Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Recherche fondamentale en médecine Plasma - une approche de débit des liquides aux cellules

doi: 10.3791/56331 Published: November 17, 2017

Summary

Un protocole de traitement plasma physique froid haut débit des liquides et des cellules s’affiche. Il consiste à mettre en place des compositions de différents gaz d’alimentation pour l’allumage de plasma, mesurant les spectres d’émission de plasma et l’analyse subséquente des liquides et l’activité cellulaire après traitement au plasma.

Abstract

En médecine de plasma, gaz ionisés dont la température proche de celle des systèmes de vertébrés sont appliqués aux cellules et tissus. Les plasmas froids génèrent des espèces réactives signales par oxydoréduction régulent les processus biologiques dans la santé et la maladie. Les données précliniques et cliniques pointe vers les effets bénéfiques du traitement au plasma dans la guérison de l’ulcère chronique de la peau. Autres sujets émergents, comme le traitement du cancer plasma, suscitent un intérêt croissant. Recherche médicale plasma a besoin de compétences interdisciplinaires en physique, chimie et la biomédecine. Un des buts de recherche plasma sont de caractériser les cellules traitées au plasma dans une variété d’applications spécifiques. Cela inclut, par exemple, nombre de cellules et viabilité, oxydation cellulaire, l’activité mitochondriale, cytotoxicité et le mode de la mort cellulaire, analyse du cycle cellulaire, cellule expression du marqueur de surface et la libération de cytokines. Cette étude décrit l’équipement essentiel et flux de travail nécessaires à ces recherches en biomédecine de plasma. Il décrit le fonctionnement d’un jet plasma argon de la pression atmosphérique, plus précisément suivi sa base des spectres d’émission et paramètres de gaz pour moduler la production d’espèces réactives d’alimentation. En utilisant une table xyz de haute précision et les logiciels, le jet est survolé en précision à la milliseconde les cavités des plaques de 96 puits en micromètre-précision de reproductibilité maximale. Dosages en aval pour analyse de liquide des actifs en oxydoréduction molécules apparaissent, et les cellules cibles sont imprégnées par le plasma. Plus précisément, les cellules du mélanome sont analysés dans une séquence efficace des différentes épreuves consécutives, mais en utilisant les mêmes cellules : mesure de l’activité métabolique, superficie totale de cellules et l’expression de marqueur de surface de la calréticuline, une molécule importante pour la immunogènes de l’apoptose des cellules cancéreuses. Ces tests de récupérer des informations biologiques riches en contenu sur effets plasma d’une seule plaque. Au total, cette étude décrit les étapes essentielles et les protocoles de recherche médicale de plasma.

Introduction

Espèces réactives sont des régulateurs de l’oxydo-réduction importante dans les maladies, y compris de cicatrisation anormale1 et le cancer. 2 ce qui est important, ces espèces sont impliqués dans la pathologie ainsi que sa résolution thérapeutique. 3 , 4 froid physique plasma est un gaz ionisé qui expulse des espèces réactives de toutes sortes. 5 depuis l’avènement de ce que l'on appelle plasmas froids qui fonctionnent à la température de corps6, plasmas froids peuvent être appliquées aux cellules et tissus sans dommage thermique. En démontrant l’efficacité et l’application sûre des dispositifs de plasma dans les observations précliniques et cliniques, trois ont reçu l’accréditation comme des dispositifs médicaux en Allemagne. 7 en particulier en ce qui concerne la sécurité génotoxique, plusieurs études ont montré l’absence d’événements mutagènes en utilisant le premier appareil, un jet de plasma d’argon la pression atmosphérique. 8 , 9 , 10 les deux autres appareils sont des rejets de ce qu’on appelle barrière diélectrique (DBD), qui opèrent par l’intermédiaire de jet plasma un principe différent. Plus précisément, jets permettent pour bistouri comme traitement des surfaces et des cavités alors que DBD plasmas sont efficaces dans le traitement des zones de tissu plus grand mais plutôt plat. Exploitant d’oxydoréduction cellulaire signalisation11, le but de la technique est d’utiliser des espèces réactives plasma généré pour des applications biomédicales. 12 une demande particulièrement prometteur de la thérapie clinique plasma est le support de la cicatrisation des plaies. 13 , 14 , 15 en outre, plasma s’est avéré avoir des effets anticancéreux dans les modèles animaux. 16 , 17 , 18

Avant de valider l’efficacité et la sécurité des applications de plasma dans des modèles animaux ou même des humains, standardisé en vitro besoins de recherche à effectuer avec les dispositifs de plasma. Ces expériences sont essentiels à la découverte des applications plasma et pour délimiter les mécanismes à le œuvre. En outre, la recherche fondamentale est nécessaire pour comprendre l’impact de la composition des espèces réactives et effets biologiques ultérieures. Cette étude démontre comment le plasma peut être intégré à la recherche biomédicale pour mieux comprendre et contrôler ses effets sur les cellules. Il décrit l’accordage de la composition des gaz d’alimentation, suivi de la production d’espèces réactives, les applications du plasma à liquides, cellules, tissus et les résultats chimiques et biologiques qui en résulte. En outre, les exemples sont fournis qui instruire sur la normalisation du traitement au plasma et des dosages biologiques en aval, avec un accent mis sur la recherche médicale plasma faite en plaques de 96 puits. Cette approche a des avantages distincts : i) minimisation du nombre de cellules nécessaires par l’État, les coûts de réactif et pratique temps par échantillon ; II) indemnité d’une plus grande exactitude des résultats que les traitements en doubles ou en triple peuvent être mis en place avec facilité ; et iii) facilitation de dosage en aval sans faille dans le lecteur de plaques de 96 puits format, d’images et des expériences de cytométrie en flux.

Protocol

1. plasma espèces surveillance et installation de traitement

  1. Surveillance des espèces de plasma
    1. Utiliser un jet de plasma de la pression atmosphérique et un maximum de deux litres par minute que se nourrissent des débits de gaz standard.
    2. Perpendiculaire à l’axe du panache, positionner le jet en face d’un spectrophotomètre d’émission optique et photoémission record et la longueur d’onde (200-1 000 nm) à l’aide dédiée logiciel.
    3. Mélangez 0,5 % d’azote ou d’oxygène au gaz d’alimentation soit sec ou humidifié (5 %).
    4. Répétez spectroscopie optique d’émission pour chaque condition de gaz.
    5. Analyser avec le logiciel approprié pour l’affichage graphique des données.
  2. Installation de traitement plasma
    1. Difficulté le jet vers une table xyz pilotés par ordinateur.
    2. Identifier la position des puits et générer un script ordinateur pour déplacer le jet s’est joint à la table, avec le temps de traitement approprié, au-dessus du centre de chaque puits.
    3. Ajouter 104 de n’importe quel type de cellules de mammifères adhérentes dans 100 µL de milieu de culture cellulaire complet (RPMI1640 avec 10 % FCS, glutamine 2 % et 1 % la pénicilline/streptomycine) dans plusieurs puits sous une hotte à flux laminaire.
    4. Permettre l’adhésion cellulaire se produisent pendant une nuit à 37 ° C en atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone.
    5. Traiter les cellules avec du plasma pour 20 s à différentes hauteurs (axe z) intervalles de 250 µm.
    6. Ajouter 25 µL de l’iodure de propidium dans un milieu de culture cellulaire dans chaque puits.
    7. Les cellules au microscope pour déterminer la hauteur spécifique qui n’induit pas de nécrose cellulaire due à l’alimentation de gaz en poussant le milieu de culture sur le dessus des cellules à côté de l’image.
      Remarque : Pour des temps de traitement plus longs, identifier évaporation liquide à cette hauteur particulière, dans le plasma et hors mode, en pesant la plaque avant et après traitement au plasma pour déterminer la quantité de microlitres de doubledistilled l’eau nécessaire pour rétablir la homéostasie osmotique dans les puits traitées.
    8. Préparer un protocole final pour la table xyz avec des temps de traitement respectifs (ici : 20 s, 40 s, de 60 s plasma et de contrôle de gaz s 60) et bien des positions, et avoir prêts pipettes multicanaux et réservoirs destinés à la manipulation de liquides des plaques de 96 puits lors d’essais ultérieurs.

2. analyse des principaux éléments réactifs en liquides traités Plasma

  1. Analyse du Plasma traité de peroxyde d’hydrogène
    1. Traiter 100 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec du plasma en trois exemplaires, plaques à 96 puits à fond plat.
    2. Préparer un mélange maître en chargeant 100 µL de PBS avec 10 U de la peroxydase de raifort et 5 µM de réactif de détection de peroxyde d’hydrogène (suffisant pour un bien, évoluer en conséquence).
    3. Ajouter 95 µL du mélange maître dans chaque puits.
      Remarque : L’étape précédente doit être effectuée sous un banc propre ou dans une pièce séparée de celle de la source de plasma comme l’ozone de l’air ambiant peut diminuer la sensibilité du test.
    4. Dans une assiette, préparer une série de double dilution d’eau oxygénée dans du PBS avec une concentration supérieure de 100 µM dans 100 µL de PBS.
    5. Ajouter 5 µL d’échantillons ou de normes de peroxyde d’hydrogène aux puits contenant le réactif de détection.
    6. Inclure les puits contenant le réactif de détection que pour la soustraction du fond après la lecture.
    7. Incuber la plaque dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.
    8. Placer la plaque dans le lecteur de microplaque mesure de fluorescence à λex 535 nm et λem 590 nm.
      Remarque : Si des concentrations élevées de peroxyde sont attendues dans les échantillons, la dilution de l’échantillon doit être augmentée ou lectures doivent être faits avec des temps d’incubation plus courts afin d’éviter la saturation du dosage.
    9. Soustraire des valeurs vides de tous les échantillons, calculer la courbe d’étalonnage peroxyde et quantifier les concentrations de peroxyde échantillon inconnu de cette courbe de référence.
  2. Analyse du Plasma traité Nitrite
    1. Traiter 100 µL de PBS avec le plasma en trois exemplaires, des plaques de 96well flatbottom.
    2. Préparer un mélange maître de solution de détection des nitrites en ajoutant 1 µL de réactif de quantification à 99 µL de doubledistilled eau (suffisant pour un bien, évoluer en conséquence).
    3. Ajouter 100 µL / puits d’une plaque de 96well clair, flatbottom. S’intensifier si nécessaire pour le nombre de puits.
    4. Préparer une série de dilutions de normes de nitrite dans l’eau doubledistilled.
    5. Ajouter 10 µL de normes ou d’échantillons dans le master mix en plaques 96well.
    6. Incuber la plaque dans l’obscurité pendant 10 min à température ambiante.
    7. Ajouter 5 µL de solution de nitrite de quantification développeur dans chaque puits.
    8. Lire la fluorescence dans un lecteur de microplaques à λex 365 nm et λem 450 nm.
    9. Soustraire des valeurs vides de tous les échantillons, calculer la courbe standard de nitrite et quantifier les concentrations de nitrite échantillon inconnu de cette courbe de référence.
  3. Analyse du Plasma traité superoxyde
    1. Faire un mélange maître du cytochrome oxydé (1 mg/mL) et de la catalase (20 µg/mL) dans du PBS.
    2. Ajouter 100 µL du mélange maître sur les puits d’une plaque à 96 puits claire, fond plat.
    3. Traiter les master mix avec du plasma en triple exemplaire par la condition de traitement.
    4. Lire l’absorbance à 550 nm en utilisant un lecteur de microplaques ; le graphique de ces données.
    5. Calculer la quantité de radicaux superoxyde généré à l’aide du coefficient d’extinction molaire du cytochrome C et de la longueur du trajet optique de liquide dans un puits.

3. la réaction biologique des cellules exposées au Plasma

  1. Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : activité métabolique
    1. Utiliser une hotte à flux laminaire pour toutes les procédures suivantes.
    2. Cellules de4 graines 10 (mélanomes murins B16) en milieu de culture cellulaire 100 µL entièrement complétée par puits dans les plaques de 96 puits à fond plat.
    3. Permettre à adhésion cellulaire pendant la nuit à 37 ° C dans l’atmosphère humidifiée de l’incubateur avec 5 % de dioxyde de carbone.
    4. À l’aide de la table xyz, traiter des puits à plasma ou gaz seulement selon un schéma prédéfini et ajoute les cellules dans l’incubateur pendant 20 h.
      Remarque : Si vous le souhaitez, enlever les surnageants après 20 h pour analyser les produits extracellulaires ; Ajouter 100 µL de milieu frais par la suite.
    5. Dans chaque puits, ajouter 25 µL de milieu de culture cellulaire contenant 500 µM résazurine (concentration finale 100 µM) ; préparer trois puits contenant résazurine seul dans le milieu de culture cellulaire sans cellules pour la soustraction du fond.
    6. Incuber pendant 3 heures dans l’incubateur.
    7. Lecture de fluorescence à λex 535 nm et λem 590 nm dans un lecteur de microplaques.
    8. Soustraire la fluorescence de fond de tous les échantillons et de normaliser les données aux valeurs témoins.
  2. Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : analyse d’Image
    1. Utilisez la plaque bien de 3.1.7 et jeter le surnageant.
    2. Ajouter 100 µL de milieu de culture de cellules fraîches contenant 1 iodure de propidium µg/mL.
    3. Mettre la plaque sous un microscope avec une platine motorisée à l’image de chaque puits.
      Remarque : L’imagerie détails dépendent de la question expérimentale ; ici, un objectif 20 X a été utilisé dans un appareil d’imagerie de haute teneur pour lire 3 x 3 champs de vision dans chaque puits dans un champ lumineux canal, canal de contraste de phase numérique et canal (iodure de propidium) de fluorescence, utilisant des émissions et la lumière d’excitation appropriée filtres.
    4. Utilisation logiciel d’analyse quantitative d’image pour déterminer la superficie totale cytosolique dans les images de contraste de phase numérique de tous les champs de vision imagée dans chaque puits.
      NOTE : Analyser des paramètres supplémentaires si vous le souhaitez, par exemple, le nombre de cellules viables et/ou morts ou l’activité mitochondriale à l’aide de taches dédiés. Si vous utilisez les autres taches que celles décrites dans cet ouvrage, veillez à ce que les taches utilisés pour la microscopie de fluorescence ne se chevauchent pas spectralement avec les fluorochromes utilisés dans des expériences de cytométrie en flux ultérieurs.
    5. Graphique des données et si vous le souhaitez, tester pour la corrélation avec les valeurs obtenues pour l’activité métabolique.
  3. Lecture multidimensionnelle des cellules traitées à Plasma : cytométrie en flux
    1. Pour cette analyse, utilisez la plaque bien de l’étape 3.2.5.
    2. Jeter le surnageant et laver deux fois avec 200 µL de PBS contenant du calcium et du magnésium (0,9 mM et 0,5 mM, respectivement).
      NOTE : Difficulté et/ou permeabilize des cellules à ce stade encore biologiques lectures non couverts dans cette contribution, tels que la coloration des analyse intracellulaire de l’antigène ou le cycle cellulaire.
    3. Dans chaque puits, ajouter 50 µL de PBS avec le calcium et le magnésium contenant 50 anticorps monoclonaux de anti-souris calréticuline ng/mL.
    4. Incuber pendant 15 minutes dans l’incubateur.
    5. Laver deux fois avec 200 µL d’entièrement complétée de milieu de culture cellulaire et jeter le liquide dans la plaque.
    6. Ajouter 100 µL de solution de détachement cellulaire dans chaque puits et incuber pendant 20 min dans l’incubateur.
    7. Utiliser un autre ensemble de non-colorées B16 cellules en suspension pour le protocole d’acquisition de cytométrie en flux, gating stratégie et les gains et les tensions de photodétecteurs.
    8. Charger la plaque dans un cytomètre en flux équipé d’un échantillonneur automatique pour plaques 96 puits.
    9. Acquérir un minimum de 1 000 cellules dans vers l’avant et de la population de nuages de points de côté généralement associés à des cellules viables.
    10. Utiliser un logiciel dédié pour l’analyse de la cytométrie en flux, fichiers .fcs à la porte de la population visée et déterminer l’intensité de fluorescence moyenne de la calréticuline.
    11. Graphique des données et si vous le souhaitez, tester pour la corrélation avec les valeurs obtenues pour les dépôts d’oxydant, imagerie et/ou l’activité métabolique.

Representative Results

Dans cette étude, un flux de travail simplifié a été décrite pour la recherche médicale sur les effets du plasma. L’approche multidisciplinaire utilisée ici analyse le profil de base d’émission optique du jet de plasma, les principaux composants réactifs dans le liquide, et les réponses biologiques des cellules traitement avec du plasma (Figure 1).

Pour effectuer ce flux de travail, un certain nombre de composantes est nécessaires pour configurer correctement la source de plasma (Figure 2). Les différents gaz (ici principalement argon, oxygène et azote) ont été fournis aux et contrôlé par plusieurs contrôleurs de débit massique. Un panneau central permettait d’ajuster numériquement les contrôleurs de débit massique pour les flux de gaz d’alimentation prédéterminé. Pour obtenir des compositions spécifiques gaz d’alimentation, les gaz étaient physiquement mixtes utilisant un panel de vannes qui combinait des gaz provenant de plusieurs contrôleurs de débit massique (Figure 2A). La source de plasma a été allumée, et l’effluent du plasma a été mis en place en face d’un USB-spectrophotomètre (Figure 2B) avec une portée optique de 200 nm à 1 000 nm. Pour le traitement des liquides et des cellules, un workflow efficace a été décrite à l’aide de plaques de 96 puits. Cupules multiples ont été maintenus en place à l’aide d’un cadre en plastique qui a été fixé sur la plaque de base avec insertions mis en correspondance avec ses trous imprimés (Figure 2C). L’installation entière fut placée sous une hotte à flux laminaire (Figure 2D). Cette configuration a inclus un xyz-tableau sur lequel la pièce à main du jet de plasma a été installée. Les éléments de commande du moteur peuvent être situées en dehors de l’audience, si ce dernier a câble suffisamment grand ports d’et vers la table xyz. Ce qui est important, le tableau a été commandé par ordinateur et peut être programmé pour survoler le jet au centre de chaque puits avec une précision micrométrique pour la durée désirée. En outre, la position de départ (comme dans notre configuration, puits A1) a été choisie librement (Figure 2E). Avec le support de plaque en plastique, ceci permettait à un traitement plasma reproductible avec les variations quotidiennes liées uniquement à la configuration des expériences biologiques et de liquides.

Spectrométrie d’émission optique (OES) a été utilisé pour suivre les pics distincts liés aux composants réactifs plasma dans des conditions de différents gaz d’alimentation (Figure 3A). Par exemple, le second système positif de l’azote avec des pics de 330 nm à 380 nm représenté azote réactif espèces et le pic à 309 nm représenté les radicaux hydroxyles (flèche dans la Figure 3A). Comparativement au gaz argon seul, la présence des espèces azotées a augmenté avec un mélange d’azote dans le gaz d’alimentation, tandis que l’ajout d’oxygène ou l’humidité diminuée ou réduit, respectivement. En revanche, la présence de radicaux hydroxyle est diminuée avec l’oxygène ou d’azote mais augmente de façon marquée si humidifié argon a été utilisé comme gaz d’alimentation. Traitement au plasma de liquides, l’évaporation causée par le gaz argon et plasma d’argon a été déterminée premier (Figure 3B). Ce qui est important, ces deux conditions n’ont pas donné des résultats similaires parce que plasma exerce aussi des effets sur la température. Conformément aux résultats des radicaux hydroxyles OES, dépôts de peroxyde d’hydrogène a significativement diminuent avec un mélange d’oxygène ou d’azote mais augmentent avec gaz humidifié d’alimentation (Figure 3-C). En outre, l’ajout d’azote dans le gaz d’alimentation conduit à des concentrations de nitrites significativement plus élevées par rapport aux liquides d’imprégnées par le plasma argon (Figure 3D). Ce flux de travail peut-être également être employée pour étudier l’impact du plasma sur les liquides avec des compositions différentes. Par exemple, les concentrations de peroxyde d’hydrogène semblent être indépendante de la présence de sérum de veau foetal dans PBS et RPMI1640 milieu de culture cellulaire (Figure 3E). Dans les mêmes échantillons, la présence de sérum diminue les concentrations de nitrite dans PBS et cellule de milieu de culture par rapport à leurs homologues contenant non-sérum (Figure 3-F). La plupart de superoxyde a été produit dans les conditions du gaz argon sec avec des adjuvants d’oxygène ou d’azote trempe significativement la production de superoxydes, à l’exception du plasma d’argon-oxygène humidifié (Figure 3G).

Pour traitement plasma des cellules dans les cupules multiples, la plaque contenant des cellules ensemencées la veille a été retirée de l’incubateur et ajoute le support en plastique. Un modèle de traitement programmé a été appliqué et la plaque a été replacée dans l’incubateur pendant 20 h Note qu’après l’incubation, les surnageants de culture cellulaire pourraient avoir été compilé en une plaque à 96 puits vide et conservé à - évaporation est compensée 80 ° C pour l’évaluation de protéines d’intérêt. Ensuite, résazurine a été ajouté aux cellules de chaque puits. Chiffre d’affaires de résazurine non fluorescent à résorufine fluorescent a été seulement facilitée par des enzymes actives générateur de NADPH et était corrélée à l’activité métabolique général (Figure 4A). Intensités de fluorescence ressemblaient à la perception visuelle de la plaque et a indiqué les effets cytotoxiques de traitement plasma prolongée (Figure 4B). Conditions de gaz humidifié étaient plus nocifs que les conditions de gaz sec. Les mêmes cellules de la plaque ont été utilisés pour des analyses plus loin en aval. Au microscope, les cellules dans la plaque sont étudiés (Figure 4C). Plusieurs puits de la plaque à l’aide de logiciels d’imagerie, ont été examinés pour comparaison qualitative (Figure 4D). Logiciel permis la quantification de la surface totale couverte par les cellules dans les champs de vue acquis dans chaque puits et les données obtenues ont été normalisées à leurs témoins respectifs (Figure 4E). Une diminution de la superficie totale de cellules a été vu dans les échantillons de traitement plasma, surtout avec les conditions du gaz d’alimentation humidifié. Après l’imagerie, les cellules ont été lavés, colorées avec les anticorps anti-souris calréticuline, détachés et analysés par cytométrie en flux (Figure 4F). Moyenne de fluorescence des intensités de la calréticuline coloration de cellules viables (Figure 4G) ont été calculées et comparées entre les échantillons (Figure 4H). Traitement au plasma induit une augmentation de la calréticuline sur surface de cellules de mélanome murine, qui correspondait à la durée du traitement plasma appliquée aux conditions de gaz d’alimentation sèche. Pour humidifier les conditions de gaz d’alimentation, 20 s et 40 s de traitement induit une plus forte exposition de la calréticuline par rapport à la plus meurtrière de 60 s de temps de traitement. Ceci suggère qu’il y avait un règlement non linéaires d’exposition de la calréticuline en ce qui concerne la quantité d’antioxydants introduit dans les cellules.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail de la recherche médicale de plasma de la physique à la biologie. La production d’espèces réactives du jet de plasma argon la pression atmosphérique est à l’écoute en modulant le gaz d’alimentation. Certaines molécules en phase gazeuse plasma sont surveillées à l’aide de la spectroscopie. Le plasma est utilisé pour traiter les liquides et enquêter sur les dépôts de l’oxydant. Les cellules cultivées en microplaques sont imprégnées par le plasma, et lectures biologiques sont effectués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Installation du banc plasma recherche. (A) le gaz différents en acier inoxydable tuyaux est enfoncés dans plusieurs contrôleurs de débit massique qui sont contrôlées par un panneau central. La composition du gaz d’alimentation individuel est mélangée par la suite en utilisant un panel de vannes. (B) certains composants réactifs du plasma peuvent être surveillés à l’aide de la spectroscopie d’émission optique pour étudier les différences entre les diverses compositions de gaz d’alimentation. (C) pour la recherche de haut débit plasmatique, Microplaque 96 puits est utilisés. Afin d’assurer une constante, point de départ pour traitement plasma programmables et automatisés, la plaque est ajoutée à un cadre garantissant la même position absolue des plaques de jour en jour. (D) le jet de plasma est fixé à un contrôlé par ordinateur xyz-table située sous une hotte à flux laminaire. Tous les 96 emplacements exacts et le temps d’arrêt du plasma sur chaque bien est écrit dans un fichier de programme pour guider le mouvement de la source de plasma. Le boitier de l’appareil de jet de plasma ainsi que les commandes du moteur sont situés à proximité. (E) automatisé de traitement plasma d’une plaque de 96 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Jet de plasma et le liquide analyse. (A) spectroscopie d’émission optique des conditions des différents gaz d’alimentation est montrée. Le second système positif de l’azote (330 nm à 380 nm) a été augmentée avec mélange d’azote, absent en cas de mélange de l’oxygène et une réduction marquée avec argon humidifié (panneaux de gauche). Le pic de radicaux hydroxyles à 309 nm (flèche) a diminué dans des conditions d’azote et d’oxygène, mais augmente de façon marquée avec argon humidifié par rapport au gaz argon seul. Gaz (B) l’exposition des liquides entraîne l’évaporation. La quantité d’évaporation par puits dans une plaque de 96well par traitement avec du plasma et argon gaz seul a été déterminée par pesée la plaque avant et après traitement à l’aide d’une échelle fine. Évaporation dans des échantillons de plasmatreated a été plus élevée comparée à celle dans les échantillons de gastreated d’argon. (C) la génération de peroxyde d’hydrogène dans les liquides plasmatreated dans une certaine mesure en corrélation avec la 309 nm crête de radicaux hydroxyles (a). Humidifié plasma d’argon (5 %) augmentation des concentrations de peroxyde d’environ 4fold. (D) Nitrite était élevée lorsque l’azote a été ajouté à un gaz, et cet effet a été renforcé avec le plasma d’argon humidifié. L’addition d’oxygène diminue de génération de nitrite, mais pas de façon significative. (E, F) Les concentrations de hydrogène peroxyde et le nitrite est montré dans différents types de liquides, à savoir RPMI1640 milieu de culture cellulaire avec (R10F) et sans (R0F) ainsi que de PBS avec et sans sérum de veau foetal (FCS). Niveaux de peroxyde ne différaient pas entre les différents médias (E) alors que les nitrites ont considérablement diminué en présence de sérum. (G) la production de superoxyde était la plus élevée pour les gaz argon sec alimentation gaz ; mélange d’azote, d’oxygène ou argon humidifié a donné plus faible dépôt de superoxyde dans le liquide. Données présentées (G-B) sont la moyenne + SEM de deux ou trois expériences. L’analyse statistique a été réalisée (C, D) à l’aide d’analyse de variance en comparant les moyens de tout le groupe de conditions de gaz d’alimentation sèche ou humide contre le contrôle respectif (** p < 0,01 ; *** p < 0,001). En outre, des conditions uniquement gaz plasma argon ont été comparées en utilisant la moyenne de l’ensemble du groupe et le t-test (### p < 0,001). Outre analyse statistique (F) a été réalisée à l’aide de tests t en comparant les valeurs de chaque traitement au plasma et condition moyenne dans les échantillons avec FCS et sans FCS (* p < 0,05 ; ** p < 0,01) ; en outre, FCS ou solutions contenant non FCS ont été comparées dans chaque délai de traitement plasma en utilisant le test t (# p < 0,05 ; ## p < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Traitement au plasma et son impact sur les cellules. (A) les cellules ont été exposées au plasma et résazurine a été ajouté après 20 h pour évaluer l’activité métabolique. (B) l’activité a été significativement réduite dans les échantillons de plasmatreated par rapport aux commandes de gaz. Une diminution marquée a été vu avec humidification d’un gaz alors que l’addition d’oxygène ou d’azote mène à toxicité dans les deux conditions de gaz argon sèches et humides. (C) un milieu contenant de l’iodure de propidium (PI) a été ajouté. (D), un aperçu s’affiche des puits de la plaque avec contraste de phase numérique (orange) qui représente la fraction cytosolique de chaque cellule et PI (vert) pour identifier les cellules mortes. Outils d’imagerie a permis la quantification de la surface totale dans le champ de vision de chaque bien recouverte de cellules. (F) les cellules ont été ensuite lavés et incubées avec l’anticorps ou d’autres marqueurs de cellules pour caractériser les effets biologiques de plasma à l’aide de cytométrie en flux. (G) Gating stratégies ont été utilisées et analyse ponctuelle a été effectué et comparée entre les échantillons. Données présentées (B, E, H) indiquent la moyenne + SEM d’un représentant de trois expériences indépendantes. Echelle = 200 µm (D). Comparaison statistique a été réalisée en utilisant l’analyse bidirectionnelle des variances (B, H), en comparant, pour chaque condition de gaz, chaque traitement plasma son contrôle gaz respectifs (* p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001). En outre, les valeurs pour chaque condition d’adjuvants d’azote ou d’oxygène ont été comparées aux valeurs de plasma de gaz argon pour les produits secs et humides séparément les conditions (analyse bidirectionnelle des variances ; ### p < 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

La recherche fondamentale est essentielle pour développer une compréhension de l’efficacité d’et les mécanismes qui sous-tendent la médecine plasma en recherche clinique et préclinique. Recherche fondamentale favorise également l’étude de nouvelles applications pour les traitements. Alors qu’il est bien établi que les plasmas véhiculent leurs effets biologiques via une génération de réactives de l’oxygène et azote espèces19, il y a toujours trois défis principaux dans le domaine. Tout d’abord, quelles espèces sont importantes ? Cela peut être partiellement répondu en modulant la composition du gaz d’alimentation des plasmas avec diagnostics optiques et afficheurs biologiques. 20 Deuxièmement, quels sont les effets sont visibles dans des cibles biologiques telles que les cellules ? C’est, au moins en partie, adressée à l’aide d’expériences de culture cellulaire et un certain nombre d’épreuves. Dans les cellules eucaryotes, les effets sont pléiotropes y compris cycle cellulaire arrestation21, apoptose22,23de nécrose et peau cellule stimulation24,25,26, ainsi qu’un support ou la diminuent des cellules la motilité ou activité métabolique27,28,29. Le troisième défi, relatives à ces effets pléiotropiques, est d’identifier des molécules clés qui déterminent la réponse cellulaire aux oxydants dérivés du plasma pour expliquer les effets différents, souvent vus dans différents types de cellules. Cela peut être fait par omics techniques30,31,32 et/ou vers le haut ou diminution de l’expression des gènes de cible à l’aide de siARN (redox) signalisation des inhibiteurs, des antioxydants et des enzymes antioxydantes, ainsi que modulation de la production d’espèces réactives de plasma. 33 , 34 , 35 c’est pourquoi, protocoles de dosage simplifié sont nécessaires à plus grands ensembles d’échantillons avec un grand nombre d’itérations de test.

Cette étude illustre un workflow efficace expérimental, de la physique à la biologie, recherche médicale plasma en ce qui concerne les défis susmentionnés. Détails sur les aspects techniques de la source de plasma et de la génération d’un plasma ont été décrits avant. 36 , 37 , 38 tous ces tests sont réalisés en plaques de 96well, qui a un certain nombre d’avantages. Par exemple, les échantillons tels que les surnageants de culture de cellules peuvent être facilement portés de dosage à plaques collectrices à étudier, par exemple, les concentrations de protéine par enzyme---analyse d’immunosorbant. S’il dispose des équipements scientifiques capables de lecture directement à partir de 96 puits, une telle approche minimise les coûts par échantillon et handsontime et maximise les résultats par multiplexage des différentes épreuves du même échantillon. L’utilisation du multicanal pipettes en outre accélère la manipulation des échantillons. En principe, l’essai décrit ici peut effectueé en utilisant des formats de plaque bien avec des diamètres de puits, bien que cela nécessiterait de pipetage supplémentaires dans d’autres tubes et bateaux pour des dosages en aval. Types de plaque plus petits tels que des plaques de 384, cependant, ne présentent pas la géométrie appropriée pour la recherche biomédicale plasma utilisant des jets avec les flux de gaz d’alimentation grande. Plus précisément, il ne peut être garantie que seul mais non adjacents de puits sont touchés lors d’un traitement.

Analyse de liquide est essentiel pour étudier les dépôts espèces par le plasma. En expertises, une configuration parallèle des différentes épreuves peut caractériser plasmatreated liquides en ce qui concerne les différents oxydants en même temps. Ce multiplexage permet de développer une image différenciée des espèces ont. L’approche décrite est très sensible pour enquêter sur les concentrations de peroxyde d’hydrogène39, qui est souvent nécessaire, mais pas toujours suffisante pour expliquer les effets plasma. 40 , 41 , 42 effets biologiquement pertinentes peuvent également être évalués dans les liquides avec un dosage de glutathion non inclus ici. 43 le dosage spécifique nitrite est fortement préférable à Griess-essais conventionnels en raison de la sensibilité plus élevée 10fold (données non présentées). Plasmatreated liquides peuvent également être étudiées pour la formation d’acide hypochloreux DTNB-essai sur. Pourtant, les résultats antérieurs n’indiquaient pas la formation de cette espèce avec notre source de plasma. 19 , 39 , 44 après traitement au plasma, détérioration de l’espèce se déroule au fil du temps. Réagit de nitrite en nitrate ; en outre, le peroxyde est consommé au fil du temps. Toutefois, ces processus prennent plusieurs heures. 35 l’absorption de cytochrome c est stable pendant plusieurs heures de plus. Donc, si le processus se produisent au cours des 30 premières minutes après le traitement, la variation des concentrations des espèces vivaces décrites ici sont négligeables. Cependant, il faut lors de l’enquête sur certains types de supports (p. ex., milieu d’Eagle modifié de Dulbecco) comme ingrédients peut piéger jusqu'à à 90 % de peroxyde de moins de 1 h (données non présentées) conduisant à une sous-estimation des dépôts peroxyde de plasma dans liquides.

Un essai multiplex est présenté qui va d’enquêter sur une activité métabolique sur zone (morphologie) de la cellule à l’expression du marqueur de surface cellulaire. Une combinaison de ces essais peut-être révéler des résultats intéressants. Par exemple, nous avons déjà montré dans les monocytes THP1 que métaboliques comtes d’activité et de la cellule ne diminuent pas de façon linéaire après une exposition au plasma. 45 plutôt, avec le temps de traitement plasma, les cellules ont été observées qui ont augmenté en taille et avait une masse mitochondriale plus élevée, ce qui conduit à des taux métaboliques plus élevés sur une base percell. Essentiellement, la combinaison de lecteur multidisque, microscopie et cytométrie multiplexes d’informations sur les réponses cellulaires après traitement au plasma. Dans les cellules de mélanome, nous nous concentrons ici sur les effets cytotoxiques et leur immunogénicité médiée par la calréticuline. 46 en principe, beaucoup d’autres questions peut être adressées à cette approche, qui relie l’activité métabolique avec imagerie et écoulement cytometry résultats. Par exemple, la différenciation cellulaire (p. ex. polarisation de macrophage), potentiel de membrane mitochondrial, analyse du cycle cellulaire, la motilité cellulaire, biomécanique ou la formation de micronoyaux pour l’analyse de la génotoxicité peut également être étudiée dans cellules traitées au plasma. Cytométrie en flux multicolor permet plus d’applications dans différentes populations cellulaires en même temps. Cela inclut, par exemple, l’analyse de l’état de phosphorylation de protéines telles que les facteurs de transcription, quantification de l’ARNm, mesure des cytokines intracellulaires, et/ou évaluation des thiols réduits totales sur un niveau unicellulaire de signalisation. Des informations biologiquement pertinentes supplémentaires qui sont disponibles pour chaque échantillon contribue à développer l’image des effets de redox de plasma afin de mieux comprendre les applications actuelles et futures de plasma.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Financé par le ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF Don 03Z22DN12 et numéros 03Z22DN11) tient à reconnaître.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
accutase BioLegend 423201
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) Thermo A36006
argon gas Air Liquide N50
B16F10 murine melanoma cells ATCC CRL-6475
catalase Sigma C30
cell culture incubator Binder CB210
cell culture plastic NUNC 156545
cytochrome c, oxidized Sigma C2037
data analysis GraphPad software prism 7.03
fetal bovine serum Sigma batch-tested
fine scale any with resolution of 0.01mg
flow cytometer Beckman-Coulter CytoFlex S
flow cytometry data analysis Beckman-Coulter Kaluza 1.5a
Glutamine Sigma G7513
imaging quantification software PerkinElmer Harmony 4.5
laminar flow hood Thermo Maxisafe 2020
mass flow controller MKS G-series
Measure-iT nitrite detection kit Thermo M36051
microscope PerkinElmer Operetta CLS
optical emssion spectroscopy Avantes AvaSpec-DDDD-2-USB2
penicilin/streptomycin Thermo 15140122
pipettes Eppendorf/Brand single/multi chanel
plate reader Tecan M200pro
propidium iodide BioLegend 421301
resazurin VWR B21187.06
RPMI1640 cell culture media PanbioTech P04-16500
xyz table CNC step HIGH-Z S-400/T 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sen, C. K. The general case for redox control of wound repair. Wound Repair Regen. 11, (6), 431-438 (2003).
  2. Acharya, A., Das, I., Chandhok, D., Saha, T. Redox regulation in cancer: a double-edged sword with therapeutic potential. Oxid Med Cell Longev. 3, (1), 23-34 (2010).
  3. Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, (1), 1-18 (2009).
  4. Cui, X. Reactive oxygen species: the achilles' heel of cancer cells. Antioxid Redox Signal. 16, (11), 1212-1214 (2012).
  5. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D-Applied Physics. 45, (26), 263001 (2012).
  6. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric-pressure plasma sources: Prospective tools for plasma medicine. Pure Appl Chem. 82, (6), 1223-1237 (2010).
  7. Bekeschus, S., Schmidt, A., Weltmann, K. -D., von Woedtke, T. The plasma jet kINPen - A powerful tool for wound healing. Clinical Plasma Medicine. 4, (1), 19-28 (2016).
  8. Wende, K., et al. Risk assessment of a cold argon plasma jet in respect to its mutagenicity. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 798-799, 48-54 (2016).
  9. Kluge, S., et al. Investigating the Mutagenicity of a Cold Argon-Plasma Jet in an HET-MN Model. PLoS One. 11, (9), 0160667 (2016).
  10. Schmidt, A., et al. One Year Follow-Up Risk Assessment in SKH-1 Mice and Wounds Treated with an Argon Plasma Jet. Int J Mol Sci. 18, (4), 868 (2017).
  11. Hanschmann, E. M., Godoy, J. R., Berndt, C., Hudemann, C., Lillig, C. H. Thioredoxins, glutaredoxins, and peroxiredoxins--molecular mechanisms and health significance: from cofactors to antioxidants to redox signaling. Antioxid Redox Signal. 19, (13), 1539-1605 (2013).
  12. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Phys Controlled Fusion. 59, (1), 014031 (2017).
  13. Metelmann, H. R., et al. Experimental Recovery of CO2-Laser Skin Lesions by Plasma Stimulation. Am J Cosmet Surg. 29, (1), 52-56 (2012).
  14. Brehmer, F., et al. Alleviation of chronic venous leg ulcers with a hand-held dielectric barrier discharge plasma generator (PlasmaDerm((R)) VU-2010): results of a monocentric, two-armed, open, prospective, randomized and controlled trial (NCT01415622). J Eur Acad Dermatol Venereol. 29, (1), 148-155 (2015).
  15. Isbary, G., et al. Successful and safe use of 2 min cold atmospheric argon plasma in chronic wounds: results of a randomized controlled trial. Br J Dermatol. 167, (2), 404-410 (2012).
  16. Brulle, L., et al. Effects of a non thermal plasma treatment alone or in combination with gemcitabine in a MIA PaCa2-luc orthotopic pancreatic carcinoma model. PLoS One. 7, (12), 52653 (2012).
  17. Mirpour, S., et al. Utilizing the micron sized non-thermal atmospheric pressure plasma inside the animal body for the tumor treatment application. Sci Rep. 6, 29048 (2016).
  18. Utsumi, F., et al. Effect of indirect nonequilibrium atmospheric pressure plasma on anti-proliferative activity against chronic chemo-resistant ovarian cancer cells in vitro and in vivo. PLoS One. 8, (12), 81576 (2013).
  19. Jablonowski, H., von Woedtke, T. H. Research on plasma medicine-relevant plasma-liquid interaction: What happened in the past five years. Clinical Plasma Medicine. 3, (2), 42-52 (2015).
  20. Reuter, S., et al. From RONS to ROS: Tailoring Plasma Jet Treatment of Skin Cells. Ieee Transactions on Plasma Science. 40, (11), 2986-2993 (2012).
  21. Gherardi, M., et al. Atmospheric Non-Equilibrium Plasma Promotes Cell Death and Cell-Cycle Arrest in a Lymphoma Cell Line. Plasma Processes and Polymers. 12, (12), 1354-1363 (2015).
  22. Bundscherer, L., et al. Viability of human blood leucocytes compared with their respective cell lines after plasma treatment. Plasma Medicine. 3, (1-2), 71-80 (2013).
  23. Hirst, A. M., et al. Low-temperature plasma treatment induces DNA damage leading to necrotic cell death in primary prostate epithelial cells. Br J Cancer. 112, (9), 1536-1545 (2015).
  24. Arndt, S., et al. Effects of cold atmospheric plasma (CAP) on ss-defensins, inflammatory cytokines, and apoptosis-related molecules in keratinocytes in vitro and in vivo. PLoS One. 10, (3), 0120041 (2015).
  25. Korolov, I., Fazekas, B., Szell, M., Kemeny, L., Kutasi, K. The effect of the plasma needle on the human keratinocytes related to the wound healing process. Journal of Physics D-Applied Physics. 49, (3), 035401 (2016).
  26. Schmidt, A., von Woedtke, T., Bekeschus, S. Periodic Exposure of Keratinocytes to Cold Physical Plasma: An In Vitro Model for Redox-Related Diseases of the Skin. Oxid Med Cell Longev. 2016, Harmful and Beneficial Role of ROS (HBR) 9816072 (2016).
  27. Schmidt, A., Bekeschus, S., von Woedtke, T., Hasse, S. Cell migration and adhesion of a human melanoma cell line is decreased by cold plasma treatment. Clinical Plasma Medicine. 3, (1), 24-31 (2015).
  28. Kalghatgi, S., Friedman, G., Fridman, A., Clyne, A. M. Endothelial cell proliferation is enhanced by low dose non-thermal plasma through fibroblast growth factor-2 release. Ann Biomed Eng. 38, (3), 748-757 (2010).
  29. Schmidt, A., Bekeschus, S., Wende, K., Vollmar, B., von Woedtke, T. A cold plasma jet accelerates wound healing in a murine model of full-thickness skin wounds. Exp Dermatol. 26, (2), 156-162 (2017).
  30. Wende, K., et al. Proteomic Tools to Characterize Non-Thermal Plasma Effects in Eukaryotic Cells. Plasma Medicine. 3, (1-2), 81-95 (2013).
  31. Schmidt, A., et al. Redox-regulation of activator protein 1 family members in blood cancer cell lines exposed to cold physical plasma-treated medium. Plasma Processes and Polymers. 13, (12), 1179-1188 (2016).
  32. Landsberg, K., et al. Use of Proteomics to Investigate Plasma-Cell Interactions. Plasma Medicine. 1, (1), 55-63 (2011).
  33. Xu, D., et al. Intracellular ROS mediates gas plasma-facilitated cellular transfection in 2D and 3D cultures. Sci Rep. 6, 27872 (2016).
  34. Ishaq, M., et al. Atmospheric gas plasma-induced ROS production activates TNF-ASK1 pathway for the induction of melanoma cancer cell apoptosis. Mol Biol Cell. 25, (9), 1523-1531 (2014).
  35. Winter, J., et al. Tracking plasma generated H2O2 from gas into liquid phase and revealing its dominant impact on human skin cells. Journal of Physics D-Applied Physics. 47, (28), 285401 (2014).
  36. Dunnbier, M., et al. Ambient air particle transport into the effluent of a cold atmospheric-pressure argon plasma jet investigated by molecular beam mass spectrometry. Journal of Physics D-Applied Physics. 46, (43), 435203 (2013).
  37. Schmidt-Bleker, A., Bansemer, R., Reuter, S., Weltmann, K. -D. How to produce an NOx- instead of Ox-based chemistry with a cold atmospheric plasma jet. Plasma Processes and Polymers. 13, (11), 1120-1127 (2016).
  38. Weltmann, K. D., et al. Atmospheric Pressure Plasma Jet for Medical Therapy: Plasma Parameters and Risk Estimation. Contributions to Plasma Physics. 49, (9), 631-640 (2009).
  39. Bekeschus, S., et al. Hydrogen peroxide: A central player in physical plasma-induced oxidative stress in human blood cells. Free Radic Res. 48, (5), 542-549 (2014).
  40. Girard, P. M., et al. Synergistic Effect of H2O2 and NO2 in Cell Death Induced by Cold Atmospheric He Plasma. Sci Rep. 6, 29098 (2016).
  41. Bekeschus, S., et al. Neutrophil extracellular trap formation is elicited in response to cold physical plasma. J Leukoc Biol. 100, (4), 791-799 (2016).
  42. Girard, F., et al. Formation of reactive nitrogen species including peroxynitrite in physiological buffer exposed to cold atmospheric plasma. Rsc Advances. 6, (82), 78457-78467 (2016).
  43. Bekeschus, S., von Woedtke, T., Kramer, A., Weltmann, K. -D., Masur, K. Cold Physical Plasma Treatment Alters Redox Balance in Human Immune Cells. Plasma Medicine. 3, (4), 267-278 (2013).
  44. Wende, K., et al. Identification of the biologically active liquid chemistry induced by a nonthermal atmospheric pressure plasma jet. Biointerphases. 10, (2), 029518 (2015).
  45. Bekeschus, S., et al. Redox Stimulation of Human THP-1 Monocytes in Response to Cold Physical Plasma. Oxid Med Cell Longev. 2016, 5910695 (2016).
  46. Obeid, M., et al. Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death. Nat Med. 13, (1), 54-61 (2007).
Recherche fondamentale en médecine Plasma - une approche de débit des liquides aux cellules
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).More

Bekeschus, S., Schmidt, A., Niessner, F., Gerling, T., Weltmann, K. D., Wende, K. Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells. J. Vis. Exp. (129), e56331, doi:10.3791/56331 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter