तरल पदार्थ और कोशिकाओं के एक उच्च प्रवाह शीत शारीरिक प्लाज्मा उपचार प्रोटोकॉल दिखाया गया है । यह प्लाज्मा प्रज्वलन के लिए अलग फ़ीड गैस रचनाओं की स्थापना शामिल है, प्लाज्मा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को मापने, और प्लाज्मा उपचार के बाद तरल पदार्थ और सेलुलर गतिविधि के बाद के विश्लेषण.
प्लाज्मा चिकित्सा में, तापमान के साथ हड्डीवाला प्रणालियों के करीब है कि कोशिकाओं और ऊतकों के लिए लागू कर रहे हैं । शीत प्लाज्मा redox स्वास्थ्य और रोग में जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता प्रतिक्रियाशील प्रजातियों उत्पन्न करते हैं । पूर्व नैदानिक और नैदानिक सबूत त्वचा के जीर्ण अल्सर की चिकित्सा में प्लाज्मा उपचार के लाभकारी प्रभाव के लिए अंक । ऐसे प्लाज्मा कैंसर के इलाज के रूप में अंय उभरते विषयों, बढ़ती ध्यान प्राप्त कर रहे हैं । प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान भौतिकी, रसायन विज्ञान, और जैव चिकित्सा में अनुशासनात्मक विशेषज्ञता की आवश्यकता है । प्लाज्मा अनुसंधान के एक लक्ष्य के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों की एक किस्म में प्लाज्मा इलाज कोशिकाओं की विशेषता है । यह शामिल है, उदाहरण के लिए, सेल गणना और व्यवहार्यता, सेलुलर ऑक्सीकरण, mitochondrial गतिविधि, cytotoxicity और कोशिका मृत्यु के मोड, कोशिका चक्र विश्लेषण, सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति, और cytokine रिलीज. इस अध्ययन के प्लाज्मा में इस तरह के अनुसंधान के लिए आवश्यक उपकरणों और कार्यप्रवाह की आवश्यकता का वर्णन है । यह एक वायुमंडलीय दबाव आर्गन प्लाज्मा जेट के समुचित संचालन का वर्णन, विशेष रूप से अपने बुनियादी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की निगरानी और प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन को मिलाना करने के लिए फ़ीड गैस सेटिंग्स. एक उच्च परिशुद्धता xyz-टेबल और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, जेट मिलीसेकंड में मंडराता है-९६ के गुहाओं पर परिशुद्धता-अच्छी तरह से माइक्रोमीटर में प्लेटें-परिशुद्धता के लिए अधिक से अधिक reproducibility । redox के तरल विश्लेषण के लिए बहाव परख-सक्रिय अणुओं दिखाया जाता है, और लक्ष्य कोशिकाओं प्लाज्मा इलाज कर रहे हैं । विशेष रूप से, मेलेनोमा कोशिकाओं अलग लगातार परख के एक कुशल अनुक्रम में विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन एक ही कोशिकाओं का उपयोग: चयापचय गतिविधि की माप, कुल सेल क्षेत्र, और calreticulin की सतह मार्कर अभिव्यक्ति, एक के लिए महत्वपूर्ण अणु immunogenic कोशिका कैंसर कोशिकाओं की मौत । इन परख एक ही प्लेट से प्लाज्मा प्रभाव के बारे में सामग्री समृद्ध जैविक जानकारी प्राप्त करते हैं । कुल मिलाकर, इस अध्ययन के प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान के लिए आवश्यक कदम और प्रोटोकॉल का वर्णन ।
प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में असामान्य घाव भरने1 और कैंसर सहित रोग में महत्वपूर्ण redox नियामकों हैं । 2 महत्वपूर्ण बात यह है कि इन प्रजातियों में विकृति के साथ-साथ इसकी चिकित्सीय संकल्प भी शामिल हैं । 3 , 4 शीत शारीरिक प्लाज्मा एक है कि कई प्रकार के प्रतिक्रियाशील प्रजातियों निष्कासित गैस है । 5 के आगमन के बाद से तथाकथित शीत प्लाज्मा कि शरीर का तापमान6पर काम करते हैं, ठंड प्लाज्मा कोशिकाओं और ऊतकों को थर्मल नुकसान के बिना लागू किया जा सकता है । पूर्व नैदानिक और नैदानिक टिप्पणियों में प्लाज्मा उपकरणों की प्रभावकारिता और सुरक्षित आवेदन का प्रदर्शन करके, तीन जर्मनी में चिकित्सा उपकरणों के रूप में मांयता प्राप्त है । 7 विशेष रूप से genotoxic सुरक्षा के संबंध में, कई अध्ययनों से पहले डिवाइस, एक वायुमंडलीय दबाव आर्गन प्लाज्मा जेट का उपयोग कर mutagenic घटनाओं के अभाव को दिखाया गया है । 8 , 9 , 10 अंय दो उपकरणों तथाकथित ढांकता बैरियर फर्ज (DBD) है, जो प्लाज्मा जेट से एक अलग सिद्धांत के माध्यम से काम कर रहे हैं । विशेष रूप से, जेट विमानों सतहों और गुहाओं के उपचार की तरह स्केलपेल के लिए अनुमति देते हैं, जबकि DBD प्लाज्मा बड़ा लेकिन बल्कि फ्लैट ऊतक क्षेत्रों के इलाज में कुशल हैं । सेलुलर redox संकेतन11का दोहन, तकनीक का उद्देश्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए प्लाज्मा जनित प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का उपयोग करने के लिए है । 12 नैदानिक प्लाज्मा चिकित्सा के एक विशेष रूप से होनहार आवेदन घाव भरने का समर्थन है । 13 , 14 , 15 इसके अलावा, प्लाज्मा पशु मॉडल में विरोधी प्रभाव है दिखाया गया था । 16 , 17 , 18
पशु मॉडल, या यहां तक कि मनुष्यों में प्लाज्मा अनुप्रयोगों की प्रभावकारिता और सुरक्षा को मान्य करने से पहले, मानकीकृत इन विट्रो अनुसंधान प्लाज्मा उपकरणों के साथ बाहर किए जाने की जरूरत है । इन प्रयोगों प्लाज्मा अनुप्रयोगों का पता लगाने के लिए और काम पर तंत्र चित्रित करने के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, बुनियादी अनुसंधान के लिए प्रतिक्रियाशील प्रजातियों और बाद में जैविक प्रभाव की संरचना के प्रभाव को समझने की जरूरत है । इस अध्ययन को दर्शाता है कि प्लाज्मा जैव चिकित्सा अनुसंधान में एकीकृत किया जा सकता है बेहतर समझते है और कोशिकाओं पर इसके प्रभाव को नियंत्रित । यह फ़ीड गैस संरचना की ट्यूनिंग का वर्णन, प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन की निगरानी, तरल पदार्थ के लिए प्लाज्मा के आवेदन, कोशिकाओं, और ऊतकों, और परिणामी रासायनिक और जैविक परिणाम. इसके अलावा, उदाहरण प्रदान की है जो प्लाज्मा उपचार और बहाव जैविक परख के मानकीकरण पर निर्देश, एक प्लाज्मा चिकित्सा ९६ में किया अनुसंधान पर रखा जोर के साथ अच्छी तरह से प्लेटें हैं । इस प्रकिया में विशिष्ट लाभ हैं: i) प्रति शर्त, एजेंट लागत, और हाथ-समय प्रति नमूना पर आवश्यक कक्षों की संख्या ंयूनतम; 2) डुप्लिकेट या तपसिल उपचार के रूप में परिणामों की अधिक से अधिक सटीकता के भत्ते आसानी से स्थापित किया जा सकता है; और iii) ९६ में निर्बाध बहाव परख के सुविधा-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट रीडर, इमेजिंग, और प्रवाह cytometry प्रयोगों ।
बुनियादी अनुसंधान की प्रभावकारिता की समझ विकसित करने के लिए मौलिक और तंत्र underpinning प्लाज्मा चिकित्सा और नैदानिक अनुसंधान में । मौलिक अनुसंधान भी उपचार के लिए नए आवेदनों की जांच को बढ़ावा देता है । हालांकि यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्लाज्मा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों के19की पीढ़ी के माध्यम से अपने जैविक प्रभाव मध्यस्थता, वहां अभी भी तीन क्षेत्र के लिए मुख्य चुनौतियां हैं । सबसे पहले, कौन सी प्रजातियों महत्वपूर्ण हैं? यह आंशिक रूप से ऑप्टिकल निदान और जैविक readouts के साथ प्लाज्मा की फ़ीड गैस रचना संग्राहक द्वारा उत्तर दिया जा सकता है । 20 दूसरे, क्या प्रभाव कोशिकाओं के रूप में जैविक लक्ष्य में देखा जा सकता है? यह है, कम से कम भाग में, सेल संस्कृति प्रयोगों और परख के एक नंबर का उपयोग कर संबोधित किया । युकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रभाव सेल चक्र गिरफ्तारी21, apoptosis22, परिगलन23, और त्वचा सेल उत्तेजना24,25,26, साथ ही एक समर्थन या सेल के कमी सहित pleiotropic हैं गतिशीलता या चयापचय गतिविधि27,28,29. तीसरी चुनौती, इन pleiotropic प्रभाव से संबंधित है, के लिए महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान करने के लिए है कि प्लाज्मा-व्युत्पंन oxidants को सेलुलर प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए विभिंन प्रभाव अक्सर विभिंन प्रकार के सेल में देखा समझा । यह ओमिक्स तकनीक द्वारा किया जा सकता है30,31,३२ और/या ऊपर या लक्ष्य जीन का downregulation सिरना का उपयोग (redox) अवरोधकों, antioxidants और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों संकेत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मॉडुलन प्लाज्मा प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन । ३३ , ३४ , ३५ इसलिए, सुव्यवस्थित परख प्रोटोकॉल पुनरावृत्तियों की बड़ी संख्या के साथ बड़ा नमूना सेट का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं ।
यह अध्ययन एक कुशल प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह मिसाल, भौतिकी से जीव विज्ञान के लिए, aforementioned चुनौतियों के संबंध में प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान के लिए. प्लाज्मा स्रोत और प्लाज्मा उत्पादन के इंजीनियरिंग पहलुओं पर विवरण से पहले वर्णित किया गया है । ३६ , ३७ , ३८ इन सभी की परख 96well प्लेटों में की जाती है, जिसके कई फायदे हैं । उदाहरण के लिए, ऐसे सेल संस्कृति supernatants के रूप में नमूनों को आसानी से परख से संग्रह प्लेटों के लिए किया जा सकता है की जांच करने के लिए, जैसे एंजाइम के माध्यम से प्रोटीन सांद्रता-immunosorbent-परख से जुड़े । यदि ९६-कुओं से सीधे पढ़ने में सक्षम वैज्ञानिक उपकरण उपलब्ध है, तो इस तरह के एक दृष्टिकोण नमूना और handsontime प्रति लागत को कम करता है और एक ही नमूना से अलग परख मल्टीप्लेक्स द्वारा परिणाम अधिकतम । मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग इसके अतिरिक्त नमूना हैंडलिंग को गति । सिद्धांत रूप में, यहां वर्णित परख भी बड़े अच्छी तरह से व्यास के साथ अच्छी तरह से थाली स्वरूपों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि इस बहाव परख के लिए अंय ट्यूबों और जहाजों में अतिरिक्त pipetting कदम की आवश्यकता होगी । ऐसे 384well प्लेटों के रूप में छोटे प्लेट प्रकार, तथापि, ज्यामिति बड़े फ़ीड गैस फ्लक्स के साथ जेट विमानों का उपयोग कर जैव चिकित्सा प्लाज्मा अनुसंधान के लिए उपयुक्त उपस्थित नहीं है । विशेष रूप से, यह गारंटी है कि केवल एक ही नहीं बल्कि आसंन कुओं एक इलाज के दौरान प्रभावित कर रहे है नहीं किया जा सकता ।
तरल विश्लेषण के लिए प्लाज्मा द्वारा प्रजातियों जमाव की जांच आवश्यक है । विशेषज्ञ विश्लेषण में, विभिंन परख के एक समानांतर सेटअप एक ही समय में विभिंन oxidants के संबंध में plasmatreated तरल पदार्थ की विशेषता कर सकते हैं । यह मल्टीप्लेक्स plasmaderived प्रजातियों के विभेदित चित्र विकसित करने की अनुमति देता है । वर्णित दृष्टिकोण अत्यधिक हाइड्रोजन पेरोक्साइड सांद्रता३९, जो अक्सर आवश्यक है, लेकिन हमेशा प्लाज्मा प्रभाव समझाने के लिए पर्याप्त नहीं की जांच करने के लिए संवेदनशील है । ४० , ४१ , ४२ जैविक रूप से प्रासंगिक प्रभाव भी तरल पदार्थ में एक glutathione परख यहां शामिल नहीं के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । ४३ विशिष्ट नाइट्राइट परख दृढ़ता से पारंपरिक Griess पर सिफारिश की है 10fold उच्च परख संवेदनशीलता के कारण परख (नहीं दिखाया डेटा) । Plasmatreated तरल पदार्थ भी DTNB-परख का उपयोग hypochlorous एसिड के गठन के लिए जांच की जा सकती है । फिर भी, पिछले परिणाम हमारे प्लाज्मा स्रोत के साथ कि प्रजातियों के गठन का संकेत नहीं दिया । 19 , ३९ , ४४ प्लाज्मा उपचार के बाद समाप्त हो गया है, प्रजातियों गिरावट समय के साथ जगह लेता है । नाइट्राइट नाइट्रेट के प्रति प्रतिक्रिया करता है; इसके अलावा, पेरोक्साइड समय पर भस्म हो जाता है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं कई घंटे लग । ३५ Cytochrome सी अवशोषण कई घंटे के रूप में अच्छी तरह से अधिक स्थिर है । इसलिए, अगर प्रक्रियाओं उपचार के बाद पहले 30 मिनट के भीतर हो, लंबे समय से जीवित प्रजातियों की सांद्रता में भिंनता यहां वर्णित नगण्य हैं । हालांकि, ध्यान दिया जाना चाहिए जब मीडिया के कुछ प्रकार की जांच (जैसे, Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम) सामग्री के रूप में ९०% पेरोक्साइड के लिए 1 घंटे में सफाई कर सकते है (नहीं दिखाया गया डेटा) प्लाज्मा पेरोक्साइड के एक अनुमान के लिए अग्रणी में तरल.
एक मल्टीप्लेक्स परख प्रस्तुत की है जो सेल क्षेत्र (आकृति विज्ञान) पर चयापचय गतिविधि की जांच से सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति के लिए पर्वतमाला । इन परख का एक संयोजन दिलचस्प परिणाम प्रकट हो सकता है । उदाहरण के लिए, हम पहले THP1 monocytes में दिखाया गया है कि चयापचय गतिविधि और कोशिका गिनती प्लाज्मा के लिए जोखिम के बाद एक रैखिक फैशन में कमी नहीं है. ४५ बल्कि, प्लाज्मा उपचार के समय में वृद्धि के साथ, कोशिकाओं को मनाया गया है कि आकार में वृद्धि हुई थी और एक उच्च mitochondrial मास था, इस प्रकार एक percell आधार पर उच्च चयापचय दर के लिए अग्रणी । मूलतः, multiplate पाठक, माइक्रोस्कोपी, और प्रवाह cytometry मल्टीप्लेक्स के प्लाज्मा उपचार के बाद सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर जानकारी का संयोजन । मेलेनोमा कोशिकाओं में, हम यहां साइटोटोक्सिक प्रभाव और उनके immunogenicity calreticulin द्वारा मध्यस्थता पर ध्यान केंद्रित । सिद्धांत रूप में ४६ , कई अंय सवालों के इस दृष्टिकोण इमेजिंग और प्रवाह cytometry परिणामों के साथ चयापचय गतिविधि को जोड़ने के साथ संबोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोशिका विभेदन (उदा. macrophage ध्रुवीकरण), mitochondrial झिल्ली क्षमता, कोशिका चक्र विश्लेषण, सेल गतिशीलता, यांत्रिक या micronucleus गठन genotoxicity के विश्लेषण के लिए भी जाँच की जा सकती है प्लाज्मा इलाज कोशिकाओं । बहुरंगा प्रवाह cytometry एक ही समय में अलग सेल आबादी में भी अधिक अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है । यह शामिल है, उदाहरण के लिए, संकेतन प्रोटीन की फास्फारिलीकरण स्थिति का विश्लेषण जैसे प्रतिलेखन कारकों, mRNA ठहराव, intracellular साइटोकिंस की माप, और/या एक ही कक्ष स्तर पर कुल कम thiols का आकलन । अतिरिक्त जैविक रूप से प्रासंगिक जानकारी है कि आगे प्लाज्मा redox प्रभाव की तस्वीर को विकसित करने में बेहतर वर्तमान और भविष्य प्लाज्मा अनुप्रयोगों को समझने में प्रत्येक नमूना एड्स के लिए उपलब्ध है ।
The authors have nothing to disclose.
जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF अनुदान संख्या 03Z22DN11 और 03Z22DN12) से धन आभार स्वीकार किया है ।
accutase | BioLegend | 423201 | |
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
argon gas | Air Liquide | N50 | |
B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
catalase | Sigma | C30 | |
cell culture incubator | Binder | CB210 | |
cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
Glutamine | Sigma | G7513 | |
imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
mass flow controller | MKS | G-series | |
Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
plate reader | Tecan | M200pro | |
propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
resazurin | VWR | B21187.06 | |
RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |