Høy gjennomstrømming kaldt fysiske plasma behandling protokollen væske og celler vises. Det innebærer å sette opp forskjellige feed gass komposisjoner for plasma tenning, måling plasma’s utslipp spectra, og påfølgende analyse av væsker og cellular aktivitet etter plasma behandling.
I plasma medisin, er ionisert gass med temperatur nær som virveldyr systemer brukt på celler og vev. Kalde plasmas generere reaktive arter kjent for redoks regulere biologiske prosesser i helse og sykdom. Prekliniske og kliniske bevis peker til gunstige effekter av plasma behandling i helbredelse av kroniske sår på huden. Andre nye emner, som plasma kreftbehandling, får stadig oppmerksomhet. Plasma medisinsk forskning krever tverrfaglig kompetanse innen fysikk, kjemi og biomedisin. Ett mål av plasma forskning er å karakterisere plasma-behandlet celler i en rekke spesifikke applikasjoner. Dette omfatter for eksempel celletall og levedyktighet, cellulære oksidasjon, mitokondrie aktivitet, cytotoksisitet og modus for celledød, celle syklus analyse, cellen overflaten markør uttrykket og cytokin utgivelsen. Denne studien beskriver det nødvendige utstyret og arbeidsflyter kreves for slik forskning i plasma biomedisin. Den beskriver riktig drift av en atmosfærisk trykk argon plasma jet, spesielt overvåke sine grunnleggende utslipp spectra og feed gass for å modulere reaktive arter utgang. Bruker en høy presisjon xyz-bord og programvare, er jet svevde i millisekund presisjon over i hulrom i 96-brønnen plater i mikrometer presisjon for maksimal reproduserbarhet. Nedstrøms analyser for flytende analyse av redoks-aktiv molekyler vises målcellene er plasma-behandlet. Spesielt melanom celler blir analysert i en effektiv sekvens av ulike påfølgende analyser men bruker de samme cellene: måling av metabolsk aktivitet, total-celle området og overflate markør uttrykk for calreticulin, et molekyl som er viktig for den immunogenic celledød av kreftceller. Disse analyser hente innholdsrike biologiske informasjon om plasma effekter fra en enkelt plate. Helt, denne studien beskriver de grunnleggende trinnene og protokoller for plasma medisinsk forskning.
Reaktiv arter er viktig redoks regulatorer i sykdom, inkludert unormal sårheling1 og kreft. 2 viktigere, disse artene er involvert i patologi samt terapeutiske oppløsningen. 3 , 4 kalde fysiske plasma er en ionisert gass som utvisning reaktive arter av mange slag. 5 siden advent av såkalte kaldt plasmas som opererer på kropp temperatur6, kaldt plasmas kan bli brukt på celler og vev uten termisk skade. Ved å demonstrere effekt og trygg bruk av plasma enheter i prekliniske og kliniske observasjoner, fått tre akkreditering som medisinsk utstyr i Tyskland. 7 spesielt med tanke på gentoksisk sikkerhet, flere studier har vist at mutagene hendelser ved hjelp av enheten med en atmosfærisk trykk argon plasma jet. 8 , 9 , 10 andre to enheter er såkalte dielektrisk barriere utslipp (DBD), som opererer via en annen prinsipp enn plasma jet. Jets tillate spesielt skalpell-lignende behandling av overflater og hulrom mens DBD plasmas er effektiv i behandling av større, men ganske flat vev områder. Utnytte mobilnettet redoks signalering11, er målet med teknikken å utnytte plasma-generert reaktive arter for biomedisinsk programmer. 12 en særlig lovende anvendelse av klinisk plasma terapi er støtte fra sårtilheling. 13 , 14 , 15 videre plasma ble vist å ha anticancer effekter i dyremodeller. 16 , 17 , 18
Før validering effekt og sikkerhet av plasma programmer i dyremodeller eller aften human, standardisert i vitro oppslagsbehov utføres med plasma-enheter. Disse eksperimentene er avgjørende å utforske plasma programmer og avgrense mekanismer på jobben. Videre er grunnleggende forskning nødvendig for å forstå virkningen av sammensetningen av reaktive arter og påfølgende biologiske effekter. Denne studien viser hvordan plasma kan integreres i biomedisinsk forskning å forstå og kontrollere dens virkning på celler. Den beskriver tuning feed gass komposisjon, overvåking av reaktive arter, programmer plasma væsker, celler og vev og resulterende kjemiske og biologiske resultatene. Videre nedenfor eksemplene som instruerer på standardisering av plasma behandling og nedstrøms biologiske metoder, med hovedvekt på plasma medisinsk forskning gjort i 96-brønnen plater. Denne tilnærmingen har forskjellige fordeler: jeg) minimering av antall celler nødvendig per betingelse, reagens kostnader og hands-on tid per prøve; II) godtgjørelse av større nøyaktighet resultater som to og tre eksemplarer behandlinger kan defineres med letthet; og iii) tilrettelegging av sømløs nedstrøms assaying i 96-brønnen format plate leseren, bildebehandling og flyt cytometri eksperimenter.
Grunnleggende forskning er grunnleggende for å utvikle en forståelse av virkningen av og mekanismer underbygger plasma medisin i preklinisk og klinisk forskning. Grunnforskning fremmer også etterforskningen av nye programmer for behandlinger. Mens det er godt etablert at plasmas megle deres biologiske effekter via generasjon reaktive oksygen og nitrogen arter19, er det fortsatt tre viktigste utfordringer til feltet. Først hvilke arter er viktig? Dette kan delvis besvares ved modulerende feed gass sammensetningen av plasmas med optisk diagnostikk og biologiske readouts. 20 andre, hvilke effekter kan sees i biologiske mål som celler? Dette er minst delvis løst med cellekulturer eksperimenter og en rekke analyser. I eukaryote celler, effekter er pleiotropic inkludert celle syklus arrestasjon21, apoptose22, nekrose23, og huden celle stimulering24,25,26, samt en støtte eller reduksjon av cellen motilitet eller metabolsk aktivitet27,28,29. Tredje utfordringen knyttet til disse pleiotropic effekter, er å identifisere viktige molekyler som bestemmer cellulær respons på plasma-avledet oksidanter å forklare ulike effekter ofte sett i forskjellige celletyper. Dette kan gjøres av Omika teknikker30,31,32 og/eller opp eller downregulation av målet gener bruker siRNA (redoks) signalering hemmere, antioksidanter og antioksidant enzymer, samt modulering av den plasma er reaktiv arter utgang. 33 , 34 , 35 derfor strømlinjeformet analysen protokoller er nødvendig å teste større Prøvesett med store antall gjentakelser.
Denne studien eksemplifiserer en effektiv eksperimentelle arbeidsflyt, fra fysikk til biologi, for plasma medisinsk forskning med hensyn til nevnte utfordringene. Detaljer om de tekniske aspektene ved plasma kilden og plasma generasjon har blitt beskrevet før. 36 , 37 , 38 alle disse analyser utføres i 96well plater, som har en rekke fordeler. For eksempel kan utvalgene for eksempel celle kultur supernatants enkelt transporteres fra analysen til samling plater å undersøke, for eksempel protein konsentrasjoner via enzym-koblet-immunosorbent-analysen. Hvis vitenskapelig utstyr kan lese direkte fra 96-brønner tilgjengelig, slik tilnærming minimerer kostnadene per eksempel og handsontime og maksimerer resultatene av multipleksing ulike analyser fra samme eksempel. Bruken av flerkanals Pipetter i tillegg hastigheter opp eksempel behandling. I prinsippet kan analysen beskrevet her også gjennomføres med godt plate formater med større godt diameter, men dette vil kreve flere pipettering trinn i andre rør og fartøy for nedstrøms analyser. Mindre plate typer som 384well plater, men presentere ikke geometrien egnet for biomedisinsk plasma forskning jets med store feed gass flukser. Spesielt kan ikke det garanteres at bare én, men ikke tilstøtende brønner påvirkes under behandling.
Flytende analyse er avgjørende for å undersøke arter deponering av plasma. I ekspert analyser, kan en parallell installasjon av ulike analyser beskrive plasmatreated væske med hensyn til ulike oksidanter samtidig. Denne multipleksing kan utvikle en differensiert bilde av plasmaderived. Beskrevet tilnærmingen er svært følsom for undersøker hydrogen peroxide konsentrasjoner39, som er ofte nødvendig, men ikke alltid tilstrekkelig å forklare plasma effekter. 40 , 41 , 42 biologisk relevante effekter kan også vurderes i væsker med en glutation analysen ikke inkludert her. 43 bestemt nitritt analysen anbefales sterkt over konvensjonelle Griess-analyser på grunn av 10fold høyere analysen følsomhet (data ikke vist). Plasmatreated væsker kan også undersøkes for dannelsen av subsyrer med DTNB-analysen. Likevel, tidligere resultater ikke tyder dannelsen av at arter med våre plasma-kilde. 19 , 39 , 44 etter plasma behandlingen er ferdig, arter forverring foregår over tid. Nitritt reagerer nitrat; peroxide brukes også over tid. Men ta disse prosessene flere timer. 35 cytochrome c absorpsjon er stabil over flere timer også. Derfor hvis prosesser oppstå innen de første 30 min etter behandling, variasjon i konsentrasjoner av varige arter beskrevet her er ubetydelig. Imidlertid må utvises ved undersøker visse typer medier (f.eksDulbeccos endret Eagle Medium) som ingredienser kan renovere opp til 90% peroxide innen 1 h (data ikke vist) fører til en undervurdering av plasma peroxide avsettelse i væsker.
En multiplex analysen presenteres varierer fra undersøker metabolsk aktivitet over cellen område (morfologi) til cellen overflaten markør uttrykk. En kombinasjon av disse analyser kan avdekke interessante resultater. For eksempel har vi tidligere vist i THP1 monocytter at metabolsk aktivitet og celle teller ikke redusere i et lineært etter eksponering for plasma. 45 heller, med økende plasma behandling tid, celler ble observert som økte i størrelse og hadde en høyere mitokondrie masse, dermed fører til høyere metabolske priser på percell basis. I hovedsak multiplexes kombinasjonen av multiplate leseren, mikroskopi og flowcytometri informasjon om mobilnettet svar etter plasma behandling. I melanom celler fokuserer vi her på cytotoksiske effekter og deres immunogenisitet formidlet av calreticulin. 46 i prinsippet mange andre spørsmål kan rettes med denne tilnærmingen koble metabolsk aktivitet med bildebehandling og flyt cytometri resultater. For eksempel kan celledifferensiering (f.eks macrophage polarisering), mitokondrie membran potensialet, celle syklus analyse, celle motilitet, biomekanikk eller micronucleus formasjon for analyse av gentoksisitet også undersøkes i plasma-behandlet celler. Flerfarget flowcytometri gir enda mer programmer i ulike celle populasjoner samtidig. Dette omfatter for eksempel analyse av statusen fosforylering signalnettverk proteiner som transkripsjonsfaktorer, mRNA kvantifisering, måling av intracellulær cytokiner, og/eller vurdering av total redusert thiols på en enkelt celle-nivå. Flere biologisk relevant informasjon som er tilgjengelig for hvert utvalg hjelpemidler i videreutvikle bildet av plasma redoks effekter for bedre å forstå gjeldende og fremtidige plasma programmer.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra tysk Federal Utdannings- og forskning (BMBF gi tall 03Z22DN11 og 03Z22DN12) er takknemlig anerkjent.
accutase | BioLegend | 423201 | |
amplex Ultra Red detection kit (includes horse-radish peroxidase and H2O2) | Thermo | A36006 | |
argon gas | Air Liquide | N50 | |
B16F10 murine melanoma cells | ATCC | CRL-6475 | |
catalase | Sigma | C30 | |
cell culture incubator | Binder | CB210 | |
cell culture plastic | NUNC | 156545 | |
cytochrome c, oxidized | Sigma | C2037 | |
data analysis | GraphPad software | prism 7.03 | |
fetal bovine serum | Sigma | batch-tested | |
fine scale | any with resolution of 0.01mg | ||
flow cytometer | Beckman-Coulter | CytoFlex S | |
flow cytometry data analysis | Beckman-Coulter | Kaluza 1.5a | |
Glutamine | Sigma | G7513 | |
imaging quantification software | PerkinElmer | Harmony 4.5 | |
laminar flow hood | Thermo | Maxisafe 2020 | |
mass flow controller | MKS | G-series | |
Measure-iT nitrite detection kit | Thermo | M36051 | |
microscope | PerkinElmer | Operetta CLS | |
optical emssion spectroscopy | Avantes | AvaSpec-DDDD-2-USB2 | |
penicilin/streptomycin | Thermo | 15140122 | |
pipettes | Eppendorf/Brand | single/multi chanel | |
plate reader | Tecan | M200pro | |
propidium iodide | BioLegend | 421301 | |
resazurin | VWR | B21187.06 | |
RPMI1640 cell culture media | PanbioTech | P04-16500 | |
xyz table | CNC step | HIGH-Z S-400/T |