Summary
액체 및 셀의 높은 처리량 차가운 실제 플라즈마 치료 프로토콜 표시 됩니다. 플라즈마 처리 후 플라즈마의 방출 스펙트럼, 액체 및 세포 활동의 후속 분석 측정 다른 피드 가스 플라즈마 점화에 대 한 구성 설정 포함 됩니다.
Abstract
플라즈마 의학, 척추 시스템의 주변 온도와 이온된 가스는 세포와 조직에 적용 됩니다. 콜드 플라즈마 생성 반응 종 redox 알려진 조절 건강 및 질병에 생물학 과정. 전 임상 및 임상 증거는 피부의 만성 궤 양 치유에 플라즈마 처리의 유익한 효과를 가리킵니다. 플라즈마 암 치료 등 다른 신흥 주제 증가 관심을 받고 있다. 플라즈마 의료 연구는 물리학, 화학, 및 의학 분야 전문 지식을 필요합니다. 플라즈마 연구의 한 목표는 특정 응용 프로그램의 다양 한 플라즈마 처리 셀의 특성입니다. 이 포함, 예를 들어 세포 수 그리고 생존, 세포질 산화, 미토 콘 드리 아 활동, 세포 독성 및 세포 죽음, 세포 주기 분석의 세포 표면 마커 식 및 cytokine 릴리스. 이 연구는 필수 장비와 같은 플라즈마 생물 의학 연구에 필요한 워크플로 설명 합니다. 대기 압력 아르곤 플라즈마 제트, 특히 그것의 기본적인 방출 스펙트럼 모니터링 및 먹이 반응 종 출력 변조 하 가스 설정의 적절 한 작업을 설명 합니다. 높은 정밀 xyz 테이블 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용 하 여, 제트기는 맴돌고 밀리초 정밀도에서 최대한 재현성에 대 한 마이크로 미터-정밀에서 96 잘 접시의 구멍. 산화 환 원 활동적인 분자의 액체 분석에 대 한 다운스트림 분석 표시 되 고 대상 셀은 플라즈마 처리. 특히, 흑색 종 세포 동일한 셀을 사용 하 여 다른 연속 분석 실험의 효율적인 순서로 분석: 신진 대사 활동, 총 셀 영역, 그리고 calreticulin에 대 한 중요 한 분자의 표면 마커 식의 측정은 암 세포의 면역성 세포 죽음입니다. 이 분석 실험 단일 플레이트에서 플라즈마 효과 대 한 내용이 풍부한 생물 정보를 검색합니다. 이 연구 필수 단계 및 플라즈마 의료 연구에 대 한 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
반응 종은 비정상적인 상처1 과 암 치유를 포함 하 여 질병에 중요 한 산화 환 원 레 귤 레이 터 이다입니다. 2 중요 한 것은, 이러한 종 병 리 뿐만 아니라 그것의 치료 해결책에서 포함 된다. 3 , 4 찬 실제 플라즈마는 많은 종류의 반응 종 퇴 학 시켜도 이온화 가스 이다. 5 신체 온도6에서 작동 하는 소위 냉 플라스마의 출현 이후 차가운 플라스마 세포와 열 피해 없이 조직에 적용할 수 있습니다. 효능과 전 임상 및 임상 관찰에서 플라즈마 장치 안전 응용 프로그램으로, 3 독일에서 의료 기기로 인증을 받았습니다. 7 차적인 안전에 관해서는 특히 여러 연구 나타났습니다 최초의 장치, 대기압 아르곤 플라즈마 제트를 사용 하 여 돌연변이 이벤트의 부재. 8 , 9 , 10 다른 두 장치는 플라즈마 제트 보다 다른 원리를 통해 작동 하는 소위 유 전체 장벽 방전 (DBD)입니다. 특히, 제트기 DBD 플라즈마는 큰 하지만 오히려 평면 조직 영역에서 효율적인 반면 메스 같은 표면 및 충 치의 치료에 대 한 허용. 세포질 산화 환 원 신호11을 이용, 기술은의 목적은 생명 의학 어플리케이션에 대 한 플라즈마 생성 반응 종 활용 하입니다. 12 임상 플라즈마 치료의 특히 유망한 응용 상처 치유의 지원 이다. 13 , 14 , 15 또한, 플라즈마 표시 했다 동물 모델에서 항 암 효과가지고. 16 , 17 , 18
동물 모델, 또는 심지어 인간에서 플라즈마 응용의 안전과 효능 검증, 생체 외에서 연구 해야 플라즈마 장치 실시를 표준화. 이 실험은 플라즈마 응용 프로그램을 탐구 하 고 직장에서 메커니즘의 윤곽을 그리 다 필수적 이다. 또한, 기초 연구 반응 종 및 후속 생물학적 효과의 구성의 영향을 이해 하는 것 필요 합니다. 이 연구에서는 플라즈마 생물 의학 연구를 더 잘 이해 하 고 세포에 미치는 영향을 제어 통합할 수 있는 방법을 보여 줍니다. 그것은 피드 가스 조성, 반응 종 출력의 모니터링, 액체, 셀, 및 조직, 및 결과 화학 및 생물 학적 결과 플라즈마의 응용 프로그램 튜닝을 설명 합니다. 또한, 예제는 플라즈마 96 잘 접시에 의료 연구에 중점을 두고 플라즈마 처리 및 다운스트림 생물학 분석 실험의 표준화에 지시 제공 됩니다. 이 접근은 뚜렷한 장점: 나) 셀 필요 조건, 시 약 비용, 시간과 실습 샘플; 당 당 수의 최소화 ii) 당의 중복 또는 triplicate 치료; 쉽게 설정할 수 있습니다 결과의 높은 정확도 그리고 iii) 원활한 다운스트림 시 금 96 잘 형식 플레이트 리더, 이미징, 및 교류 cytometry 실험의 촉진.
Protocol
1. 플라즈마 종 모니터링 및 치료 설정
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플라즈마 종 모니터링
- 대기압 플라즈마 제트와 가스 유량을 공급 하는 분 당 2 개의 표준 리터의 최대 사용 합니다.
- 깃털 축에 수직 광 방출 분 광 광도 계, 앞 제트 놓고 기록 광전자 방출 및 파장 (200-1000 nm)를 사용 하 여 전용 소프트웨어.
- 질소 또는 산소 건조 또는 습도 공급된 가스 (5%)를 0.5% 혼합.
- 각 가스 상태에 대 한 광 방출 분광학을 반복 합니다.
- 분석 데이터의 그래픽 표시에 대 한 적절 한 소프트웨어와 함께.
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플라즈마 치료 설정
- 컴퓨터 기반 xyz 테이블 jet 수정.
- 우물의 위치를 식별 하 고 적절 한 치료 시간 각 우물의 센터의 위 테이블에 조인 하는 제트 이동 컴퓨터 스크립트를 생성 합니다.
- 10 추가4 완전 한 세포 배양 매체의 100 µ L에 포유류 부착 세포의 모든 종류의 (FCS가 10%, 2% 글루타민, 및 1% 페니실린/스 RPMI1640) 층 류 두건 아래 여러 우물에.
- 세포 접착 하룻밤 5% 이산화탄소 습도 분위기에서 37 ° C에서 발생 하는 것을 허용 한다.
- 20에 대 한 플라즈마 세포 치료 250 µ m 간격 다른 높이 (z 축)에서 s.
- 세포 배양 매체에서 각 잘 propidium 요오드 화물의 25 µ L를 추가 합니다.
- 이미지 피드 인해 세포 괴 사를 유도 하지 않는 특정 높이 확인 하려면 현미경 세포 가스 옆으로 셀 위에 문화 매체를 밀어.
참고: 긴 치료 시간에 대 한 식별 켜고 모드 플라즈마가 특정 높이에서 액체 증발 접시를 다시 설정 하는 데 필요한 doubledistilled 물의 microliters의 수량을 식별 하기 위해 플라즈마 치료 전후 무게 대우 웰 스에서 삼 투 항상성입니다. - 각 치료 시간 xyz 테이블에 대 한 최종 프로토콜을 준비 (여기: 20 s, 40 s, 60 s 플라즈마 및 60 s 가스 제어) 위치, 잘 하 고 있고 준비 멀티 채널 펫 저수지 96 잘 접시의 액체 처리에 대 한 후속 분석 실험에.
2. 플라즈마 처리 액체에 있는 주요 반응 구성 요소 분석
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과산화 수소 플라즈마 처리의 분석
- 평면-바닥 96 잘 접시 3 중에서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 플라즈마의 100 µ L를 취급 합니다.
- 10 양 고추냉이 과산화 효소의 U와 PBS의 100 µ L 및 과산화 수소 검출 시 약의 5 µ M 로드 마스터 믹스를 준비 (충분 한 잘, 그에 따라 최대 규모).
- 각 음을 마스터 믹스의 95 µ L를 추가 합니다.
참고: 이전 단계 해야 수행할 수 또는 플라즈마 소스에서 별도 방에 깨끗 한 벤치에서 대기 오존 분석 결과의 감도 줄일 수 있습니다. - 별도 접시에 100 µ L PBS에서 100 µ M의 최고 농도와 PBS에서 과산화 수소의 두 배 희석 시리즈 준비.
- 검출 시 약을 포함 하는 웰 스에 샘플 또는 과산화 수소 기준의 5 µ L를 추가 합니다.
- 웰 스는 읽어 후 배경 빼기에만 검출 시 약을 포함 포함 됩니다.
- 실 온에서 15 분 동안 어둠 속에서 접시를 품 어.
- Λ전 535 nm 및 λem 590 nm에 형광을 측정 microplate 리더에 접시를 놓습니다.
참고: 있으면 높은 과산화 수소 농도 샘플, 샘플 희석 증가 될 필요가 또는 수치 분석 결과의 채도 피하기 위해 보육 시간을 단축 할 수 필요. - 모든 샘플에서 빈 값을 빼기, 과산화 수소 표준 곡선을 계산 하 고 해당 기준선 곡선에서 알 수 없는 샘플 과산화 수소 농도 계량.
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플라즈마 처리 아 질산염의 분석
- Flatbottom 96well 접시 3 중에서 플라즈마와 PBS의 100 µ L를 취급 합니다.
- 물 doubledistilled의 99 µ L를 정량화 시 약의 1 µ L을 추가 하 여 아 질산염 검출 솔루션의 마스터 믹스를 준비 (충분 한 잘, 그에 따라 최대 규모).
- 명확 하 고, flatbottom 96well 접시에 잘 당 100 µ L를 추가 합니다. 우물의 수에 대 한 필요에 따라 규모.
- Doubledistilled 물에 아 질산염 기준의 희석 시리즈 준비.
- 표준 또는 샘플의 10 µ L 96well 접시에 마스터 믹스를 추가 합니다.
- 실 온에서 10 분 동안 어둠 속에서 접시를 품 어.
- 각 음에 아 질산염 정량화 개발자 솔루션의 5 µ L를 추가 합니다.
- Microplate 리더 λ전 365 nm와 λem 450 nm에에서 형광을 읽기.
- 모든 샘플에서 빈 값을 빼기, 아 질산염 표준 곡선을 계산 하 고 해당 기준선 곡선에서 알 수 없는 샘플 아 질산염 농도 계량.
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플라즈마 처리 Superoxide의 분석
- 산화 시 토 크롬 (1 mg/mL)의 마스터 믹스 만들기 및 PBS에 catalase (20 µ g/mL).
- 분명, 평면 바닥 96 잘 접시의 우물에 믹스 마스터의 100 µ L를 추가 합니다.
- 치료 조건 당 3 중에서 플라즈마와 마스터 믹스를 취급 합니다.
- 읽기 흡 광도 550 nm microplate 리더;를 사용 하 여 이 데이터를 그래프.
- 잘 내 시 토 크롬 C의 어 금 니 소멸 계수와 액체의 빛 경로 길이 사용 하 여 생성 하는 초과 금액을 계산 합니다.
3. 플라즈마에 노출 된 세포의 생물학 응답
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플라즈마 처리 셀의 다차원 읽어: 신진 대사 활동
- 층 류 흐름 후드를 사용 하 여 다음 절차의 모든.
- 씨앗 104 세포 (B16 murine 흑색 종) 100 µ L 완전 평면 바닥 96 잘 접시에 잘 당 세포 배양 매체 보충.
- 5% 이산화탄소와 부 화기의 습도 분위기에서 37 ° C에서 하룻밤 세포 접착을 허용 합니다.
- Xyz 테이블을 사용 하 여, 플라즈마 또는 미리 정의 된 스키마에 따라 혼자 가스 우물을 취급 하 고 다시 20 h 인큐베이터에 셀을 추가.
참고: 원하는 경우 벗어 supernatants 20 h 후 분석 extracellular 제품; 이후에 신선한 매체의 100 µ L를 추가 합니다. - 각 잘 추가 500 µ M resazurin (최종 농도 100 µ M);를 포함 하는 셀 문화 매체의 25 µ L resazurin 혼자 셀 배경 빼기 없이 세포 배양 매체에 포함 된 3 개의 우물을 준비 합니다.
- 인큐베이터에서 3 h에 품 어.
- Λ전 535 nm와 microplate 리더에서 λem 590 nm에 형광을 읽기.
- 모든 샘플에서 배경 형광을 빼기 고 컨트롤 값에는 데이터를 정상화.
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플라즈마 처리 셀의 다차원 읽어: 이미지 분석
- 3.1.7에서 잘 플레이트를 사용 하 고 상쾌한 삭제.
- 1 µ g/mL propidium 요오드 화물을 포함 하는 신선한 세포 배양 매체의 100 µ L를 추가 합니다.
- 각 잘 이미지를 자동화 한 단계 현미경 접시를 넣어.
참고: 영상 정보는 실험 질문;에 따라 달라 집니다. 여기, 20 X 목표 읽기에 밝은 필드 채널, 디지털 위상 대비 채널, 그리고 적절 한 여기 빛 및 방출 하는 형광 (propidium 요오드 화물) 채널에서 각 잘 시야 3 x 3이 콘텐츠 이미징 장치에 사용 된 필터입니다. - 양적 이미지 분석 소프트웨어 디지털 단계 이미지 보기의 모든 필드에에서 총 cytosolic 영역을 결정 하는 각 음에 몇 군데.
참고: 원하는 경우, 예를 들어, 가능한 및 죽은 세포의 미토 콘 드리 아 활동 전용된 얼룩을 사용 하 여 번호 추가 매개 변수를 분석 합니다. 경우에이 작품에서 설명 보다 다른 얼룩을 사용 하 여, 현미경 검사 법에 사용 되는 형광 얼룩 이후의 흐름 cytometry 실험에 사용 되는 형광으로 괴기 하 게 오버랩 되지 않는 있는지 확인 하십시오. - 데이터, 그래프 및 원하는 경우, 신진 대사 활동에 대 한 가져온 값으로 상관 관계에 대 한 테스트 합니다.
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플라즈마 처리 셀의 다차원 읽어: Cytometry 흐름
- 이 분석에 대 한 단계의 3.2.5 잘 플레이트를 사용 합니다.
- 삭제는 상쾌한 고 칼슘과 마그네슘을 포함 하는 PBS의 200 µ L로 두 번 씻어 (0.9 m m와 0.5 m m, 각각).
참고: 수정 또는 세포내 항 원 또는 세포 주기 분석의 얼룩 등이 기여에서 다루지 않는 추가 생물 정보에 대 한이 단계에서 세포를 permeabilize. - 각 잘 하려면 칼슘 및 마그네슘 50 ng/mL 반대로 마우스 calreticulin 단일 클론 항 체를 포함 된 PBS의 50 µ L를 추가 합니다.
- 인큐베이터에서 15 분 동안 품 어.
- 200 µ L의 두 번 씻어 완전히 세포 배양 매체를 보충 하 고 접시에 액체를 폐기.
- 각 음을 세포 분리 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 인큐베이터에 20 분 동안 품 어.
- 흠 없는 B16 셀 서 스 펜 션의 또 다른 세트를 사용 하 여 흐름의 cytometric 수집 프로토콜 게이팅 전략, 그리고 상승 및 전압 검출기의 설치.
- 96 잘 접시를 위한 자동 샘플러 장비 교류 cytometer에 접시를 로드 합니다.
- 앞으로 1000 셀과 사이드 분산형 인구 실행 가능한 세포와 일반적으로 관련 된 최소 취득.
- Cytometry, 관심, 인구 게이트를.fcs 파일의 분석에 대 한 전용 소프트웨어를 사용 하 고 calreticulin의 평균 형광 강도 결정 합니다.
- 데이터, 그래프 및 원하는 경우, 대사 활동, 이미징, 및 산화 제 증 착에 대 한 가져온 값으로 상관 관계에 대 한 테스트 합니다.
Representative Results
이 연구에서 간소화 된 워크플로우는 플라즈마의 효과에 의료 연구에 대 한 설명 했다. 여기에 활용 하는 종합 접근 플라즈마 제트, 액체, 반응성 주성분의 기본적인 광학 방출 프로 파일을 분석 하 고 세포의 생물학적 반응 (그림 1) 플라즈마로 처리.
이 워크플로 실시, 다양 한 구성 요소는 플라즈마 소스 (그림 2)를 제대로 설정 하 필요 했다. 다른 가스 (여기 주로 아르곤, 산소 및 질소)에 공급 되었고 여러 질량 유량 컨트롤러에 의해 제어. 중앙 패널 디지털 질량 유량 컨트롤러 미리 지정 된 피드 가스 플럭스를 조정에 사용 되었다. 특정 피드 가스 작곡 항복, 가스 여러 질량 유량 컨트롤러 (그림 2A)에서 가스를 결합 하는 밸브의 패널을 이용 하 여 물리적으로 혼합 했다. 플라즈마 소스는 켜지 고 플라즈마 유출 한 USB-분 광 광도 계 (그림 2B) 200의 광학 범위 앞 세워졌다 1000 nm nm. 액체 및 세포 치료에 대 한 효율적인 워크플로 96 잘 접시를 사용 하 여 설명 했다. 다 잘 요리 베이스 플레이트에 고정 플라스틱 프레임을 사용 하 여 삽입의 패키지 구멍 (그림 2C) 일치와 장소에서 개최 했다. 전체 설치 층 흐름 후드 (그림 2D) 배치 했다. 이 설치 포함 xyz 테이블 플라즈마 제트의 휴대용 조각을 탑재 했다. 후자는 충분히 큰 케이블 포트와 xyz 테이블에 경우 벤치, 외부 모터 제어 요소를 찾을 수 있습니다. 중요 한 것은, 테이블 컴퓨터 제어 이었고 마이크로미터 정밀 각의 센터를 통해 원하는 양의 시간에 대 한 제트기를 프로그래밍할 수 있습니다. 또한, (우리의 설치 잘 A1)에서 시작 위치 (그림 2E) 선택 자유롭게 되었다. 플라스틱 접시 홀더, 함께이 전적으로 액체 및 생물 실험의 설치에 관련 된 어떤 일상적인 변화 재현 플라즈마 처리에 대 한 허용.
다른 피드 가스 조건 (그림 3A) 구성 요소 반응 플라즈마에 연결 된 다른 봉우리를 따라 광 방출 분광학 (OES) 사용 되었다. 330에서 봉우리와 질소의 예를 들어 두 번째 긍정적인 시스템 380 nm 대표 반응성 질소, 종과 309 nm 대표 수 산 기 급진 파 (화살표 그림 3A)에서 피크 nm. 혼자 아르곤 가스에 비해, 질소의 존재 증가 질소의 혼합물으로 공급된 가스에 산소 또는 습도 저하 또는, 각각 감소 하는 반면. 대조적으로, 수 산 기 급진 파의 존재 산소 또는 질소 감소 했지만 현저 하 게 증가 하는 경우 습도 아르곤 가스 공급된으로 사용 되었다. 액체의 플라즈마 처리, 아르곤 가스와 아르곤 플라즈마에 의해 발생 하는 증발 결정 했다 첫번째 (그림 3B). 중요 한 것은, 플라즈마는 또한 온도에 영향을 미치는 때문에 두 조건이 모두 비슷한 결과 얻을 하지 않았다. 수 산 기 급진 파의 OES 결과 따라 과산화 수소 증 착 크게 산소 또는 질소 혼합물으로 감소 하지만 습도 공급 가스 (그림 3C) 증가. 또한, 공급된 가스에 질소의 아르곤 플라즈마 처리 액체 (그림 3D)에 비해 크게 높은 아 질산염 농도 이끌어 냈다. 이 워크플로 수 또한 다른 작곡과 액체에 플라즈마의 영향을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 과산화 수소 농도 PBS 및 RPMI1640 세포 배양 매체 (그림 3E) 혈 청 태아 종 아리의 존재의 독립적인 것 같았다. 동일한 샘플에서 혈 청의 존재는 그들의 혈 청 비 포함 대응 (그림 3F)에 비해 PBS와 세포 배양 매체에서 아 질산염 농도 감소. 대부분 초과 산소 / 질소 혼합 크게 냉각 하는 습도 아르곤-산소 플라즈마 (그림 3G)을 제외한 초과 세대와 건조 아르곤 가스 조건에서 제작 되었다.
다 잘 요리에서 셀의 플라즈마 치료를 위해 포함 셀 시드 하루 전에 접시 인큐베이터에서 제거 하 고 플라스틱 홀더를 추가 했다. 프로그램된 치료 패턴 적용, 증발 했다에 대 한 보상 및 접시 20 h. 참고는이 부 화 후 셀 문화 supernatants 수 새, 빈 96 잘 접시에 수집 되었고-저장에 대 한 인큐베이터에 다시 배치 했다 관심사의 단백질의 평가 위한 80 ° C. 다음으로, resazurin의 각 셀에 추가 되었습니다. 비 형광 형광 resorufin에 resazurin의 활성 NADPH를 생성 하는 효소에 의해 촉진 되었다 고 전반적인 신진 대사 활동(그림 4)와 상관 했다. 형광 강도 접시의 시각적 인식에 유사 했다 그리고 장기간된 플라즈마 처리 (그림 4B)의 세포 독성 효과 표시. 습도 가스 조건 건조 가스 조건 보다 더 유해 했다. 접시에 같은 셀 추가 다운스트림 분석 실험에 대 한 활용 했다. 접시에 셀은 현미경으로 조사 (그림 4C). 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 접시의 여러 우물 질적 비교 (그림 4D)를 위해 시험 되었다. 소프트웨어 허용 전체 면적의 정량화에 각 잘 인수 시야 내의 셀 하 고 결과 데이터를 각각 컨트롤 (그림 4E) 표준화 했다. 총 셀 영역의 감소 특히 습도 공급된 가스 조건으로 플라즈마 처리 샘플에서 보였다. 이미징, 후 셀 세척, 반대로 마우스 calreticulin 항 체와 스테인드, 분리, 되었고 cytometry (그림 4F)와 분석. 형광 calreticulin 가능한 셀 (그림 4G)에 얼룩의 농도 계산 되었고 샘플 (그림 4H) 사이 비교 의미. 플라즈마 처리는 플라즈마 처리 시간 건조 피드 가스 조건 적용에 대응 murine 흑색 종 세포 표면에 calreticulin의 upregulation를 유도 한다. 습도 공급된 가스 조건, 20 대와 40 치료의 s 60 s 처리 시간 더 치명적인에 비해 강력한 calreticulin 노출 유도. 이 셀에 도입 oxidants의 양에 관해서는 calreticulin 노출의 비 선형 레 귤 레이 션 했다 나왔다.
그림 1 : 생물학 물리학에서 플라즈마 의료 연구의 워크플로. 대기압 아르곤 플라즈마 제트의 반응 종 출력 피드 가스를 변조 하 여 조정 됩니다. 플라즈마 가스 단계에서 선택한 분자 분광학을 사용 하 여 모니터링 됩니다. 플라즈마는 액체를 취급 하 고 산화 제 증 착을 조사 하는 데 사용 됩니다. Microplates에서 경작 하는 세포는 플라즈마 처리 하 고 생물 학적 판독 수행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 플라즈마 연구 벤치의 설치. (A)에 있는 다른 가스 스테인리스 파이프 중앙 패널을 통해 제어 되는 여러 질량 유량 컨트롤러에 구동 됩니다. 개별 피드 가스 조성 이후 밸브의 패널을 사용 하 여 혼합 합니다. (B) 광학 방출 분광학을 사용 하 여 다양 한 피드 가스 구성 간의 차이점을 조사 하는 플라즈마의 사후 일부 구성 요소를 모니터링할 수 있습니다. (C) 높은 처리량 플라즈마 연구, 96-잘 microplates 사용 됩니다. 상수 풀 그릴과 자동 플라즈마 처리에 대 한 출발점을 위해 접시는 매일 접시의 동일한 절대 위치를 보장 하는 프레임에 추가 됩니다. (D) 플라즈마 제트는 컴퓨터 제어 xyz-표 층 흐름 후드 아래에 고정 됩니다. 모든 96 정확한 위치 및 각에 플라즈마의 유지 시간 잘 플라즈마 소스의 움직임을 안내 하는 프로그램 파일에 기록 됩니다. 플라즈마 제트 장치 모터 제어의 기본 틀은 가까이에 있습니다. (E) 96 잘 접시의 플라즈마 처리를 자동화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 플라즈마 제트와 액체 분석. (A) 광학 방출 분광학 다른 피드 가스 조건의 표시 됩니다. 질소의 두 번째 긍정적인 시스템 (330 380 nm nm) 산소 혼합물의 경우 결 석, 질소의 혼합물으로 증가 하 고 습도 아르곤 (왼쪽 패널) 현저 하 게 감소 되었다. 309에 수 산 기 급진 파의 피크 nm (화살표) 질소와 산소 조건에서 감소 하지만 습도 아르곤 아르곤 가스 혼자에 비해 현저 하 게 증가. (B) 가스 노출 액체의 증발을 리드. 플라즈마 및 아르곤 가스 혼자 치료 시 96well 접시에 잘 당 증발 양의 벌금 규모를 사용 하 여 치료 전후 접시 무게에 의해 결정 되었다. Plasmatreated 샘플에 증발 했다 높은 비교 아르곤 gastreated 샘플에. (C) (A)에 수 산 기 급진 파의 309 nm 피크와 어느 정도 상관 plasmatreated 액체에 수소 과산화물의 생성. 습도 (5%) 아르곤 플라즈마에 대 한 4fold 과산화 수소 농도 증가. (D) 아 질산염 질소 공급된 가스에 추가 하 고이 효과 습도 아르곤 플라즈마로 증가 했다 상승 했다. 산소의 추가 감소 아 질산염 발생 하지만 크게 없습니다. (E, F) 수소 과산화 수소와 아 질산염 농도 액체, 즉 RPMI1640 세포 배양 (R10F)와 다른 종류에 표시 됩니다 (R0F) 없이 PBS와 함께 송아지 태아 혈 청 (FCS) 없이 뿐만 아니라. 과산화 수소 레벨 아 질산염 수준 혈 청의 존재에 크게 감소 했다 반면 다른 미디어 (E) 사이 다 하지 않았다. (G) 초과 생산은 높은 건조 아르곤 가스 공급 가스; 질소, 산소, 또는 습도 아르곤의 혼합 액체에 낮은 초과 증 착을 했다. (B-G)을 표시 하는 데이터는 평균 + 2 ~ 3 실험의 SEM. 통계 분석 수행된 (C, D) 단방향 분산 분석 비교는 개별 컨트롤에 대 한 건조 또는 습 한 피드 가스 조건 전체 그룹 수단을 사용 했다 (* * p < 0.01; * * * p < 0.001). 또한, 아르곤 가스 전용 플라즈마 조건 그룹 전체와 t-검정을 사용 하 여 비교 했다 (# p < 0.001). 통계 분석 (F) 각 플라즈마 처리 및 중간 조건 없이 FCS FCS와 샘플에서의 값을 비교 하는 t-테스트를 사용 하 여 수행한 추가 (* p < 0.05; * * p < 0.01); 또한, FCS 또는 비 FCS 포함 솔루션 내에서 t-검정을 사용 하 여 각 플라즈마 처리 시간 비교 했다 (# p < 0.05; # # p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 플라즈마 치료 및 세포에 미치는 영향. (A) 세포 플라스마에 노출 되었다과 resazurin 신진 대사 활동을 평가 하기 위해 20 h 후 추가 되었습니다. (B) 활동 plasmatreated 샘플 가스 컨트롤에 비해 크게 감소 했다. 표시 된 감소 산소 및 질소의 추가 모두 건조 하 고 습 한 아르곤 가스 조건에서 독성을 리드 하는 반면 공급된 가스의 습기와 보였다. (C) 매체 propidium 요오드 화물 (PI)를 포함 하는 추가 되었습니다. (D) 개요 (녹색) 죽은 세포를 식별 하기 위해 디지털 위상 대비 (오렌지) 각 셀의 PI cytosolic 분수를 나타내는 격판덮개의 우물의 표시 됩니다. 이미징 도구는 각 세포로 덮여 잘의 시야 내에서 전체 면적의 측정 허용입니다. (F) 셀 이후에 씻어 고 항 체와 다른 세포 마커 생물 플라즈마 효과 cytometry 사용 하는 인 큐베이 팅. (G) Gating 전략 고용 및 마커 분석 수행 되었고 샘플 사이 비교. (B, E, H)를 표시 하는 데이터는 평균 + 3 개의 독립적인 실험에의 한 대표자의 SEM를 나타냅니다. 눈금 막대 = 200 µ m (D). 통계 비교 차이 (B, H) 비교, 각 가스 상태에 대 한 각 가스 컨트롤에 각 플라즈마 처리의 양방향 분석을 사용 하 여 수행 했다 (* p < 0.05; * * p < 0.01; * * * p < 0.001). 또한, 질소 및 산소 혼합의 각 상태에 대 한 값 값 건조에 대 한 아르곤 가스 플라즈마의 비교 되었다 하 고 별도로 습 한 조건 (분산;의 양방향 분석 # p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
기초 연구의 효능 및 전 임상 및 임상 연구에 플라즈마 의학 underpinning 메커니즘의 이해를 개발 하기 위한 기본적 이다. 기초 연구는 또한 치료에 대 한 새로운 응용 프로그램의 수사를 승진 시킨다. 잘 설립 플라즈마 반응 산소 및 질소 종19의 세대를 통해 그들의 생물학적 효과 중재, 거기은 여전히 필드에 세 가지 주요 과제입니다. 첫째, 어떤 종은 중요 한? 이 부분적으로 광학 진단 및 생물 학적 판독 플라즈마의 피드 가스 조성 변조 하 여 응답 될 수 있다. 20 두 번째, 어떤 효과에서 볼 수 있습니다 세포 등 생물학적 목표? 이것은, 적어도 부분적으로, 세포 배양 실험 및 다양 한 분석 실험을 사용 하 여 해결 되었습니다. 진 핵 세포에서 효과 지원 뿐만 아니라 다 면 발현 성 등 세포 주기 검거21, apoptosis22, 괴 사23, 그리고 피부 세포 자극24,,2526또는 세포의 감소 운동 성 또는 대사 활동27,,2829. 이러한 다 면 발현 성 효과에 관련 된 세 번째 도전, 종종 다른 세포 유형에서 본 다양 한 효과 설명 하기 위해 플라즈마 파생 oxidants에 세포질 응답을 결정 하는 주요 분자를 식별 하는 것입니다. 이 행 해질 수 있다 omics 기술을30,,3132 에 의해 및 최대 또는 downregulation의 siRNA (redox) 억제제, 항 산화 및 항 산화 효소, 뿐만 아니라의 변조 신호를 사용 하 여 대상 유전자는 플라즈마의 반응 종 출력입니다. 33 , 34 , 35 따라서, 유선형된 분석 결과 프로토콜 필요 반복의 많은 함께 큰 샘플 세트를 테스트 합니다.
이 연구는 상기 과제에 관해서는 플라즈마 의료 연구를 위한 생물학, 물리학에서 효율적인 실험 워크플로 예로 보여주. 플라즈마 소스 및 플라즈마 생성의 엔지니어링 측면에 대 한 내용은 전에 설명 했습니다. 36 , 37 , 38 이 분석 실험의 모든는 다양 한 장점 96well 접시에서 수행 됩니다. 예를 들어, 셀 문화 supernatants 같은 샘플 수행할 수 있습니다 쉽게 분석 결과에서 조사, 예를 들어 효소 연결 된 immunosorbent 분석을 통해 단백질 농도를 컬렉션 판. 96-웰 스에서 직접 읽을 수 있는 과학적인 장비를 사용할 수 있는 경우 이러한 접근 방식은 샘플 및 handsontime 당 비용을 최소화 하 고 동일한 샘플에서 다른 분석 실험을 다중화 하 여 결과 최대화. 멀티 채널의 사용 펫 또한 샘플 처리 속도. 원칙적으로, 여기서 설명 하는 분석 결과 또한 수행할 수 있습니다 밖으로 더 큰 잘 직경, 잘 플레이트 형식을 사용 하 여 다른 튜브와 다운스트림 분석 실험에 대 한 선박으로 추가 pipetting 단계가 필요 하지만. 그러나 384well 접시, 작은 접시 유형, 큰 피드 가스 용으로 제트기를 사용 하 여 생물 플라즈마 연구에 적합 한 형상을 표시 하지 않습니다. 특히, 그것만 단일 하지만 하지 인접 한 웰 스는 치료 하는 동안 영향을 보장할 수 없습니다.
액체 분석 종 증 착은 플라즈마에 의해 조사 필수적입니다. 전문가 분석, 다른 분석 실험의 병렬 설치는 동시에 다른 산화 제에 관해서는 plasmatreated 액체 특징 수 있습니다. 이 다중화 plasmaderived 종의 차별화 된 사진을 개발 수 있습니다. 설명 방식은 매우 민감한 과산화 수소 농도39, 조사는 종종 필요 하지만 항상 플라즈마 효과 설명 하기 위해 충분 하지. 40 , 41 , 42 생물학 관련 효과 수 있습니다 또한 부과 액체에 glutathione 분석 여기에 포함 되지 않습니다와 함께. 43 특정 아 질산염 분석 결과 좋습니다 기존 Griess 분석 10fold 분석 결과 고감도 (데이터 표시 되지 않음) 때문에. Plasmatreated 액체 hypochlorous acid DTNB 분석 결과 사용 하 여의 형성에 대 한 조사도 수 있습니다. 그러나, 이전 결과 우리의 플라즈마 소스와 그 종 형성을 나타내지 않았다. 19 , 39 , 44 플라즈마 처리 완료 된 후 종 악화가 일어난다 시간이 지남에. 아 질산염 질산염;에 반응 또한, 과산화 수소는 시간이 지남에 따라 소모 됩니다. 그러나, 이러한 프로세스는 몇 시간이 걸릴. 35 시 토 크롬 c 흡수 뿐만 아니라 몇 시간 동안 안정적입니다. 따라서, 프로세스 처리 후 첫 30 분 이내 발생 하는 경우 여기에 설명 된 오래 된 종의 농도에 변화 무시할 수 있습니다. 그러나, 주의 해야 한다 90% 과산화 수소 1 h (데이터 표시 되지 않음) 내에 최대 청소 수 있는 성분으로 특정 종류의 미디어 (예를 들어, Dulbecco의 수정이 글 매체) 조사 때 플라즈마 과산화 수소 증 착에의 한 과소로 이어지는 액체입니다.
멀티플렉스 분석 결과 세포 표면 마커 식 신진 대사 활동을 조사 하 고 셀 영역 (형태)에서 범위를 제공 됩니다. 이 분석 실험의 조합 흥미로운 결과 공개 수 있습니다. 예를 들어 우리는 이전에 표시 THP1 monocytes 대사 활동 및 셀 수 플라즈마에 노출 다음 선형 패션에서 감소 하지 않습니다. 플라즈마 처리 시간을 증가 함께 45 래더 셀 크기에서 증가 했다 고 따라서 높은 신진 대사 속도를 percell으로 이어지는 높은 미토 콘 드 리아 질량을 했다 관찰 했다. 기본적으로, 조합의 여러 리더, 현미경, cytometry 멀티플렉싱 세포질 응답 다음 플라즈마 처리에 대 한 정보. 흑색 종 세포에 우리 여기에 초점을 세포 독성 효과 calreticulin에 의해 중재 그들의 immunogenicity. 46 으로 다른 많은 질문 이미징 및 흐름 cytometry 결과 함께 신진 대사 활동을 연결 하는이 방법을 해결할 수 있습니다. 예를 들어 세포 분화 (예: macrophage 분극), 미토 콘 드 리아 멤브레인 전위, 세포 주기 분석, 세포 운동 성, 역학, 또는 genotoxicity의 분석에 대 한 micronucleus 형성 수 있습니다 또한 조사에 플라즈마 처리 셀입니다. 다 색 cytometry 동시에 다른 세포 인구에서 더 많은 응용 프로그램에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 신호 녹음 방송 요인, mRNA 정량화, 세포내 cytokines의 측정 및 평가 총 감소 thiols 단일 세포 수준에서의 단백질의 인 산화 상태에 대 한 분석이 포함 됩니다. 각 샘플에 사용할 수 있는 추가 생물학 관련 정보 현재와 미래의 플라즈마 응용 프로그램을 이해 하기 더 플라즈마 산화 환 원 효과의 그림을 개발에 에이즈.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
독일 연방 교육부 및 연구 자금 (BMBF 부여 번호 03Z22DN11 및 03Z22DN12)은 기꺼이 인정 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| accutase | BioLegend | 423201 | |
| amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
| argon gas | Air Liquide | N50 | |
| B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
| catalase | Sigma | C30 | |
| cell culture incubator | Binder | CB210 | |
| cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
| cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
| data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
| fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
| fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
| flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
| flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
| Glutamine | Sigma | G7513 | |
| imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
| laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
| mass flow controller | MKS | G-series | |
| Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
| microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
| optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
| penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
| pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
| plate reader | Tecan | M200pro | |
| propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
| resazurin | VWR | B21187.06 | |
| RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
| xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |
References
- Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11 (6), 431-438 (2003).
- Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3 (1), 23-34 (2010).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17 (1), 1-18 (2009).
- Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16 (11), 1212-1214 (2012).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82 (6), 1223-1237 (2010).
- Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4 (1), 19-28 (2016).
- Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
- Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11 (9), 0160667 (2016).
- Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18 (4), 868 (2017).
- Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19 (13), 1539-1605 (2013).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29 (1), 52-56 (2012).
- Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29 (1), 148-155 (2015).
- Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167 (2), 404-410 (2012).
- Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7 (12), 52653 (2012).
- Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
- Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8 (12), 81576 (2013).
- Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3 (2), 42-52 (2015).
- Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40 (11), 2986-2993 (2012).
- Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12 (12), 1354-1363 (2015).
- Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3 (1-2), 71-80 (2013).
- Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112 (9), 1536-1545 (2015).
- Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (3), 0120041 (2015).
- Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49 (3), 035401 (2016).
- Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3 (1), 24-31 (2015).
- Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38 (3), 748-757 (2010).
- Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26 (2), 156-162 (2017).
- Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3 (1-2), 81-95 (2013).
- Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13 (12), 1179-1188 (2016).
- Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1 (1), 55-63 (2011).
- Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
- Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25 (9), 1523-1531 (2014).
- Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47 (28), 285401 (2014).
- Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46 (43), 435203 (2013).
- Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13 (11), 1120-1127 (2016).
- Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49 (9), 631-640 (2009).
- Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48 (5), 542-549 (2014).
- Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
- Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100 (4), 791-799 (2016).
- Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6 (82), 78457-78467 (2016).
- Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3 (4), 267-278 (2013).
- Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10 (2), 029518 (2015).
- Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
- Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13 (1), 54-61 (2007).
