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प्लाज्मा चिकित्सा में बुनियादी अनुसंधान-तरल पदार्थ से कोशिकाओं को एक प्रवाह दृष्टिकोण

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

तरल पदार्थ और कोशिकाओं के एक उच्च प्रवाह शीत शारीरिक प्लाज्मा उपचार प्रोटोकॉल दिखाया गया है । यह प्लाज्मा प्रज्वलन के लिए अलग फ़ीड गैस रचनाओं की स्थापना शामिल है, प्लाज्मा उत्सर्जन स्पेक्ट्रा को मापने, और प्लाज्मा उपचार के बाद तरल पदार्थ और सेलुलर गतिविधि के बाद के विश्लेषण.

Abstract

प्लाज्मा चिकित्सा में, तापमान के साथ हड्डीवाला प्रणालियों के करीब है कि कोशिकाओं और ऊतकों के लिए लागू कर रहे हैं । शीत प्लाज्मा redox स्वास्थ्य और रोग में जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता प्रतिक्रियाशील प्रजातियों उत्पन्न करते हैं । पूर्व नैदानिक और नैदानिक सबूत त्वचा के जीर्ण अल्सर की चिकित्सा में प्लाज्मा उपचार के लाभकारी प्रभाव के लिए अंक । ऐसे प्लाज्मा कैंसर के इलाज के रूप में अंय उभरते विषयों, बढ़ती ध्यान प्राप्त कर रहे हैं । प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान भौतिकी, रसायन विज्ञान, और जैव चिकित्सा में अनुशासनात्मक विशेषज्ञता की आवश्यकता है । प्लाज्मा अनुसंधान के एक लक्ष्य के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों की एक किस्म में प्लाज्मा इलाज कोशिकाओं की विशेषता है । यह शामिल है, उदाहरण के लिए, सेल गणना और व्यवहार्यता, सेलुलर ऑक्सीकरण, mitochondrial गतिविधि, cytotoxicity और कोशिका मृत्यु के मोड, कोशिका चक्र विश्लेषण, सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति, और cytokine रिलीज. इस अध्ययन के प्लाज्मा में इस तरह के अनुसंधान के लिए आवश्यक उपकरणों और कार्यप्रवाह की आवश्यकता का वर्णन है । यह एक वायुमंडलीय दबाव आर्गन प्लाज्मा जेट के समुचित संचालन का वर्णन, विशेष रूप से अपने बुनियादी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की निगरानी और प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन को मिलाना करने के लिए फ़ीड गैस सेटिंग्स. एक उच्च परिशुद्धता xyz-टेबल और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, जेट मिलीसेकंड में मंडराता है-९६ के गुहाओं पर परिशुद्धता-अच्छी तरह से माइक्रोमीटर में प्लेटें-परिशुद्धता के लिए अधिक से अधिक reproducibility । redox के तरल विश्लेषण के लिए बहाव परख-सक्रिय अणुओं दिखाया जाता है, और लक्ष्य कोशिकाओं प्लाज्मा इलाज कर रहे हैं । विशेष रूप से, मेलेनोमा कोशिकाओं अलग लगातार परख के एक कुशल अनुक्रम में विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन एक ही कोशिकाओं का उपयोग: चयापचय गतिविधि की माप, कुल सेल क्षेत्र, और calreticulin की सतह मार्कर अभिव्यक्ति, एक के लिए महत्वपूर्ण अणु immunogenic कोशिका कैंसर कोशिकाओं की मौत । इन परख एक ही प्लेट से प्लाज्मा प्रभाव के बारे में सामग्री समृद्ध जैविक जानकारी प्राप्त करते हैं । कुल मिलाकर, इस अध्ययन के प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान के लिए आवश्यक कदम और प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Introduction

प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में असामान्य घाव भरने1 और कैंसर सहित रोग में महत्वपूर्ण redox नियामकों हैं । 2 महत्वपूर्ण बात यह है कि इन प्रजातियों में विकृति के साथ-साथ इसकी चिकित्सीय संकल्प भी शामिल हैं । 3 , 4 शीत शारीरिक प्लाज्मा एक है कि कई प्रकार के प्रतिक्रियाशील प्रजातियों निष्कासित गैस है । 5 के आगमन के बाद से तथाकथित शीत प्लाज्मा कि शरीर का तापमान6पर काम करते हैं, ठंड प्लाज्मा कोशिकाओं और ऊतकों को थर्मल नुकसान के बिना लागू किया जा सकता है । पूर्व नैदानिक और नैदानिक टिप्पणियों में प्लाज्मा उपकरणों की प्रभावकारिता और सुरक्षित आवेदन का प्रदर्शन करके, तीन जर्मनी में चिकित्सा उपकरणों के रूप में मांयता प्राप्त है । 7 विशेष रूप से genotoxic सुरक्षा के संबंध में, कई अध्ययनों से पहले डिवाइस, एक वायुमंडलीय दबाव आर्गन प्लाज्मा जेट का उपयोग कर mutagenic घटनाओं के अभाव को दिखाया गया है । 8 , 9 , 10 अंय दो उपकरणों तथाकथित ढांकता बैरियर फर्ज (DBD) है, जो प्लाज्मा जेट से एक अलग सिद्धांत के माध्यम से काम कर रहे हैं । विशेष रूप से, जेट विमानों सतहों और गुहाओं के उपचार की तरह स्केलपेल के लिए अनुमति देते हैं, जबकि DBD प्लाज्मा बड़ा लेकिन बल्कि फ्लैट ऊतक क्षेत्रों के इलाज में कुशल हैं । सेलुलर redox संकेतन11का दोहन, तकनीक का उद्देश्य जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए प्लाज्मा जनित प्रतिक्रियाशील प्रजातियों का उपयोग करने के लिए है । 12 नैदानिक प्लाज्मा चिकित्सा के एक विशेष रूप से होनहार आवेदन घाव भरने का समर्थन है । 13 , 14 , 15 इसके अलावा, प्लाज्मा पशु मॉडल में विरोधी प्रभाव है दिखाया गया था । 16 , 17 , 18

पशु मॉडल, या यहां तक कि मनुष्यों में प्लाज्मा अनुप्रयोगों की प्रभावकारिता और सुरक्षा को मान्य करने से पहले, मानकीकृत इन विट्रो अनुसंधान प्लाज्मा उपकरणों के साथ बाहर किए जाने की जरूरत है । इन प्रयोगों प्लाज्मा अनुप्रयोगों का पता लगाने के लिए और काम पर तंत्र चित्रित करने के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, बुनियादी अनुसंधान के लिए प्रतिक्रियाशील प्रजातियों और बाद में जैविक प्रभाव की संरचना के प्रभाव को समझने की जरूरत है । इस अध्ययन को दर्शाता है कि प्लाज्मा जैव चिकित्सा अनुसंधान में एकीकृत किया जा सकता है बेहतर समझते है और कोशिकाओं पर इसके प्रभाव को नियंत्रित । यह फ़ीड गैस संरचना की ट्यूनिंग का वर्णन, प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन की निगरानी, तरल पदार्थ के लिए प्लाज्मा के आवेदन, कोशिकाओं, और ऊतकों, और परिणामी रासायनिक और जैविक परिणाम. इसके अलावा, उदाहरण प्रदान की है जो प्लाज्मा उपचार और बहाव जैविक परख के मानकीकरण पर निर्देश, एक प्लाज्मा चिकित्सा ९६ में किया अनुसंधान पर रखा जोर के साथ अच्छी तरह से प्लेटें हैं । इस प्रकिया में विशिष्ट लाभ हैं: i) प्रति शर्त, एजेंट लागत, और हाथ-समय प्रति नमूना पर आवश्यक कक्षों की संख्या ंयूनतम; 2) डुप्लिकेट या तपसिल उपचार के रूप में परिणामों की अधिक से अधिक सटीकता के भत्ते आसानी से स्थापित किया जा सकता है; और iii) ९६ में निर्बाध बहाव परख के सुविधा-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट रीडर, इमेजिंग, और प्रवाह cytometry प्रयोगों ।

Protocol

1. प्लाज्मा प्रजातियों की निगरानी और उपचार सेटअप

  1. प्लाज्मा प्रजातियों की निगरानी
    1. एक वायुमंडलीय दबाव प्लाज्मा जेट और प्रति मिनट दो मानक लीटर की एक अधिकतम का उपयोग करें फ़ीड गैस फ्लक्स ।
    2. बेर धुरी के लिए सीधा, एक ऑप्टिकल उत्सर्जन spectrophotometer के सामने जेट की स्थिति है, और रिकॉर्ड photoemission और तरंग दैर्ध्य (२००-१,००० एनएम) समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ।
    3. मिश्रण ०.५ नाइट्रोजन या ऑक्सीजन का% या तो शुष्क या humidified (5%) गैस फ़ीड ।
    4. प्रत्येक गैस की स्थिति के लिए ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी दोहराएं ।
    5. डेटा की चित्रमय प्रदर्शन के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण ।
  2. प्लाज्मा उपचार सेटअप
    1. एक कंप्यूटर चालित xyz-table करने के लिए जेट ठीक करें ।
    2. कुओं की स्थिति की पहचान और एक कंप्यूटर स्क्रिप्ट के लिए तालिका में शामिल हो गए जेट, उपयुक्त उपचार के समय के साथ, एक अच्छी तरह से केंद्र के ऊपर उत्पंन करते हैं ।
    3. पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम के १०० µ एल में किसी भी प्रकार के स्तनधारी अनुयाई कोशिकाओं के 104 जोड़ें) एक FCS फ्लो हूड के तहत कई कुओं में (10% glutamine, 2% streptomycin के साथ RPMI1640, और 1% पेनिसिलिन/लामिना).
    4. 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ एक humidified वातावरण में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात होने के लिए सेलुलर आसंजन की अनुमति दें ।
    5. २५० µm अंतराल पर विभिन्न ऊंचाइयों (जेड-अक्ष) पर 20 एस के लिए प्लाज्मा के साथ कोशिकाओं का इलाज.
    6. सेल कल्चरल मीडियम में propidium आयोडाइड के 25 µ l को हर कुआं पर जोड़ें ।
    7. छवि माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं के लिए विशिष्ट ऊंचाई है कि कोशिका के एक तरफ के शीर्ष पर संस्कृति माध्यम धक्का गैस की वजह से परिगलन पैदा नहीं करता है निर्धारित करने के लिए ।
      नोट: अब उपचार के समय के लिए, इस विशेष ऊंचाई पर तरल वाष्पीकरण की पहचान, पर और मोड बंद प्लाज्मा में, से पहले और प्लाज्मा उपचार के बाद थाली वजन से पुनर्स्थापित करने के लिए आवश्यक doubledistilled पानी की microliters की मात्रा की पहचान करने के लिए इलाज कुएं में परासरणी homeostasis ।
    8. xyz के लिए एक अंतिम प्रोटोकॉल तैयार-संबंधित उपचार के समय के साथ तालिका (यहां: 20 एस, ४० एस, ६० एस प्लाज्मा और ६० एस गैस नियंत्रण) और अच्छी तरह से स्थिति है, और ९६ के तरल हैंडलिंग के लिए तैयार मल्टीचैनल पिपेट और जलाशयों-अच्छी तरह से बाद में प्लेटें ।

2. प्लाज्मा में प्रमुख प्रतिक्रियाशील घटकों का विश्लेषण-उपचार तरल पदार्थ

  1. प्लाज्मा उपचार हाइड्रोजन पेरोक्साइड का विश्लेषण
    1. तपसिल में फ्लैट-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में प्लाज्मा के साथ फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के १०० µ एल समझो ।
    2. सहिजन peroxidase के 10 यू और हाइड्रोजन पेरोक्साइड डिटेक्शन एजेंट के 5 µ मीटर के साथ पंजाब के १०० µ एल लदान से एक मास्टर मिश्रण तैयार (एक अच्छी तरह के लिए पर्याप्त; तदनुसार स्केल) ।
    3. एक अच्छी तरह से करने के लिए मास्टर मिश्रण के ९५ µ एल जोड़ें ।
      नोट: पिछले कदम एक स्वच्छ पीठ के तहत या परिवेशी वायु ओजोन के रूप में प्लाज्मा स्रोत से अलग कमरे में किया जाना चाहिए परख की संवेदनशीलता को कम कर सकते हैं ।
    4. एक अलग थाली में, १०० µ मीटर की एक शीर्ष एकाग्रता के साथ पंजाब में हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एक दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार १०० µ l पंजाब में ।
    5. नमूने का पता लगाने के एजेंट युक्त कुओं के लिए या हाइड्रोजन पेरोक्साइड मानकों के 5 µ एल जोड़ें ।
    6. केवल पढ़ने के बाद पृष्ठभूमि घटाव के लिए पता लगाने के एजेंट युक्त कुओं को शामिल करें ।
    7. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में थाली मशीन ।
    8. λपूर्व ५३५ एनएम और λem ५९० एनएम पर प्रतिदीप्ति को मापने microplate रीडर में थाली प्लेस ।
      नोट: उच्च पेरोक्साइड सांद्रता नमूनों में उम्मीद कर रहे हैं, नमूना कमजोर पड़ने की जरूरत है वृद्धि हुई है या रीडिंग की जरूरत कम गर्मी समय के साथ किया जा करने के लिए परख के संतृप्ति से बचने के लिए ।
    9. सभी नमूनों से खाली मूल्यों घटाना, पेरोक्साइड मानक वक्र की गणना, और उस आधारभूत वक्र से अज्ञात नमूना पेरोक्साइड सांद्रता यों तो ।
  2. प्लाज्मा का विश्लेषण-इलाज नाइट्राइट
    1. flatbottom 96well प्लेट्स में तपसिल में प्लाज्मा के साथ पंजाब के १०० µ का इलाज करें ।
    2. doubledistilled जल के ९९ µ l को ठहराव रिएजेंट के 1 µ l को जोड़कर नाइट्राइट डिटेक्शन सॉल्यूशन का मास्टर मिश्रण तैयार करें (एक अच्छी तरह के लिए पर्याप्त; स्केल तदनुसार) ।
    3. एक स्पष्ट, flatbottom 96well प्लेट के प्रति अच्छी तरह से १०० µ एल जोड़ें । कुओं की संख्या के लिए आवश्यकतानुसार स्केल अप ।
    4. doubledistilled पानी में नाइट्राइट मानकों के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करते हैं ।
    5. 96well प्लेट्स में मास्टर मिक्स करने के लिए मानकों या नमूनों की 10 µ एल जोड़ें ।
    6. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में थाली मशीन ।
    7. एक अच्छी तरह से नाइट्राइट ठहराव डेवलपर समाधान के 5 µ एल जोड़ें ।
    8. λपूर्व ३६५ एनएम और λem ४५० एनएम में एक microplate रीडर में प्रतिदीप्ति पढ़ें ।
    9. सभी नमूनों से खाली मूल्यों घटाना, नाइट्राइट मानक वक्र की गणना, और उस आधारभूत वक्र से अज्ञात नमूना नाइट्राइट सांद्रता बढ़ाता है ।
  3. प्लाज्मा का विश्लेषण-इलाज सुपरऑक्साइड
    1. पंजाब में ऑक्सीकरण cytochrome (1 मिलीग्राम/एमएल) और catalase (20 µ ग्राम/एमएल) का मास्टर मिश्रण बनाओ ।
    2. एक स्पष्ट, फ्लैट के नीचे ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं को मास्टर मिश्रण के १०० µ एल जोड़ें ।
    3. उपचार हालत के प्रति तपसिल में प्लाज्मा के साथ मास्टर मिश्रण समझो ।
    4. एक microplate रीडर का उपयोग ५५० एनएम पर अवशोषित पढ़ें; ग्राफ इस डेटा ।
    5. cytochrome सी के दाढ़ विलुप्त होने गुणांक और एक अच्छी तरह के भीतर तरल के प्रकाश पथ की लंबाई का उपयोग कर उत्पन्न सुपरऑक्साइड की मात्रा की गणना.

3. कोशिकाओं की जैविक प्रतिक्रिया प्लाज्मा को उजागर

  1. प्लाज्मा के बहुआयामी पढ़ें-इलाज कोशिकाओं: चयापचय गतिविधि
    1. निंनलिखित प्रक्रियाओं के सभी के लिए एक लामिना प्रवाह हूड का प्रयोग करें ।
    2. बीज 104 कोशिकाओं (B16 murine मेलेनोमा) में १०० µ l पूरी तरह से पूरक सेल संस्कृति माध्यम प्रति अच्छी तरह से फ्लैट-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में.
    3. 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मशीन के humidified वातावरण में ३७ ° c पर रातोंरात सेलुलर आसंजन की अनुमति दें ।
    4. xyz-table का उपयोग करना, एक पूर्वनिर्धारित योजना के अनुसार प्लाज्मा या अकेले गैस के साथ कुओं का इलाज, और 20 एच के लिए मशीन में कोशिकाओं को वापस जोड़ने ।
      नोट: यदि वांछित, extracellular उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए 20 घंटे के बाद supernatants बंद ले; बाद में ताजा माध्यम के १०० µ एल जोड़ें ।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से, ५०० µ एम resazurin (अंतिम एकाग्रता १०० µ एम) युक्त सेल संस्कृति माध्यम के 25 µ एल जोड़ें; पृष्ठभूमि घटाव के लिए कोशिकाओं के बिना सेल संस्कृति माध्यम में अकेले resazurin युक्त तीन कुओं तैयार करते हैं ।
    6. मशीन में 3 एच के लिए मशीन ।
    7. λपूर्व ५३५ एनएम और एक microplate रीडर में λem ५९० एनएम पर प्रतिदीप्ति पढ़ें ।
    8. सभी नमूनों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना, और मानों को नियंत्रित करने के लिए डेटा को सामान्य करना.
  2. प्लाज्मा से बाहर बहुआयामी पढ़ें-इलाज कोशिकाओं: छवि विश्लेषण
    1. 3.1.7 से अच्छी प्लेट का प्रयोग करें और supernatant त्यागें ।
    2. 1 µ g/मिलि propidium आयोडाइड युक्त ताजा कोशिका संस्कृति माध्यम के १०० µ एल जोड़ें ।
    3. एक खुर्दबीन के नीचे प्लेट एक मोटर की छवि के लिए मंच के साथ एक अच्छी तरह से रखो ।
      नोट: इमेजिंग विवरण प्रयोगात्मक प्रश्न पर निर्भर करता है; यहां, एक 20X उद्देश्य एक उच्च सामग्री इमेजिंग डिवाइस में एक चमकदार क्षेत्र चैनल में देखने के 3x3 क्षेत्रों को पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया गया था, डिजिटल चरण कंट्रास्ट चैनल, और प्रतिदीप्ति (propidium आयोडाइड) चैनल, उचित उत्तेजना प्रकाश और उत्सर्जन का उपयोग फिल्टर.
    4. मात्रात्मक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए डिजिटल चरण में कुल cytosolic क्षेत्र का पता लगाने के सभी क्षेत्रों के विपरीत छवियों को देखने के प्रत्येक अच्छी तरह से imaged ।
      नोट: आगे पैरामीटर का विश्लेषण अगर वांछित, उदाहरण के लिए, व्यवहार्य और/या मृत कोशिकाओं या mitochondrial समर्पित दाग का उपयोग कर गतिविधि की संख्या । यदि इस काम में वर्णित से अंय दाग का उपयोग कर, सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल प्रतिदीप्ति दाग वर्णक्रम के बाद प्रवाह cytometry प्रयोगों में इस्तेमाल fluorochromes के साथ ओवरलैप नहीं है ।
    5. ग्राफ डेटा, और यदि वांछित, चयापचय गतिविधि के लिए प्राप्त मूल्यों के साथ सहसंबंध के लिए परीक्षण ।
  3. प्लाज्मा से बाहर बहुआयामी पढ़ें-इलाज कोशिकाओं: प्रवाह Cytometry
    1. इस विश्लेषण के लिए, चरण 3.2.5 से अच्छी तरह से थाली का उपयोग करें ।
    2. supernatant त्यागें और कैल्शियम और मैग्नीशियम (०.९ मिमी और ०.५ मिमी, क्रमशः) युक्त पंजाबियों के २०० µ एल के साथ दो बार धोने ।
      नोट: आगे जैविक readouts के लिए इस स्तर पर फिक्स और/या permeabilize इस अंशदान में शामिल नहीं है, जैसे intracellular प्रतिजन के दाग या कोशिका चक्र विश्लेषण ।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से, कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त ५० एनजी/एमएल विरोधी माउस calreticulin मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पंजाबियों के ५० µ एल जोड़ें ।
    4. मशीन में 15 मिनट के लिए मशीन ।
    5. पूरी तरह से पूरक सेल संस्कृति माध्यम के २०० µ एल के साथ दो बार धो लें और प्लेट में तरल त्यागें ।
    6. एक अच्छी तरह से करने के लिए सेल टुकड़ी समाधान के १०० µ एल जोड़ें, और मशीन में 20 मिनट के लिए मशीन ।
    7. निलंबन में unसना हुआ B16 कोशिकाओं का एक और सेट का उपयोग करने के लिए सेटअप प्रवाह cytometric अधिग्रहण प्रोटोकॉल, गेटिंग रणनीति, और लाभ और photodetectors की वोल्टेज ।
    8. ९६-well प्लेट्स के लिए एक ऑटो पारखी के साथ सुसज्जित एक प्रवाह cytometer में थाली लोड.
    9. आम तौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ जुड़े आगे और पक्ष तितर बितर जनसंख्या में १,००० कोशिकाओं की एक ंयूनतम प्राप्त करें ।
    10. प्रवाह cytometry के विश्लेषण के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें,. fcs फ़ाइलों के लिए ब्याज की आबादी गेट, और calreticulin का मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता निर्धारित करते हैं ।
    11. ग्राफ़ डेटा, और यदि वांछित, चयापचय गतिविधि, इमेजिंग, और/या ऑक्सीडेंट जमाव के लिए प्राप्त मूल्यों के साथ सहसंबंध के लिए परीक्षण ।

Representative Results

इस अध्ययन में, एक सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह प्लाज्मा के प्रभाव में चिकित्सा अनुसंधान के लिए बताया गया था । multidisciplinary यहां उपयोग दृष्टिकोण प्लाज्मा जेट के बुनियादी ऑप्टिकल उत्सर्जन प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करती है, तरल में मुख्य प्रतिक्रियाशील घटकों, और कोशिकाओं के जैविक प्रतिक्रियाओं प्लाज्मा (चित्रा 1) के साथ इलाज किया ।

इस कार्यप्रवाह का संचालन करने के लिए, घटकों की एक संख्या ठीक से प्लाज्मा स्रोत (चित्रा 2) सेट करने के लिए आवश्यक थे. विभिंन गैसों (यहां मुख्य रूप से आर्गन, ऑक्सीजन, और नाइट्रोजन) के लिए आपूर्ति और कई जन प्रवाह नियंत्रकों द्वारा नियंत्रित किया गया । एक केंद्रीय पैनल को डिजिटल रूप से पूर्व निर्धारित फ़ीड गैस फ्लक्स को जन प्रवाह नियंत्रकों को समायोजित किया गया । करने के लिए विशिष्ट फ़ीड गैस रचनाओं उपज, गैसों शारीरिक रूप से मिश्रित थे वाल्व के एक पैनल का उपयोग कि कई जन प्रवाह नियंत्रकों से संयुक्त गैसों (चित्रा 2) । प्लाज्मा स्रोत पर बंद किया गया था, और प्लाज्मा प्रवाह एक यूएसबी के सामने स्थापित किया गया था-spectrophotometer (चित्रा 2) २०० एनएम के एक ऑप्टिकल रेंज के साथ १,००० एनएम के लिए. तरल पदार्थ और कोशिकाओं के उपचार के लिए, एक कुशल कार्यप्रवाह ९६-well प्लेट्स का उपयोग कर वर्णन किया गया था । बहु-अच्छी तरह से व्यंजन जगह में आयोजित की गई एक प्लास्टिक फ्रेम है कि इसके अंकित छेद (चित्रा 2) के लिए मिलान सम्मिलन के साथ आधार प्लेट पर तय किया गया था का उपयोग कर । पूरे सेटअप एक लामिना फ्लो हूड (चित्रा 2डी) के तहत रखा गया था । इस सेटअप एक xyz-तालिका जिसमें हाथ से प्लाज्मा जेट के टुकड़े आयोजित घुड़सवार था शामिल थे । मोटर नियंत्रण तत्वों बेंच के बाहर स्थित हो सकता है, अगर बाद से और xyz-table करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़े केबल बंदरगाहों है । महत्वपूर्ण बात, तालिका कंप्यूटर नियंत्रित किया गया था और समय की वांछित राशि के लिए माइक्रोमीटर परिशुद्धता के साथ एक अच्छी तरह से केंद्र पर जेट मंडराना क्रमादेशित किया जा सकता है । इसके अलावा, शुरू की स्थिति (के रूप में हमारे सेटअप में, अच्छी तरह से A1) आज़ादी से चुना (चित्रा 2) था । प्लास्टिक प्लेट धारक के साथ मिलकर, यह किसी भी दिन के साथ एक प्रतिलिपि प्लाज्मा उपचार के लिए अनुमति दी दिन के लिए केवल तरल और जैविक प्रयोगों के सेटअप से संबंधित विविधताओं ।

ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी (OES) अलग फ़ीड गैस की स्थिति में प्रतिक्रियाशील प्लाज्मा घटकों (चित्रा 3) से जुड़े अलग चोटियों का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । उदाहरण के लिए, ३३० एनएम से ३८० समुद्री मील की चोटियों के साथ नाइट्रोजन की दूसरी सकारात्मक प्रणाली प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों का प्रतिनिधित्व किया, और ३०९ एनएम पर चोटी हाइड्रॉक्सिल कण का प्रतिनिधित्व किया ( चित्रा 3में तीर) । अकेले आर्गन गैस की तुलना में, नाइट्रोजन प्रजातियों की उपस्थिति फ़ीड गैस में नाइट्रोजन के मिश्रण के साथ वृद्धि हुई है, जबकि ऑक्सीजन या आर्द्रता के अलावा कम या इसे कम, क्रमशः. इसके विपरीत, हाइड्रॉक्सिल कण की उपस्थिति ऑक्सीजन या नाइट्रोजन के साथ कम हुई थी, लेकिन स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई अगर humidified आर्गन फ़ीड गैस के रूप में इस्तेमाल किया गया था । तरल पदार्थ के प्लाज्मा उपचार के लिए, आर्गन गैस और आर्गन प्लाज्मा की वजह से वाष्पीकरण पहले निर्धारित किया गया था (चित्रा 3बी). महत्वपूर्ण बात, दोनों शर्तों समान परिणाम उपज नहीं है क्योंकि प्लाज्मा भी तापमान पर प्रभाव डालती है । हाइड्रॉक्सिल कण, हाइड्रोजन पेरोक्साइड जमाव के OES परिणामों के साथ लाइन में काफी ऑक्सीजन या नाइट्रोजन मिश्रण के साथ कमी आई, लेकिन humidified फ़ीड गैस (चित्रा 3सी) के साथ वृद्धि हुई है । इसके अलावा, चारा गैस के लिए नाइट्रोजन के अलावा आर्गन प्लाज्मा इलाज तरल पदार्थ (चित्रा 3डी) की तुलना में काफी उच्च नाइट्राइट सांद्रता के लिए नेतृत्व किया । इस कार्यप्रवाह भी विभिंन रचनाओं के साथ तरल पदार्थ पर प्लाज्मा के प्रभाव की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हाइड्रोजन पेरोक्साइड सांद्रता के लिए पंजाब और RPMI1640 सेल संस्कृति मध्यम में भ्रूण बछड़ा सीरम की उपस्थिति से स्वतंत्र लग रहा था (चित्रा 3) । एक ही नमूने में, सीरम की उपस्थिति अपने गैर-सीरम युक्त समकक्षों की तुलना में पंजाब और सेल संस्कृति माध्यम में नाइट्राइट सांद्रता में कमी आई (चित्रा 3एफ). ज्यादातर सुपरऑक्साइड सूखी आर्गन गैस की स्थिति में ऑक्सीजन और/या नाइट्रोजन admixtures काफी शमन सुपरऑक्साइड पीढ़ी के साथ उत्पादन किया गया था, humidified आर्गन ऑक्सीजन प्लाज्मा (चित्रा 3जी) को छोड़कर ।

बहु में कोशिकाओं के प्लाज्मा उपचार के लिए अच्छी तरह से बर्तन, प्लेट युक्त कोशिकाओं से पहले दिन बोने की मशीन से हटा दिया गया था और प्लास्टिक धारक को जोड़ा । एक क्रमादेशित उपचार पैटर्न लागू किया गया था, वाष्पीकरण के लिए मुआवजा दिया गया था, और थाली वापस मशीन में 20 घंटे के लिए रखा गया था ध्यान दें कि इस मशीन के बाद, सेल संस्कृति supernatants एक नया, खाली ९६-अच्छी तरह से थाली में एकत्र किया गया है सकता है और पर संग्रहीत- ब्याज के प्रोटीन के आकलन के लिए ८० डिग्री सेल्सियस । अगले, resazurin एक अच्छी तरह से कोशिकाओं को जोड़ा गया था । गैर के कारोबार फ्लोरोसेंट resorufin को फ्लोरोसेंट resazurin केवल सक्रिय NADPH-उत्पादन एंजाइमों द्वारा सुविधा थी और समग्र चयापचय गतिविधि (चित्रा 4) के साथ संबंधित था । प्रतिदीप्ति तीव्रता प्लेट के दृश्य धारणा के समान थे, और संकेत दिया लंबे समय तक प्लाज्मा उपचार के साइटोटोक्सिक प्रभाव (चित्रा 4बी) । Humidified गैस की स्थिति सूखी गैस की स्थिति से ज्यादा नुकसानदेह थी । प्लेट में एक ही कोशिकाओं को आगे बहाव की परख के लिए उपयोग किया गया । प्लेट में कोशिकाएं microscopically जांच की गई (चित्रा 4सी) । इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, प्लेट के कई कुओं गुणात्मक तुलना (चित्रा 4डी) के लिए जांच की गई । सॉफ़्टवेयर ने प्रत्येक अच्छी तरह से प्राप्त किए गए और परिणामी डेटा को संबंधित नियंत्रणों (आरेख 4) के लिए सामान्यीकृत किया गया था के फ़ील्ड के भीतर कक्षों द्वारा कवर की गई कुल क्षेत्र के ठहराव की अनुमति दी है । कुल सेल क्षेत्र की कमी प्लाज्मा उपचार के नमूनों में देखा गया था, विशेष रूप से humidified फ़ीड गैस की स्थिति के साथ । बाद इमेजिंग, कोशिकाओं धोया, विरोधी माउस calreticulin एंटीबॉडी के साथ दाग, अलग थे, और प्रवाह cytometry (चित्रा 4एफ) के साथ विश्लेषण किया । मतलब प्रतिदीप्ति calreticulin की तीव्रता व्यवहार्य कोशिकाओं में धुंधला (चित्रा 4जी) की गणना की गई और नमूनों के बीच की तुलना में (चित्रा 4एच) । प्लाज्मा उपचार सूखी फ़ीड गैस की स्थिति के साथ लागू प्लाज्मा उपचार समय के लिए संगत है, जो murine मेलेनोमा सेल सतह पर calreticulin के एक विनियमन प्रेरित किया । humidified फ़ीड गैस की स्थिति के लिए, 20 एस और उपचार के ४० एस अधिक घातक ६० एस उपचार समय की तुलना में एक मजबूत calreticulin जोखिम प्रेरित । यह पता चलता है वहां एक गैर रैखिक calreticulin जोखिम के विनियमन कोशिकाओं को पेश oxidants की राशि के संबंध में था ।

Figure 1
चित्र 1 : भौतिकी से जीव विज्ञान के प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान के कार्यप्रवाह. वायुमंडलीय दबाव आर्गन प्लाज्मा जेट की प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन फ़ीड गैस संग्राहक द्वारा देखते है । प्लाज्मा गैस चरण में चयनित अणुओं स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर निगरानी कर रहे हैं । प्लाज्मा तरल पदार्थ का इलाज और ऑक्सीडेंट जमाव की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है । microplates में प्रसंस्कृत कोशिकाओं प्लाज्मा इलाज कर रहे हैं, और जैविक readouts प्रदर्शन कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : प्लाज्मा अनुसंधान पीठ के सेटअप । () स्टेनलेस स्टील पाइप में विभिंन गैसों कई जन प्रवाह नियंत्रकों कि एक केंद्रीय पैनल के माध्यम से नियंत्रित कर रहे है में संचालित कर रहे हैं । व्यक्तिगत फ़ीड गैस संरचना इसके बाद वाल्व के एक पैनल का उपयोग मिश्रित है । () प्लाज्मा के कुछ प्रतिक्रियाशील घटकों को विभिन्न फीड गैस रचनाओं के बीच मतभेदों की जांच करने के लिए ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए मॉनिटर किया जा सकता है । () उच्च प्रवाह प्लाज्मा अनुसंधान के लिए, ९६-अच्छी तरह से microplates का उपयोग किया जाता है । प्रोग्राम और स्वचालित प्लाज्मा उपचार के लिए एक निरंतर प्रारंभिक बिंदु सुनिश्चित करने के लिए, थाली एक फ्रेम करने के लिए दिन से दिन से प्लेटों की एक ही निरपेक्ष स्थिति की गारंटी में जोड़ा जाता है । (D) प्लाज्मा जेट एक लामिना फ्लो हूड के अंतर्गत स्थित एक कंप्यूटर-xyz-table नियंत्रित करने के लिए तय किया गया है । सभी ९६ सटीक स्थानों और आवास-प्रत्येक अच्छी तरह से अधिक प्लाज्मा के समय के लिए एक कार्यक्रम फ़ाइल में लिखा है प्लाज्मा स्रोत के आंदोलन का मार्गदर्शन । प्लाज्मा जेट तंत्र के मुख्य आवास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मोटर नियंत्रण बंद निकटता में स्थित हैं । () एक ९६-अच्छी तरह से थाली के स्वचालित प्लाज्मा उपचार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : प्लाज्मा जेट और तरल विश्लेषण । () विभिन्न फीड गैस की स्थितियों का ऑप्टिकल उत्सर्जन स्पेक्ट्रोस्कोपी दिखाया जाता है. नाइट्रोजन की दूसरी सकारात्मक प्रणाली (३३० एनएम से ३८० एनएम) नाइट्रोजन की मिश्रण, ऑक्सीजन मिश्रण के मामले में अनुपस्थित के साथ वृद्धि हुई थी, और humidified आर्गन (lefthand पैनलों) के साथ स्पष्ट रूप से कम है । ३०९ एनएम (एरो) पर हाइड्रॉक्सिल रेडिकल्स की पीक नाइट्रोजन और ऑक्सीजन की स्थिति में कम हुई लेकिन स्पष्ट रूप से आर्गनिक गैस की तुलना में अकेले humidified आर्गन में वृद्धि हुई । () तरल पदार्थ के गैस जोखिम वाष्पीकरण की ओर जाता है । प्लाज्मा और आर्गन गैस अकेले के साथ इलाज पर एक 96well थाली में वाष्पीकरण की मात्रा से पहले और एक ठीक पैमाने का उपयोग कर उपचार के बाद थाली वजनी द्वारा निर्धारित किया गया था । plasmatreated नमूनों में वाष्पीकरण आर्गन gastreated नमूनों में उस की तुलना में अधिक था. () plasmatreated तरल पदार्थ में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के उत्पादन में हाइड्रॉक्सिल कण के ३०९ एनएम चोटी के साथ कुछ हद तक संबंधित (ए) । Humidified (5%) आर्गन प्लाज्मा 4fold के बारे में पेरोक्साइड सांद्रता में वृद्धि हुई । (D) नाइट्राइट को तब ऊंचा किया गया था जब फीड गैस में नाइट्रोजन जोड़ा गया था, और यह प्रभाव humidified आर्गन प्लाज्मा के साथ बढ़ गया था । ऑक्सीजन के अलावा नाइट्राइट पीढ़ी में कमी आई लेकिन काफी नहीं. (, ) हाइड्रोजन पेरोक्साइड और नाइट्राइट सांद्रता तरल पदार्थ के विभिंन प्रकारों में दिखाया गया है, अर्थात् RPMI1640 सेल संस्कृति माध्यम के साथ (R10F) और बिना (R0F) के साथ ही साथ पंजाब और भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के बिना । पेरोक्साइड का स्तर अलग मीडिया () के बीच अलग नहीं था, जबकि नाइट्राइट स्तर काफी सीरम की उपस्थिति में कमी आई थी । () सूखी आर्गन गैस फीड गैस के लिए सुपरऑक्साइड उत्पादन सबसे अधिक था; नाइट्रोजन, ऑक्सीजन, या humidified आर्गन के मिश्रण तरल में कम सुपरऑक्साइड जमाव दिया । दर्शाए गए डेटा (B-G), दो से तीन प्रयोगों के माध्य + SEM हैं । सांख्यिकीय विश्लेषण का प्रदर्शन किया गया (C, D) संबंधित नियंत्रण (* * p < 0.01; * * * p < 0.001) के विरुद्ध शुष्क या आर्द्र फ़ीड गैस शर्तों के पूरे समूह साधनों की तुलना प्रसरण के एक-तरफा विश्लेषण का उपयोग कर । इसके अतिरिक्त, आर्गन गैस केवल प्लाज्मा शर्तों पूरे समूह मतलब और टी परीक्षण का उपयोग तुलना में थे (# # # p < 0.001). इसके अलावा सांख्यिकीय विश्लेषण (एफ) FCS और बिना FCS के साथ नमूनों में प्रत्येक प्लाज्मा उपचार और मध्यम स्थिति के मूल्यों की तुलना टी परीक्षण का उपयोग किया गया था (* p < 0.05; * * p < 0.01); इसके अलावा, FCS या गैर FCS युक्त समाधान टी परीक्षण (# p < 0.05; # # p < 0.001) का उपयोग करते हुए प्रत्येक प्लाज्मा उपचार समय के भीतर तुलना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : प्लाज्मा उपचार और कोशिकाओं पर इसके प्रभाव । (A) कोशिकाएं प्लाज्मा के संपर्क में थीं और resazurin चयापचय गतिविधि का आकलन करने के लिए 20 घंटे के बाद जोड़ा गया था । () गतिविधि में गैस नियंत्रणों की तुलना में plasmatreated नमूनों में काफी कमी आई थी । एक चिह्नित कमी ऑक्सीजन और/या नाइट्रोजन दोनों सूखी और आर्द्र आर्गन गैस की स्थिति में विषाक्तता के लिए सुराग के अलावा जबकि फ़ीड गैस के humidification के साथ देखा गया था । () मध्यम जिसमें propidium आयोडाइड (PI) जोड़ा गया था । (D) एक ओवरव्यू के साथ प्लेट के कुओं का दिखाया गया है डिजिटल चरण कंट्रास्ट (नारंगी) प्रत्येक कोशिका और PI के cytosolic अंश का प्रतिनिधित्व (हरा) मृत कोशिकाओं की पहचान करने के लिए । इमेजिंग उपकरण एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के साथ कवर के देखने के क्षेत्र के भीतर कुल क्षेत्र की मात्रा की अनुमति दी । () कोशिकाओं को बाद में धोया और एंटीबॉडी या अंय सेल मार्करों के साथ मशीन को जैविक प्लाज्मा प्रवाह cytometry का उपयोग प्रभाव की विशेषताएं थे । (G) गेटिंग रणनीतियों कार्यरत थे और मार्कर विश्लेषण किया गया और नमूनों के बीच तुलना की गई । (बी, ई, एच) दिखाया डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों के एक प्रतिनिधि का मतलब + SEM निरूपित । स्केल बार = २०० µm (D) । सांख्यिकीय तुलना प्रसरण का दो-तरफ़ा विश्लेषण का उपयोग कर किया गया था (B, H), प्रत्येक गैस स्थिति के लिए, प्रत्येक प्लाज्मा उपचार के लिए उसके संबंधित गैस नियंत्रण (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001) । साथ ही, नाइट्रोजन और/या ऑक्सीजन admixtures की प्रत्येक शर्त के लिए मानों की तुलना सूखे और आर्द्र परिस्थितियों के लिए आर्गन गैस प्लाज्मा के मूल्यों से की गई थी (प्रसरणों का दो-तरफा विश्लेषण; # # # p < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

बुनियादी अनुसंधान की प्रभावकारिता की समझ विकसित करने के लिए मौलिक और तंत्र underpinning प्लाज्मा चिकित्सा और नैदानिक अनुसंधान में । मौलिक अनुसंधान भी उपचार के लिए नए आवेदनों की जांच को बढ़ावा देता है । हालांकि यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्लाज्मा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन और नाइट्रोजन प्रजातियों के19की पीढ़ी के माध्यम से अपने जैविक प्रभाव मध्यस्थता, वहां अभी भी तीन क्षेत्र के लिए मुख्य चुनौतियां हैं । सबसे पहले, कौन सी प्रजातियों महत्वपूर्ण हैं? यह आंशिक रूप से ऑप्टिकल निदान और जैविक readouts के साथ प्लाज्मा की फ़ीड गैस रचना संग्राहक द्वारा उत्तर दिया जा सकता है । 20 दूसरे, क्या प्रभाव कोशिकाओं के रूप में जैविक लक्ष्य में देखा जा सकता है? यह है, कम से कम भाग में, सेल संस्कृति प्रयोगों और परख के एक नंबर का उपयोग कर संबोधित किया । युकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रभाव सेल चक्र गिरफ्तारी21, apoptosis22, परिगलन23, और त्वचा सेल उत्तेजना24,25,26, साथ ही एक समर्थन या सेल के कमी सहित pleiotropic हैं गतिशीलता या चयापचय गतिविधि27,28,29. तीसरी चुनौती, इन pleiotropic प्रभाव से संबंधित है, के लिए महत्वपूर्ण अणुओं की पहचान करने के लिए है कि प्लाज्मा-व्युत्पंन oxidants को सेलुलर प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए विभिंन प्रभाव अक्सर विभिंन प्रकार के सेल में देखा समझा । यह ओमिक्स तकनीक द्वारा किया जा सकता है30,31,३२ और/या ऊपर या लक्ष्य जीन का downregulation सिरना का उपयोग (redox) अवरोधकों, antioxidants और एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमों संकेत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मॉडुलन प्लाज्मा प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के उत्पादन । ३३ , ३४ , ३५ इसलिए, सुव्यवस्थित परख प्रोटोकॉल पुनरावृत्तियों की बड़ी संख्या के साथ बड़ा नमूना सेट का परीक्षण करने के लिए आवश्यक हैं ।

यह अध्ययन एक कुशल प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह मिसाल, भौतिकी से जीव विज्ञान के लिए, aforementioned चुनौतियों के संबंध में प्लाज्मा चिकित्सा अनुसंधान के लिए. प्लाज्मा स्रोत और प्लाज्मा उत्पादन के इंजीनियरिंग पहलुओं पर विवरण से पहले वर्णित किया गया है । ३६ , ३७ , ३८ इन सभी की परख 96well प्लेटों में की जाती है, जिसके कई फायदे हैं । उदाहरण के लिए, ऐसे सेल संस्कृति supernatants के रूप में नमूनों को आसानी से परख से संग्रह प्लेटों के लिए किया जा सकता है की जांच करने के लिए, जैसे एंजाइम के माध्यम से प्रोटीन सांद्रता-immunosorbent-परख से जुड़े । यदि ९६-कुओं से सीधे पढ़ने में सक्षम वैज्ञानिक उपकरण उपलब्ध है, तो इस तरह के एक दृष्टिकोण नमूना और handsontime प्रति लागत को कम करता है और एक ही नमूना से अलग परख मल्टीप्लेक्स द्वारा परिणाम अधिकतम । मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग इसके अतिरिक्त नमूना हैंडलिंग को गति । सिद्धांत रूप में, यहां वर्णित परख भी बड़े अच्छी तरह से व्यास के साथ अच्छी तरह से थाली स्वरूपों का उपयोग किया जा सकता है, हालांकि इस बहाव परख के लिए अंय ट्यूबों और जहाजों में अतिरिक्त pipetting कदम की आवश्यकता होगी । ऐसे 384well प्लेटों के रूप में छोटे प्लेट प्रकार, तथापि, ज्यामिति बड़े फ़ीड गैस फ्लक्स के साथ जेट विमानों का उपयोग कर जैव चिकित्सा प्लाज्मा अनुसंधान के लिए उपयुक्त उपस्थित नहीं है । विशेष रूप से, यह गारंटी है कि केवल एक ही नहीं बल्कि आसंन कुओं एक इलाज के दौरान प्रभावित कर रहे है नहीं किया जा सकता ।

तरल विश्लेषण के लिए प्लाज्मा द्वारा प्रजातियों जमाव की जांच आवश्यक है । विशेषज्ञ विश्लेषण में, विभिंन परख के एक समानांतर सेटअप एक ही समय में विभिंन oxidants के संबंध में plasmatreated तरल पदार्थ की विशेषता कर सकते हैं । यह मल्टीप्लेक्स plasmaderived प्रजातियों के विभेदित चित्र विकसित करने की अनुमति देता है । वर्णित दृष्टिकोण अत्यधिक हाइड्रोजन पेरोक्साइड सांद्रता३९, जो अक्सर आवश्यक है, लेकिन हमेशा प्लाज्मा प्रभाव समझाने के लिए पर्याप्त नहीं की जांच करने के लिए संवेदनशील है । ४० , ४१ , ४२ जैविक रूप से प्रासंगिक प्रभाव भी तरल पदार्थ में एक glutathione परख यहां शामिल नहीं के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । ४३ विशिष्ट नाइट्राइट परख दृढ़ता से पारंपरिक Griess पर सिफारिश की है 10fold उच्च परख संवेदनशीलता के कारण परख (नहीं दिखाया डेटा) । Plasmatreated तरल पदार्थ भी DTNB-परख का उपयोग hypochlorous एसिड के गठन के लिए जांच की जा सकती है । फिर भी, पिछले परिणाम हमारे प्लाज्मा स्रोत के साथ कि प्रजातियों के गठन का संकेत नहीं दिया । 19 , ३९ , ४४ प्लाज्मा उपचार के बाद समाप्त हो गया है, प्रजातियों गिरावट समय के साथ जगह लेता है । नाइट्राइट नाइट्रेट के प्रति प्रतिक्रिया करता है; इसके अलावा, पेरोक्साइड समय पर भस्म हो जाता है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं कई घंटे लग । ३५ Cytochrome सी अवशोषण कई घंटे के रूप में अच्छी तरह से अधिक स्थिर है । इसलिए, अगर प्रक्रियाओं उपचार के बाद पहले 30 मिनट के भीतर हो, लंबे समय से जीवित प्रजातियों की सांद्रता में भिंनता यहां वर्णित नगण्य हैं । हालांकि, ध्यान दिया जाना चाहिए जब मीडिया के कुछ प्रकार की जांच (जैसे, Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम) सामग्री के रूप में ९०% पेरोक्साइड के लिए 1 घंटे में सफाई कर सकते है (नहीं दिखाया गया डेटा) प्लाज्मा पेरोक्साइड के एक अनुमान के लिए अग्रणी में तरल.

एक मल्टीप्लेक्स परख प्रस्तुत की है जो सेल क्षेत्र (आकृति विज्ञान) पर चयापचय गतिविधि की जांच से सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति के लिए पर्वतमाला । इन परख का एक संयोजन दिलचस्प परिणाम प्रकट हो सकता है । उदाहरण के लिए, हम पहले THP1 monocytes में दिखाया गया है कि चयापचय गतिविधि और कोशिका गिनती प्लाज्मा के लिए जोखिम के बाद एक रैखिक फैशन में कमी नहीं है. ४५ बल्कि, प्लाज्मा उपचार के समय में वृद्धि के साथ, कोशिकाओं को मनाया गया है कि आकार में वृद्धि हुई थी और एक उच्च mitochondrial मास था, इस प्रकार एक percell आधार पर उच्च चयापचय दर के लिए अग्रणी । मूलतः, multiplate पाठक, माइक्रोस्कोपी, और प्रवाह cytometry मल्टीप्लेक्स के प्लाज्मा उपचार के बाद सेलुलर प्रतिक्रियाओं पर जानकारी का संयोजन । मेलेनोमा कोशिकाओं में, हम यहां साइटोटोक्सिक प्रभाव और उनके immunogenicity calreticulin द्वारा मध्यस्थता पर ध्यान केंद्रित । सिद्धांत रूप में ४६ , कई अंय सवालों के इस दृष्टिकोण इमेजिंग और प्रवाह cytometry परिणामों के साथ चयापचय गतिविधि को जोड़ने के साथ संबोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोशिका विभेदन (उदा. macrophage ध्रुवीकरण), mitochondrial झिल्ली क्षमता, कोशिका चक्र विश्लेषण, सेल गतिशीलता, यांत्रिक या micronucleus गठन genotoxicity के विश्लेषण के लिए भी जाँच की जा सकती है प्लाज्मा इलाज कोशिकाओं । बहुरंगा प्रवाह cytometry एक ही समय में अलग सेल आबादी में भी अधिक अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है । यह शामिल है, उदाहरण के लिए, संकेतन प्रोटीन की फास्फारिलीकरण स्थिति का विश्लेषण जैसे प्रतिलेखन कारकों, mRNA ठहराव, intracellular साइटोकिंस की माप, और/या एक ही कक्ष स्तर पर कुल कम thiols का आकलन । अतिरिक्त जैविक रूप से प्रासंगिक जानकारी है कि आगे प्लाज्मा redox प्रभाव की तस्वीर को विकसित करने में बेहतर वर्तमान और भविष्य प्लाज्मा अनुप्रयोगों को समझने में प्रत्येक नमूना एड्स के लिए उपलब्ध है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

जर्मन संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (BMBF अनुदान संख्या 03Z22DN11 और 03Z22DN12) से धन आभार स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

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References

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प्लाज्मा चिकित्सा में बुनियादी अनुसंधान-तरल पदार्थ से कोशिकाओं को एक प्रवाह दृष्टिकोण
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Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

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