En høj overførselshastighed kolde fysiske plasma behandling protokol af væsker og celler er vist. Det indebærer oprettelse af forskellige feed gas kompositioner for plasma tænding, måling af plasma emissionen spektre, og den efterfølgende analyse af væsker og cellulære aktivitet efter plasma behandling.
I plasma medicin, der ioniserede gasser med temperaturer tæt på hvirveldyr systemer anvendes på celler og væv. Kolde plasmaer generere reaktive arter kendt til redox regulere biologiske processer i sundhed og sygdom. Prækliniske og kliniske beviser peger på gavnlige virkninger af plasma behandling i heling af kroniske sår i huden. Andre nye emner, såsom plasma kræftbehandling, får stadig større opmærksomhed. Plasma medicinsk forskning kræver tværfaglig ekspertise i fysik, kemi og biomedicin. Ét mål af plasma forskning er at karakterisere plasma-behandlede celler i en række specifikke applikationer. Dette omfatter for eksempel, celletal og levedygtighed, cellulære oxidation, mitokondrie-aktivitet, cytotoksicitet og tilstand af celledød, celle cyklus analyse, celle overflade markør udtryk og cytokin frigivelse. Denne undersøgelse beskriver arbejdsgange kræves til sådan forskning i plasma biomedicin og vigtigt udstyr. Det beskriver den korrekte funktion af en atmosfærisk tryk argon plasma jet, specifikt overvågning dens grundlæggende emission spectra og feed gas indstillinger for at modulere reaktive arter output. Ved hjælp af en høj præcision xyz-tabel og computersoftware, er jet svævede i millisekund-præcision over hulrum i 96-brønd plader i mikrometer-præcision for maksimal reproducerbarhed. Downstream assays til flydende analyse af redox-aktive molekyler er vist, og target-cellerne er plasma-behandlet. Specifikt, melanom cellerne analyseres i en effektiv sekvens af forskellige på hinanden følgende assays, men ved hjælp af de samme celler: måling af metaboliske aktivitet, cellen total område og overflade markør udtryk for calreticulin, et molekyle, der er vigtige for den immunogen celledød af kræftceller. Disse assays hente indholdsrige biologiske oplysninger om plasma effekter fra en enkelt plade. Helt, denne undersøgelse beskriver de væsentlige skridt og protokoller for plasma medicinsk forskning.
Reaktive arter er vigtigt redox lovgivere i sygdom, herunder abnorm sårheling1 og kræft. 2 vigtigere, disse arter er involveret i patologi samt dens terapeutiske opløsning. 3 , 4 kolde fysiske plasma er en ioniseret gas, der ekskluderer reaktive arter af mange slags. 5 siden fremkomsten af såkaldte kolde plasmaer, der opererer på krop temperatur6, kolde plasmaer kan anvendes på celler og væv uden termisk skade. Ved at demonstrere effektiviteten og sikker anvendelse af plasma-enheder i prækliniske og kliniske observationer, har tre modtaget akkreditering som medicinsk udstyr i Tyskland. 7 især vedrørende genotoksiske sikkerhed, flere undersøgelser har vist fravær af mutagene begivenheder ved hjælp af den første enhed, en atmosfærisk tryk argon plasma jet. 8 , 9 , 10 de andre to enheder er såkaldte dielektrisk barriere udledninger (Bel), som opererer via et andet princip end plasma jet. Specifikt, jets giver mulighed for en skalpel-lignende behandling af overflader og hulrum Bel plasmaer er effektiv i behandling af større, men temmelig flad væv områder. At udnytte cellulære redox signalering11, er formålet med teknikken at udnytte plasma-genereret reaktive arter for biomedicinske programmer. 12 et særligt lovende program af kliniske plasma terapi er støtten til sårheling. 13 , 14 , 15 i øvrigt plasma blev vist at have kræft effekter i dyremodeller. 16 , 17 , 18
Før validering af effekten og sikkerheden af plasma applikationer i dyremodeller, eller endog mennesker, standardiseret in vitro- forskningsbehov skal udføres med plasma-enheder. Disse eksperimenter er afgørende at udforske plasma programmer og at afgrænse mekanismer på arbejdspladsen. Desuden grundlæggende forskning er nødvendig for at forstå virkningen af sammensætningen af reaktive arter og efterfølgende biologiske virkninger. Denne undersøgelse viser, hvordan plasma kan integreres i biomedicinsk forskning til bedre at forstå og kontrollere dens virkninger på celler. Det beskriver tuning af feed gas sammensætning, overvågning af reaktive arter output, anvendelser af plasma til væsker, celler og væv og de deraf følgende kemiske og biologiske resultater. Desuden angivet eksempler som instruere på standardisering af plasma behandling og downstream biologiske assays, med en vægt på plasma medicinsk forskning udført i 96-brønd plader. Denne tilgang har klare fordele: Jeg) minimering af antallet af celler nødvendige pr. betingelse, reagens omkostninger og hands-on tid pr. prøve; II) justering af større nøjagtighed af resultater som dobbelt eller tredobbelt behandlinger kan sættes op med lethed; og iii) lettelse af sømløse downstream boltpistoler i 96-brønds format Pladelæser, billedbehandling og flow flowcytometri eksperimenter.
Grundforskning er af afgørende betydning for at udvikle en forståelse af effekten af og mekanismer bag plasma medicin i prækliniske og kliniske forskning. Grundlæggende forskning fremmer også undersøgelse af nye ansøgninger for behandlinger. Mens det er godt etableret, at plasmaer mægle deres biologiske virkninger via generation af reaktive oxygen og nitrogen arter19, er der stadig tre vigtigste udfordringer til feltet. Først, hvilke arter er vigtige? Dette kan delvist besvaret af modulerende feed gas sammensætning af plasma-tv med optisk diagnostik og biologiske udlæsninger. 20 for det andet, hvilke virkninger kan ses i biologiske mål såsom celler? Dette behandles i det mindste delvis, ved hjælp af celle kultur eksperimenter og en række af assays. Eukaryote celler, virkninger er pleiotrope herunder celle cyklus anholdelse21, apoptose22, nekrose23, og hud celle stimulation24,25,26, såvel som en støtte eller nedsættelse af celle motilitet eller metaboliske aktivitet27,28,29. Den tredje udfordring, vedrører disse pleiotrope virkninger, er at identificere centrale molekyler, der bestemmer den cellulære reaktion på plasmaafledte oxidanter til at forklare forskellige virkninger ses ofte i forskellige celletyper. Dette kan gøres ved omik teknikker30,31,32 og/eller op eller downregulation af mål gener ved hjælp af siRNA (redox) signalering hæmmere, antioxidanter og antioxidant enzymer samt modulering af den plasma’s reaktive arter output. 33 , 34 , 35 derfor, strømlinet assay protokoller for at teste større stikprøve sæt med stort antal gentagelser.
Denne undersøgelse er et eksempel på en effektiv eksperimentelle arbejdsgang, fra fysik til biologi, for plasma medicinsk forskning med hensyn til de førnævnte udfordringer. Detaljer om de tekniske aspekter af plasma kilde og plasma generation har været beskrevet før. 36 , 37 , 38 alle disse analyser er udført i 96well plader, som har en række fordele. For eksempel, kan prøver såsom celle kultur analysere nemt transporteres fra assay samling plader at efterforske, for eksempel, protein koncentrationer via enzym-forbundet-immunosorbent-assay. Hvis videnskabelige udstyr i stand til at læse direkte fra 96-brønde er tilgængelige, en sådan fremgangsmåde minimerer omkostningerne pr. sample og handsontime og maksimerer resultater af multiplexing forskellige assays fra samme prøve. Brugen af multikanal-din pipetter desuden hastigheder op prøve håndtering. I princippet kan analysen beskrives her også foretages ved hjælp af godt plade formater med større godt diametre, selv om dette ville kræve yderligere pipettering trin i andre rør og fartøjer til downstream assays. Mindre plade typer såsom 384well plader, dog fremlægge ikke geometri egnet til biomedicinsk plasma forskning ved hjælp af jetfly med store feed gas strømme. Specifikt, kan ikke det garanteres, at kun enkelt men ikke tilstødende brønde er berørt under en behandling.
Flydende analyse er afgørende for at undersøge arter deposition af plasma. I ekspertanalyser, kan en parallel installation af forskellige assays karakterisere plasmatreated væsker med hensyn til forskellige oxidanter på samme tid. Denne multiplexing giver mulighed for at udvikle et differentieret billede af plasmaderived arter. Den beskrevne fremgangsmåde er meget følsom over for undersøge hydrogenperoxid koncentrationer39, som er ofte nødvendig, men ikke altid tilstrækkelig til at forklare plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologisk relevante virkninger kan også vurderes i væsker med en glutathion assay ikke inkluderet her. 43 specifikke nitrit assay anbefales kraftigt over konventionelle Griess-Assays på grund af 10fold højere assay følsomhed (data ikke vist). Plasmatreated væsker kan også undersøges for dannelsen af hypochlorsyrling ved hjælp af DTNB-analysen. Endnu, tidligere resultater ikke tydede dannelsen af denne art med vores plasma kilde. 19 , 39 , 44 efter plasma behandling er afsluttet, arter forringelse finder sted over tid. Nitrit reagerer på nitrat; også, peroxid er forbrugt over tid. Men disse processer tage flere timer. 35 cytokrom c absorption er stabil over flere timer så godt. Derfor, hvis processer forekomme inden for de første 30 min. efter behandling, variation i koncentrationerne af langlivede arter beskrevet her er ubetydelig. Dog skal udvises forsigtighed ved at undersøge visse former for medier (f.eks.Dulbeccos modificerede Eagle Medium) som ingredienser kan skyllepumpetab op til 90% peroxid inden for 1 h (data ikke vist) fører til en undervurdering af plasma peroxid deposition i væsker.
En multiplex assay er præsenteret som spænder fra undersøger metaboliske aktivitet over celle område (morfologi) til celle overflade markør udtryk. En kombination af disse assays kan afsløre interessante resultater. For eksempel, har vi tidligere vist i THP1 monocytter, metaboliske aktivitet og celle tæller ikke falde i et lineært efter udsættelse for plasma. 45 snarere, med stigende plasma indvirkningstid, celler blev observeret, blev øget i størrelse og havde en højere mitokondrie masse, hvilket fører til højere stofskifte på grundlag af percell. Det væsentlige, kombinationen af multiplate læser, mikroskopi og flowcytometri multiplex oplysninger på cellulære svar efter plasma behandling. I melanom celler fokuserer vi her på cytotoksiske virkninger og deres immunogenicitet medieret af calreticulin. 46 i princippet, mange andre spørgsmål kan løses med denne fremgangsmåde forbinder metaboliske aktivitet med billedbehandling og flow flowcytometri resultater. For eksempel, kan Celledifferentiering (fx makrofag polarisering), mitokondrielle membran potentiale, celle cyklus analyse, celle motilitet, biomekanik eller mikronucleusundersøgelse dannelse for analyse af genotoksicitet også blive undersøgt i plasma-behandlede celler. Flerfarvet flowcytometri giver mulighed for endnu flere ansøgninger i forskellige cellepopulationer på samme tid. Dette omfatter for eksempel, analyse af fosforylering status signalering proteiner som transskriptionsfaktorer, mRNA kvantificering, måling af intracellulære cytokiner, og/eller vurderingen af samlede reducerede dithioler på en enkelt celle niveau. Yderligere biologisk relevante oplysninger, der er tilgængelige for hver prøve aids i videreudvikling af billedet af plasma redox effekter til bedre at forstå aktuelle og fremtidige plasma applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra de tyske føderale ministerium for uddannelse og forskning (BMBF tildele numre 03Z22DN11 og 03Z22DN12) er taknemmeligt erkendt.
accutase | BioLegend | 423201 | |
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
argon gas | Air Liquide | N50 | |
B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
catalase | Sigma | C30 | |
cell culture incubator | Binder | CB210 | |
cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
Glutamine | Sigma | G7513 | |
imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
mass flow controller | MKS | G-series | |
Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
plate reader | Tecan | M200pro | |
propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
resazurin | VWR | B21187.06 | |
RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |