montam para formar Ca2 + canais de de21, 19,20,22. As interações de STIM1-Orai1 nos cruzamentos de ER-PM facilitam uma aberto Ca2 + lançamento ativado Ca2 + (CRAC) canal conformação que permite a circulação de Ca2 + para o citosol das altas concentrações do no espaço extracelular. Em células do sistema imunológico, as sustentado citosólico Ca2 + elevações através de canais de CRAC induzem a Ca2 +– calmodulina/calcineurina dependente desfosforilação do fator nuclear das células T ativadas que posteriormente entra no núcleo e começa o Regulamento transcricional de genes, promovendo a ativação de células T 1,3. O processo de ativação de canal CRAC por STIM1 23,24 via induzida pelo agonista ER luminal Ca2 + depleção e a resultante sustentado citosólico Ca2 + elevação é coletivamente denominado SOCE 25. O papel vital da SOCE em células T é evidente por estudos demonstrando que hereditários mutações em ambos os STIM1 e Orai1 podem causar imunodeficiência combinada grave síndromes 3,19,26, 27. EFSAM inicia SOCE após detecção ER-luminal Ca2 + depleção através da perda de Ca2 + coordenação no canônico EF-lado, finalmente levando à desestabilização acoplados auto associação 7, 28,29.

Glycosylation é a ligação covalente e processamento de estruturas de oligossacarídeo, também conhecido como os glicanos, através de várias etapas biossintéticas no ER e Golgi (revisto em 30,32,33). Existem dois tipos predominantes de glicosilação em eucariontes: N-vinculado e O-ligada, dependendo do aminoácido específico e átomo colmatar o enlace. Na N– glicosilação, os glicanos são anexados a amida de cadeia lateral do Asn, e na maioria dos casos, a etapa de iniciação ocorre no PS como o polipeptídeo cadeia move-se para o lúmen 34. O primeiro passo do N– glicosilação é a transferência de uma núcleo de quatorze-açúcar estrutura composta de glicose (Glc), manose (homem) e N– acetilglicosamina (GlcNAc) (ou seja, Glc3homem9GlcNAc2) da emergência lipídios de membrana por uma oligosaccharyltransferase 35,36. Outras medidas, tais como a clivagem ou transferência de resíduos de glicose, são catalisadas nas urgências por glycosyltransferases e glicosidases específico. Algumas proteínas que deixe o ER e mover para o Golgi podem ser ainda mais processados 37. O– glicosilação refere-se à adição dos glicanos, geralmente para o grupo hidroxila de cadeia lateral de resíduos Ser ou Thr, e essa modificação ocorre inteiramente no complexo de Golgi 33,34. Existem várias estruturas de glicano – Oque podem ser feitas de N– acetilglicosamina, fucose, galactose e ácido siálico com cada monossacarídeo adicionado sequencialmente 33.

Enquanto nenhuma sequência específica foi identificada como pré-requisito para muitos tipos de O– glicosilação, uma sequência de consenso comum tem sido associada com a N-ligados a modificação: Asn-X-Ser/Thr/Cys, onde X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro 33. STIM1 EFSAM contém dois desses sites – glicosilação do consenso N: Asn131-Trp132-Thr133 e Asn171-Thr172-Thr173. De fato, estudos anteriores mostraram que EFSAM pode ser N– glicosilados em células de mamíferos em Asn131 e Asn171 38,39,40,41. No entanto, estudos anteriores sobre as consequências da N– glicosilação na SOCE tem sido incongruentes, sugerindo suprimida, potencializado ou nenhum efeito por esta modificação borne-translational na SOCE ativação 38,= “xref” > 39 de40,,41. Assim, a investigação sobre as consequências de biofísicas, bioquímicas e estruturais subjacentes de EFSAM N– glicosilação é vital para compreender os efeitos regulatórios da modificação. Devido à exigência de altos níveis de proteínas homogêneas nesses experimentos em vitro , foi aplicada uma abordagem local-seletiva covalentemente anexar partes de glicose para EFSAM. Curiosamente, Asn131 e Asn171 de glicosilação causou mudanças estruturais que convergem dentro do núcleo EFSAM e aumentar as propriedades biofísicas que promovem SOCE mediada por STIM1 42.

O sistema químico de glycosyl grupos de tióis Cys tem sido bem estabelecido por uma obra seminal que primeiro demonstrou a utilidade desta abordagem de enzima livre para entender os efeitos específicos do site da glicosilação na proteína função 43 , 44. mais recentemente e com respeito a STIM1, os resíduos de Asn131 e Asn171 foram uma mutação de Cys e glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] foi usado para ligar covalentemente glicose para a enciclopédia tióis 42. Aqui, descrevemos esta abordagem que não só usa o mutagenesis de incorporar resíduos de Cys local específicos para a modificação, mas também se aplica a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) solução para avaliar rapidamente a eficiência de modificação e estrutural perturbações como resultado da glicosilação. Notavelmente, esta metodologia geral é facilmente adaptável para estudar os efeitos de ambos O– ou N– glicosilação de qualquer recombinantes produzidos a proteína.

Protocol

1. reação em cadeia da polimerase (PCR)-mediada mutagenesis local-dirigido para a incorporação de CIS em um vetor de expressão de animal de estimação-28a bacteriana. Determinar a concentração do animal de estimação-28a vector (ou seja, ADN encalhado dobro) usando um coeficiente de extinção ultravioleta (UV) de 0,020 (μg/mL) cm -1 em 260 nm. Sintetizar um par de primers mutagénicas complementares para cada mutação Cys tais que eu) há um mínimo de 15 nucleotídeos…

Representative Results

A primeira etapa desta abordagem requer a mutagênese dos resíduos de glicosilação candidato a Cys resíduos, que podem ser modificados usando a glicose-5-MTS. EFSAM tem sem resíduos de Cys endógenos, então não há considerações especiais que precisam ser feitas antes do mutagênese. No entanto, nativo Cys de resíduos devem ser uma mutação de resíduos não-modificável antes de realizar a química descrita. Ao efeito minimamente a estrutura nativa, sugerimos realizar um alinh…

Discussion

Proteína glycosylation é uma modificação pós-traducional onde açúcares estão covalentemente ligados a polipeptídeos principalmente através de ligações com cadeias laterais de aminoácidos. Até 50% de proteínas de mamíferos são glicosilados 54, onde as proteínas glicosilados posteriormente podem ter uma variada gama de efeitos de alterando a afinidade de ligação biomolecular, influenciando a proteína dobráveis, alterando a atividade do canal, visando moléculas para celular tr?…

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pela ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (05239 de P.B.S), Fundação Canadense para a inovação/Ontario Research Fund (de P.B.S), Fundação de lutar próstata câncer – Telus Ride para o pai (PBS) e Ontário Bolsa de pós-graduação (para Y.J.C. e N.S.).

Materials

Phusion DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530S Use in step 1.3.
Generuler 1kb DNA Ladder Thermo Fisher Scientific FERSM1163 Use in step 1.6.
DpnI Restriction Enzyme New England Biolabs, Inc. R0176 Use in step 1.8.
Presto Mini Plasmid Kit GeneAid, Inc. PDH300 Use in step 1.16.
BL21 DE3 codon (+) E. coli Agilent Technologies, Inc. 230280 Use in step 2.1.
DH5a E. coli Invitrogen, Inc. 18265017 Use in step 1.9.
0.22 mm Syringe Filter Millipore, Inc. SLGV033RS Use in step 2.3.
HisPur Ni2+-NTA Agarose Resin Thermo Fisher Scientific 88221 Use in step 3.3.
3,500 Da MWCO Dialysis Tubing BioDesign, Inc. D306 Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.
Bovine Thrombin BioPharm Laboratories, Inc. SKU91-055 Use in step 3.9.
5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5156-01 Use in step 3.11.
Glucose-5-MTS Toronto Research Chemicals, Inc. G441000 Use in step 4.1.
Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators Sartorius, Inc. VS2001 Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.
PageRuler Unstained Broad Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26630 Use in step 3.7, 3.10 and 3.15
HiTrap Q FF Anion Exchange Column GE Healthcare, Inc. 17-5053-01 Use in step 3.12.
AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System GE Healthcare, Inc. 29018224 Use in step 3.14.
600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer Agilent Technologies, Inc. Use in step 5.2 and 5.5.

References

  1. Feske, S. Calcium signalling in lymphocyte activation and disease. Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).
  2. Feske, S., Skolnik, E. Y., Prakriya, M. Ion channels and transporters in lymphocyte function and immunity. Nat Rev Immunol. 12 (7), 532-547 (2012).
  3. Shaw, P. J., Feske, S. Physiological and pathophysiological functions of SOCE in the immune system. Front Biosci (Elite Ed). 4, 2253-2268 (2012).
  4. Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim Biophys Acta. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
  5. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural aspects of calcium-release activated calcium channel function. Channels (Austin). 7 (5), 344-353 (2013).
  6. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structure and function of endoplasmic reticulum STIM calcium sensors. Curr Top Membr. 71, 59-93 (2013).
  7. Stathopulos, P. B., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ames, J. B., Ikura, M. Stored Ca2+ depletion-induced oligomerization of stromal interaction molecule 1 (STIM1) via the EF-SAM region: An initiation mechanism for capacitive Ca2+ entry. J Biol Chem. 281 (47), 35855-35862 (2006).
  8. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Store operated calcium entry: From concept to structural mechanisms. Cell Calcium. , (2016).
  9. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structurally delineating stromal interaction molecules as the endoplasmic reticulum calcium sensors and regulators of calcium release-activated calcium entry. Immunol Rev. 231 (1), 113-131 (2009).
  10. Muik, M., et al. STIM1 couples to ORAI1 via an intramolecular transition into an extended conformation. EMBO J. 30 (9), 1678-1689 (2011).
  11. Luik, R. M., Wang, B., Prakriya, M., Wu, M. M., Lewis, R. S. Oligomerization of STIM1 couples ER calcium depletion to CRAC channel activation. Nature. 454 (7203), 538-542 (2008).
  12. Luik, R. M., Wu, M. M., Buchanan, J., Lewis, R. S. The elementary unit of store-operated Ca2+ entry: local activation of CRAC channels by STIM1 at ER-plasma membrane junctions. J Cell Biol. 174 (6), 815-825 (2006).
  13. Wu, M. M., Buchanan, J., Luik, R. M., Lewis, R. S. Ca2+ store depletion causes STIM1 to accumulate in ER regions closely associated with the plasma membrane. J Cell Biol. 174 (6), 803-813 (2006).
  14. Liou, J., Fivaz, M., Inoue, T., Meyer, T. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+ store depletion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (22), 9301-9306 (2007).
  15. Calloway, N., et al. Stimulated association of STIM1 and Orai1 is regulated by the balance of PtdIns(4,5)P(2) between distinct membrane pools. J Cell Sci. 124 (Pt 15), 2602-2610 (2011).
  16. Korzeniowski, M. K., et al. Dependence of STIM1/Orai1-mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem. 284 (31), 21027-21035 (2009).
  17. Park, C. Y., et al. STIM1 clusters and activates CRAC channels via direct binding of a cytosolic domain to Orai1. Cell. 136 (5), 876-890 (2009).
  18. Yuan, J. P., et al. SOAR and the polybasic STIM1 domains gate and regulate Orai channels. Nat Cell Biol. 11 (3), 337-343 (2009).
  19. Feske, S., et al. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function. Nature. 441 (7090), 179-185 (2006).
  20. Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
  21. Vig, M., et al. CRACM1 multimers form the ion-selective pore of the CRAC channel. Curr Biol. 16 (20), 2073-2079 (2006).
  22. Vig, M., et al. CRACM1 is a plasma membrane protein essential for store-operated Ca2+ entry. Science. 312 (5777), 1220-1223 (2006).
  23. Liou, J., et al. STIM is a Ca2+ sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+ influx. Curr Biol. 15 (13), 1235-1241 (2005).
  24. Roos, J., et al. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol. 169 (3), 435-445 (2005).
  25. Putney, J. W. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium. 7 (1), 1-12 (1986).
  26. Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. 460 (2), 417-435 (2010).
  27. Maus, M., et al. Missense mutation in immunodeficient patients shows the multifunctional roles of coiled-coil domain 3 (CC3) in STIM1 activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6206-6211 (2015).
  28. Stathopulos, P. B., Zheng, L., Li, G. Y., Plevin, M. J., Ikura, M. Structural and mechanistic insights into STIM1-mediated initiation of store-operated calcium entry. Cell. 135 (1), 110-122 (2008).
  29. Stathopulos, P. B., Ikura, M. Partial unfolding and oligomerization of stromal interaction molecules as an initiation mechanism of store operated calcium entry. Biochem Cell Biol. 88 (2), 175-183 (2010).
  30. Dennis, J. W., Lau, K. S., Demetriou, M., Nabi, I. R. Adaptive regulation at the cell surface by N-glycosylation. Traffic. 10 (11), 1569-1578 (2009).
  31. Nilsson, T., Au, C. E., Bergeron, J. J. Sorting out glycosylation enzymes in the Golgi apparatus. FEBS Lett. 583 (23), 3764-3769 (2009).
  32. Stanley, P. Golgi glycosylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (4), (2011).
  33. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
  34. Gerlach, J., Sharma, S., Leister, K., Joshi, L., Agostinis, P., Afshin, S. . Endoplasmic Reticulum Stress in Health and Disease. , 23-39 (2012).
  35. Pearse, B. R., Hebert, D. N. Lectin chaperones help direct the maturation of glycoproteins in the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 684-693 (2010).
  36. Stanley, P., Sundaram, S. Rapid assays for lectin toxicity and binding changes that reflect altered glycosylation in mammalian cells. Curr Protoc Chem Biol. 6 (2), 117-133 (2014).
  37. Avezov, E., Frenkel, Z., Ehrlich, M., Herscovics, A., Lederkremer, G. Z. Endoplasmic reticulum (ER) mannosidase I is compartmentalized and required for N-glycan trimming to Man5-6GlcNAc2 in glycoprotein ER-associated degradation. Mol Biol Cell. 19 (1), 216-225 (2008).
  38. Csutora, P., et al. Novel role for STIM1 as a trigger for calcium influx factor production. J Biol Chem. 283 (21), 14524-14531 (2008).
  39. Kilch, T., et al. Mutations of the Ca2+-sensing stromal interaction molecule STIM1 regulate Ca2+ influx by altered oligomerization of STIM1 and by destabilization of the Ca2+ channel Orai1. J Biol Chem. 288 (3), 1653-1664 (2013).
  40. Williams, R. T., et al. Stromal interaction molecule 1 (STIM1), a transmembrane protein with growth suppressor activity, contains an extracellular SAM domain modified by N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta. 1596 (1), 131-137 (2002).
  41. Mignen, O., Thompson, J. L., Shuttleworth, T. J. STIM1 regulates Ca2+ entry via arachidonate-regulated Ca2+-selective (ARC) channels without store depletion or translocation to the plasma membrane. J Physiol. 579 (Pt 3), 703-715 (2007).
  42. Choi, Y. J., Zhao, Y., Bhattacharya, M., Stathopulos, P. B. Structural perturbations induced by Asn131 and Asn171 glycosylation converge within the EFSAM core and enhance stromal interaction molecule-1 mediated store operated calcium entry. Biochim Biophys Acta. 1864 (6), 1054-1063 (2017).
  43. Davis, B. G., Lloyd, R. C., Jones, J. B. Controlled site-selective protein glycosylation for precise glycan structure-catalytic activity relationships. Bioorg Med Chem. 8 (7), 1527-1535 (2000).
  44. Gamblin, D. P., van Kasteren, S. I., Chalker, J. M., Davis, B. G. Chemical approaches to mapping the function of post-translational modifications. FEBS J. 275 (9), 1949-1959 (2008).
  45. Ehrt, S., Schnappinger, D. Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis. Methods Mol Biol. 235, 75-78 (2003).
  46. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Bell, D. J. Mass spectrometry. Methods Mol Biol. 244, 447-454 (2004).
  49. Domon, B., Aebersold, R. Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  50. Farrow, N. A., et al. Backbone Dynamics of a Free and a Phosphopeptide-Complexed Src Homology-2 Domain Studied by N-15 Nmr Relaxation. Biochemistry. 33 (19), 5984-6003 (1994).
  51. Kay, L. E., Keifer, P., Saarinen, T. Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity. Journal of the American Chemical Society. 114 (26), 10663-10665 (1992).
  52. Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J Biomol NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  53. Masse, J. E., Keller, R. AutoLink: automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. J Magn Reson. 174 (1), 133-151 (2005).
  54. Monticelli, M., Ferro, T., Jaeken, J., Dos Reis Ferreira, V., Videira, P. A. Immunological aspects of congenital disorders of glycosylation (CDG): a review. J Inherit Metab Dis. 39 (6), 765-780 (2016).
  55. An, H. J., Kronewitter, S. R., de Leoz, M. L., Lebrilla, C. B. Glycomics and disease markers. Curr Opin Chem Biol. 13 (5-6), 601-607 (2009).
  56. Wani, W. Y., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V., McMahon, L. L., Zhang, J. O-GlcNAcylation and neurodegeneration. Brain Res Bull. , (2016).
  57. Haines, A. M., Tobe, S. S., Kobus, H. J., Linacre, A. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis. Electrophoresis. 36 (6), 941-944 (2015).

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Choi, Y. J., Zhu, J., Chung, S., Siddiqui, N., Feng, Q., Stathopulos, P. B. Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins. J. Vis. Exp. (128), e56302, doi:10.3791/56302 (2017).

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