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चींटी दृश्य प्रणाली के एनाटॉमी की जांच के लिए तकनीक

Published: November 27, 2017 doi: 10.3791/56339
Automatic Translation
1, 1, 2
1Research School of Biology, Australian National University, 2Department of Biological Sciences, Macquarie University

Summary

यह लेख प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में तकनीकों का एक सूट रूपरेखा को कीड़ों के आंतरिक और बाह्य आंख एनाटॉमी का अध्ययन । इनमें चींटी आंखें, विस्तृत समस्या निवारण, और विभिंन नमूनों और ब्याज के क्षेत्रों के लिए अनुकूलन के लिए सुझाव पर काम के लिए अनुकूलित कई पारंपरिक तकनीक शामिल हैं ।

Abstract

यह लेख प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) में तकनीकों के एक सुइट की रूपरेखा जो कीड़ों के आंतरिक और बाहरी आंख शरीर रचना विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इनमें पारंपरिक ऊतकीय चींटी आंखों पर काम करने के लिए अनुकूलित तकनीक शामिल है और इस तरह के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के रूप में अंय तकनीकों के साथ संगीत कार्यक्रम में काम अनुकूलित । इन तकनीकों, हालांकि काफी उपयोगी है, नौसिखिए माइक्रोस्कोपी के लिए मुश्किल हो सकता है, तो महान जोर समस्या निवारण और विभिंन नमूनों के लिए अनुकूलन पर इस लेख में रखा गया है । हम पूरे नमूना के लिए इमेजिंग तकनीक के बारे में जानकारी प्रदान (फोटो-माइक्रोस्कोपी और SEM) और अपने फायदे और नुकसान पर चर्चा । हम पूरी आंख के लिए लेंस व्यास का निर्धारण करने में इस्तेमाल तकनीक पर प्रकाश डाला और सुधार के लिए नई तकनीकों पर चर्चा । अंत में, हम पर चर्चा की तकनीक के लिए नमूने तैयार करने में शामिल LM और उनि, अनुभाग, धुंधला, और इमेजिंग इन नमूनों । हम बाधाओं कि एक भर में आ सकता है जब नमूनों की तैयारी पर चर्चा और कैसे सबसे अच्छा उनके आसपास नेविगेट करने के लिए ।

Introduction

विजन सबसे जानवरों के लिए एक महत्वपूर्ण संवेदी मोडल है । विजन लक्ष्यों को इंगित करने के लिए नेविगेशन के संदर्भ में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, स्थापित करने और मार्गों का पालन, और प्राप्त कम्पास सूचना1,2. कीड़ों यौगिक आंखों की एक जोड़ी का उपयोग कर दृश्य जानकारी का पता लगाने और, कुछ मामलों में, एक से तीन पृष्ठीय रखा सरल आंखें ocelli3,4,5बुलाया ।

चींटियों की आंखें विशेष रुचि के हैं, क्योंकि चींटियों शानदार विविध रहे हैं, वे प्रजातियों के पार कुछ प्रमुख विशेषताओं का संरक्षण । शरीर रचना विज्ञान, आकार, और पारिस्थितिकी में नाटकीय भिन्नता के बावजूद, प्रजातियों के विशाल बहुमत eusocial हैं और कालोनियों में रहते हैं; नतीजतन, विभिन्न प्रजातियों के एक केंद्रीय स्थान और संसाधनों के बीच आगे और पीछे नेविगेट करने के मामले में समान दृश्य चुनौतियों का सामना । चींटियों के पार एक ही बुनियादी नजर bauplan शरीर की लंबाई में 0.5-26 मिमी से लेकर जानवरों में देखा जा सकता है, विशेष रूप से प्रतिदिन से रात के लिए, और धीमी गति से चलने के लिए भूमिगत दृश्य शिकारियों6,7के लिए तेजी से चल रहा है, 8,9,10. पारिस्थितिकी और व्यवहार में इन चौंका देने वाले मतभेदों के सभी एक ही बुनियादी आंख संरचनाओं के असंख्य परिवर्तन करने के लिए अलग वातावरण, जीवन शैली, और शरीर आकार11,12के अनुरूप करने के लिए वृद्धि दे । एक परिणाम के रूप में, चींटियों के दृश्य पारिस्थितिकी का अध्ययन करने के लिए निर्धारित अंवेषक के लिए संभावनाओं का एक सत्य खजाना निधि प्रदान करता है ।

कीड़ों के दृश्य प्रणाली को समझना उनके व्यवहार क्षमताओं में एक अंतर्दृष्टि पाने में आवश्यक है । यह एकीकृत अध्ययन जो अच्छी तरह से पारिस्थितिकी और कुछ कीट समूहों में एक महान सफलता के लिए व्यवहार के साथ एनाटॉमी गठबंधन से स्पष्ट है (जैसे, संदर्भ13,14,15,16, 17). हालांकि आम तौर पर चींटी नेविगेशन और चींटी व्यवहार के क्षेत्र में काफी सफल रहा है, बहुत कम जोर कुछ चुनिंदा प्रजातियों के बाहर चींटी दृष्टि पर रखा गया है । यहां, हम चींटियों की आंख डिजाइन की जांच में शामिल तकनीकों पर विस्तृत होगा । जब तक हम चींटियों पर ध्यान दिया जाएगा, इन तकनीकों, मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है, अंय कीड़ों के लिए भी ।

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Protocol

1. नमूना तैयारी

नोट: यह पहले यौगिक आंख के सापेक्ष स्थान और एक दूसरे को और सिर पर ocelli समझने के लिए आवश्यक है । यह सिर के पृष्ठीय दृश्य की छवियों को प्राप्त करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इस के लिए, हम या तो photomicrography के लिए या SEM तकनीक का उपयोग नमूनों प्रसंस्करण की सिफारिश । नीचे दोनों प्रक्रियाओं में शामिल कदम हैं ।

  1. नमूना संग्रह
    1. लीजिए और नमूनों की दुकान सीधे ७०% इथेनॉल में । जब भी संभव हो विभिन्न जातियों को इकट्ठा करें ।
    2. समय, तिथि, और जगह के साथ ही किसी भी अन्य प्रासंगिक टिप्पणियों के साथ लेबल नमूनों (उदा., जबकि चारा, संभोग एकत्रीकरण, एक टहनी के अंदर घोंसला, आदि)
    3. प्रत्येक उपचार में कई दोहराने के लिए पर्याप्त नमूनों को इकट्ठा ।
  2. Photomicrography और जेड-स्टैकिंग
    1. हवा शुष्क नमूनों और त्रिकोणीय बिंदु कार्ड पर उन्हें माउंट, पानी में घुलनशील गोंद का उपयोग कर, और फिर एक कीट पिन पर. विवरण के लिए,18संदर्भ देखें ।
    2. एक Z-stepper मोटर और एक रंग कैमरा के साथ एक उच्च आवर्धन stereomicroscope का उपयोग कर छवि ।
    3. एक विसारक का प्रयोग करने के लिए नमूनों के लिए एक समान प्रकाश व्यवस्था है ।
    4. विभिंन फोकल विमानों में छवियों पर कब्जा और एक दोषरहित फ़ाइल स्वरूप में छवियों को बचाने (जैसे झगड़ा) और ध्यान केंद्रित उंहें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ढेर ।
  3. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ
    नोट: अच्छी तरह से सभी उपकरणों को साफ और इथेनॉल के साथ काम सतहों धूल और अंय कण के साथ नमूना के संदूषण से बचने के लिए ।
    1. रात भर इथेनॉल में निर्जलीकरण नमूनों और एक पेट्री डिश में शुष्क हवा ।
    2. शरीर के शेष से सिर अलग करने के लिए एक तेज उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें ।
    3. आवश्यक देखने के कोण पर सिर माउंट (उदा, पृष्ठीय ऊपर का सामना करना पड़) एल्यूमिनियम डिटेल पर प्रवाहकीय कार्बन टेप या टैब का उपयोग कर । पतली स्ट्रिप्स में कार्बन टेप काटें और इसे सिर कैप्सूल समर्थन करने के लिए गुना ।
    4. एक रोटरी मंच के साथ 20 mA में 2 मिनट के लिए नमूना की सतह के लिए सोने को लागू करने के लिए एक धूम कोट का प्रयोग करें । समय और वर्तमान साधन के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    5. ताजा कार्बन टेप या टैब के साथ एक नया एल्यूमीनियम ठूंठ के लिए स्थानांतरण नमूनों ।
      नोट: unकोट कार्बन एक काले रंग की पृष्ठभूमि प्रदान करेगा, लेकिन स्थानांतरित नमूनों सोने की कोटिंग को नुकसान पहुंचा सकता है ।
    6. जांच लें कि नमूना अभिविंयास अभी भी एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सही है और ठीक संदंश या इसी तरह के उपकरण की एक जोड़ी के साथ के रूप में आवश्यक समायोजित करें । सोने की कोटिंग खरोंच करने के लिए नहीं ध्यान रखना; के रूप में संभव के रूप में कम संभाल ।
    7. SEM स्टब धारक पर नमूनों लोड, डिटेल और एक दूसरे के सापेक्ष नमूनों की स्थिति का नोट बना ।
      नोट: कुछ SEMs एक मंच कैमरा के साथ सुसज्जित हैं, लेकिन कई नहीं कर रहे है और यह उच्च आवर्धन पर छोटे नमूनों का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है ।
    8. छवि नमूने । एक कम तेजी वोल्टेज का प्रयोग करें चार्ज और क्षेत्र की अच्छी गहराई के लिए एक छोटा सा एपर्चर से बचने के लिए ।
      नोट: सेटिंग्स का उपयोग किया जा रहा विशेष साधन में विशेष तकनीशियन के साथ परामर्श में सबसे अच्छा अनुकूलित कर रहे हैं.

2. पहलू संख्या और व्यास बढ़ाता

  1. कॉर्निया प्रतिकृतियां
    1. इथेनॉल में संरक्षित चींटियों का प्रयोग करें या इस प्रयोजन (1.1.1 कदम) के लिए एक पिन पर मुहिम शुरू की ।
    2. एक कीट पिन पर या प्लास्टिसिन पर पशु माउंट । यदि सिर अपेक्षाकृत बड़ा है तो शेष शरीर के अंगों को हटाया जा सकता है ।
    3. एक कीट पिन या एक ठीक दंर्तखोदनी का उपयोग करने के लिए तेजी से सुखाने बेरंग नेल पॉलिश की एक छोटी सी बूंद लेने और जल्दी से यह आंख पर फैल गया । सुनिश्चित करें कि पिन आँख खरोंच नहीं है. नेल पॉलिश पूरी नजर और आसपास के कुछ हेड कैप्सूल को कवर करना चाहिए.
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि नेल पॉलिश आंख भर में अपेक्षाकृत समान मोटाई की हो ।
    4. कमरे के तापमान पर सेट करने के लिए नेल पॉलिश छोड़ दें ।
    5. एक बार यह पूरी तरह से सेट है, एक ठीक कीट पिन का उपयोग करने के लिए धीरे सिर आंख आसपास के कैप्सूल से प्रतिकृति उठा ।
    6. साफ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करने के लिए प्रतिकृति उठा, प्रतिकृति है कि सिर और आंख नहीं कवर का हिस्सा समझ ।
    7. आंख के उंमुखीकरण के बारे में जागरूकता सुनिश्चित: पूर्वकाल, पीछे, पृष्ठीय, और ventral क्षेत्र ।
    8. प्रतिकृति एक ग्लास स्लाइड पर रखें । ध्यान से आंख के आसपास अतिरिक्त सामग्री को हटाने के द्वारा प्रतिकृति ट्रिम करने के लिए एक उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें । प्रतिकृति चलती से रोकने के लिए एक सुई या संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें ।
    9. यदि आंख बहुत उत्तल है, एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए बढ़त के आसपास 3-4 ठीक आंशिक रेडियल चीरा बनाने के लिए ' मदद समतल ' प्रतिकृति । अगर आंख अपेक्षाकृत ' सपाट ' है तो ऐसे चीरा लगाने की जरूरत नहीं है ।
    10. एक कवर पर्ची धीरे आंख प्रतिकृति पर रखें, सुनिश्चित करना है कि प्रतिकृति के उंमुखीकरण जाना जाता है । दबाव लागू न करें क्योंकि यह नेल पॉलिश पर corneal छाप को खत्म कर सकता है ।
    11. चार कोनों पर बहुत कम नेल पॉलिश का उपयोग कर coverslip सील । अगर नेल पॉलिश कवर स्लिप और ग्लास स्लाइड्स के बीच बहती है, तो इससे प्रतिकृति को नुकसान होगा ।
    12. एक यौगिक माइक्रोस्कोप पर स्लाइड छवि ।
      नोट: यदि केवल कुछ पहलुओं पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, तो यह पता चलता है आंख प्रतिकृति पर्याप्त समतल नहीं है । छोड़ें और चरण 2.1.3 से फिर से प्रारंभ करें ।
    13. ImageJ/फिजी जैसे स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कार्यक्रमों में छवि आयात करें जहां ommatidia की संख्या और प्रत्येक ommatidia के आकार को मापा जा सकता है ।
      नोट: यह विधि भी ocelli की प्रतिकृतियां तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । चूंकि यह एक एकल लेंस है, हम सभी ocelli एक साथ एक प्रतिकृति में रखने की सलाह देते हैं ।

3. आँख की संरचना का विश्लेषण

नोट: आंख के एनाटॉमी अध्ययन करने के लिए ज्यादातर मामलों में LM और उनि के दो पूरक तकनीक की आवश्यकता है. प्रारंभिक प्रसंस्करण चरणों दोनों LM और उनि के लिए इसी तरह की तकनीक की आवश्यकता है । अंतर की धारा के बाद चरण से उठता है । प्रसंस्करण के नमूनों खतरनाक रसायनों जो देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए और जिंमेदारी छोड़ के उपयोग की आवश्यकता है । व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का प्रयोग करें, एक धुएं हुड में काम करते हैं, हमेशा सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) पढ़ें, और शुरू करने से पहले जोखिम आकलन बाहर ले ।

  1. विच्छेदन
    1. ठंडा या गैसीय CO2के लिए जोखिम द्वारा नमूनों Anaesthetize ।
      1. सीओ2 संज्ञाहरण बहुत तेजी से है (आम तौर पर 1 मिनट के तहत) और देखभाल के रूप में इस नमूने की मौत में परिणाम हो सकता है जोखिम से बचने के लिए लिया जाना चाहिए । अगर सूखी बर्फ छर्रों का उपयोग (ठोस सह2) नमूनों के साथ सीधे संपर्क से बचने के रूप में इस ठंड जलता पैदा कर सकता है ।
      2. ठंड संज्ञाहरण धीमी है; 4 ° c पर्याप्त है, और ठंडा तापमान की सिफारिश नहीं कर रहे हैं । प्रजातियों के लिए एक उपयुक्त ठंडा समय की स्थापना । बड़े या ठंडे प्रतिरोधी चींटियों जैसे बैल चींटियों की आवश्यकता हो सकती है > 10 मिनट के लिए पूरी तरह से स्थिर हो, जबकि छोटे प्रजातियों केवल 1-2 मिनट की जरूरत हो सकती है । अत्यधिक ठंडा करने के नमूने को मार देंगे (बर्फ के साथ सीधे संपर्क से बचें) । नमूनों अधिमानतः छोटे, फोम stoppered, प्लास्टिक कंटेनर में आयोजित किया जाना चाहिए और एक हिमीकर में रखा, जहां वे बजाय एक बिजली के फ्रिज या फ्रीजर में देखा जा सकता है ।
    2. एक पेट्री डिश पर जगह नमूना है, और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत देखने के लिए समायोजित करें । जल्दी से काम करने के लिए संज्ञाहरण को बनाए रखने और ऊतक के अध कि एक बार चीरा (यह सेकंड के भीतर हो सकता है) से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. संदंश के साथ एंटीना निकालें । अगर एक चुभने कीट के साथ काम कर रहे, यह सलाह दी जाती है गैस्ट्रोइसोफेजियल पहले विच्छेदन करने के लिए नीतिश जा रहा से बचने ।
    4. एक तेज उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर मुंह भागों निकालें; संदंश नीचे नमूना धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । आंख के पूर्वकाल भाग के माध्यम से कटौती (बड़े नमूनों) या के रूप में संभव के रूप में आंखों के करीब (छोटे नमूनों) के रूप में इस रेटिना आंसू हो सकता है मस्तिष्क पर tugging के बिना ।
    5. हेड कैप्सूल खोलने की तैयारी करें । नमूना है कि पहला चीरा ऊपर की ओर इशारा कर रहा है कोण; यह या तो विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है, जबकि संदंश में या दृश्य नियंत्रण के तहत नमूना पकड़ जबकि अंगूठे और सामने उंगली के बीच नमूना पकड़े ।
    6. सिर के ventral भाग को हटाने के लिए सिर के माध्यम से एक अनुप्रस्थ चीरा बनाओ; ventral आंख के हिस्से को बड़ी प्रजातियों में हटाया जा सकता है निर्धारण और घुसपैठ में सुधार होगा । सिर अभी भी इस बिंदु पर शरीर के लिए संलग्न किया जाना चाहिए ।
    7. सिर्फ यौगिक आंख के पीछे एक राज्याभिषेक चीरा बनाकर शरीर से सिर कैप्सूल तोड़ ।
    8. बर्फ शीत निर्धारण में यौगिक आँखों के साथ विदारक सिर कैप्सूल प्लेस: २.५% glutaraldehyde और फॉस्फेट बफर में 2% paraformaldehyde (पीएच 7.2-7.5).
      चेतावनी: निर्धारण संक्षारक और विषाक्त है; एक धुएं डाकू में उचित संरक्षण और काम पहनते हैं ।
      नोट: यह करने के लिए जल्दी काम करने के लिए महत्वपूर्ण है तंत्रिका ऊतक पतन की गिरफ्तारी । विच्छेदन 2 मिनट या उससे कम (कुशल विच्छेदन कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है) में पूरा किया जाना चाहिए ।
      नोट: अगर आंख की जरूरत है उज्ज्वल या अंधेरे की स्थिति के लिए अनुकूलित करने के लिए, तो पहले कुछ घंटों के लिए आवश्यक प्रकाश हालत के लिए जानवरों का पर्दाफाश । संबंधित प्रकाश शर्तों में विच्छेदों को बाहर ले । चौराहों लाल बत्ती के तहत बाहर किया जा सकता है अंधेरे अनुकरण ।
  2. नमूना प्रसंस्करण
    1. एक कक्षीय शेखर पर गति के साथ कमरे के तापमान पर निर्धारण में नमूनों रखो, 2 ज. बड़े नमूनों के लिए अब निर्धारण समय की आवश्यकता हो सकती है ।
    2. निर्धारण को हटा दें और उसका उचित निपटारा करें । कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर में नमूनों धो (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक) शेखर पर ।
      नोट: फॉस्फेट बफर 8 जी NaCl, ०.२ g KCl, १.४४ g Na2HPO4, और ०.२४४ g KH2PO4 के 1 एल में आसुत एच2ओ (पीएच ७.२) के शामिल हैं ।
    3. फास्फेट बफर निकालें और 2% OsO4 जोड़ें. 1-2 ज के लिए धुएं डाकू में शेखर पर नमूना जार प्लेस । यह एक के बाद के निर्धारण के लिए वसा को ठीक कदम है और भी उनि के लिए विपरीत प्रदान करते हैं ।
      नोट: आज़मियम निर्धारण बार नमूना आकार के अधीन हैं; अंगूठे का एक मोटा नियम के रूप में, 1 मिमी3प्रति निर्धारण के 1 ज की गणना.
    4. आज़मियम समाधान निकालें और उचित रूप से इसका निपटारा करें । कमरे के तापमान बफर में नमूनों धो (3 बार, 5 मिनट प्रत्येक) शेखर पर ।
    5. उन्हें इथेनॉल या एसीटोन की सांद्रता बढ़ाने में रखकर नमूनों को निर्जलीकरण; उदाहरण के लिए, ५०, ७०, ८०, और ९५% प्रत्येक के लिए 10 मिनट और अंत में १००% (2 बार, 15 मिनट प्रत्येक) । समाधान परिवर्तन के बीच शेखर पर नमूनों प्लेस ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, नमूनों में संग्रहित किया जा सकता है ७०% इथेनॉल रातोंरात ।
    6. इथेनॉल नाली और १००% एसीटोन जोड़ें । यह शेखर पर 20 मिनट के लिए छोड़ दो (इस कदम को छोड़ अगर एसीटोन में निर्जलीकरण) । ताजा एसीटोन के साथ बदलें और यह एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए छोड़ दें ।
    7. राल के लिए एसीटोन के निम्नलिखित अनुपात का उपयोग राल के साथ ऊतकों घुसपैठ: 2:1 (3 एच), 1:1 (रात भर), 1:2 (4 एच), और शुद्ध राल (रात भर). हर कदम पर धुएं हुड के अंदर शेखर पर नमूनों छोड़ दो, और सभी के लिए कंटेनर कैप लेकिन पिछले दोनों चरणों ।
      नोट: राल भी सूखा हो तो नमूनों हर कदम पर एक नया डिस्पोजेबल कंटेनर के लिए ले जाया जाना चाहिए करने के लिए चिपचिपा है.
    8. नमूनों को माउंट करने के लिए ब्लॉक तैयार करें । ब्लॉक छोटे आयताकार ब्लॉकों (१.५ x ०.५ x ०.३ सेमी) में एक्रिलिक ग्लास काटने के द्वारा बनाई गई कस्टम हो सकता है । ब्लॉक भी epoxy राल डालने से बनाया जा सकता है (वहां कई वाणिज्यिक उपलब्ध किट रहे हैं) एक सिलिकॉन मोल्ड में और फिर यह ६० डिग्री सेल्सियस पर 12-14 ज के लिए ओवन में इलाज ।
      चेतावनी: unपछाड़ने (तरल) राल यलो है और जब तक पूरी तरह से कठोर ओवन को लौटा दिया जाना चाहिए ।
    9. ब्लॉक को मोल्ड में लंबवत रखें । ध्यान से तरल राल से नमूने ले, नाली के लिए अतिरिक्त राल की अनुमति है, और ब्लॉक के शीर्ष पर नमूना जगह है । अतिरिक्त राल की एक छोटी राशि ब्लॉक करने के लिए नमूना बांध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    10. ब्लॉक लेबल । काग़ज़ लेबल्स मुद्रित करें और उसे ब्लॉक में एम्बेड करें या इसे किसी ब्लॉक फ़ेस में अनुलग्न कर देते हैं.
    11. ६० डिग्री सेल्सियस पर 12-14 ज के लिए ओवन में एंबेडेड ब्लॉकों के साथ मोल्ड रखो ।
    12. नमूना ब्लॉक एक साफ़ लिफाफे में संग्रहीत है । इस तरीके से कई महीनों में साल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
    13. उपयोग कंटेनरों, गंदे दस्ताने, और अंय धुएं डाकू में दूषित उपकरण छोड़ एसीटोन को पूरी तरह से लुप्त हो जाना (ंयूनतम 12 घंटे) की अनुमति ।
    14. डिस्पोजेबल उपकरण को खारिज करने या ऐसे संदंश के रूप में अंय मदों से राल scraping से पहले ओवन में राल इलाज ।
  3. सेक्शनिंग
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूना उन्मुखीकरण विमान के लिए उपयुक्त है विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ब्लॉक का निरीक्षण करें ।
    2. यदि अभिविंयास उचित नहीं है, एक जौहरी का उपयोग करने के लिए बाहर नमूना और फिर से काट-ओरिएंट सेट राल और ताजा राल के टुकड़े का उपयोग फिर से सीट नमूना देखा । सिर भी दो हिस्सों में विभाजित किया जा सकता है दो आंखें अलग से धारा । आगे बढ़ने से पहले फिर से राल इलाज ।
    3. हटाने योग्य microtome चक पर ब्लॉक माउंट । चक और होल्डर पर जगह निकालें ।
    4. राल ब्लॉक काट-छांट माइक्रोस्कोप के तहत एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर ।
      चेतावनी: यह मत करो जब चक microtome बांह पर मुहिम के रूप में यह हाथ झटका और बीयरिंगों को नुकसान कर सकते हैं ।
    5. microtome हाथ और कोण नमूना पर चक रिमाउंट ।
    6. उपयुक्त कोण पर धारक पर चाकू माउंट (ग्लास चाकू के लिए 0 °, हीरे की चाकू के लिए निर्माता के निर्देश देखें) ।
      नोट: कांच चाकू एक गिलास चाकू निर्माता के साथ सस्ते में बनाया जा सकता है, लेकिन वे अपनी बढ़त खो के रूप में समय पर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए; उच्च गुणवत्ता वाले हीरे चाकू खरीदा जा सकता है, लेकिन महंगे हैं, विशेष देखभाल की आवश्यकता है, और beginners के लिए उपयुक्त नहीं हैं ।
    7. आसुत जल एक फिल्टर (०.४५ µm ताकना आकार) के साथ सुसज्जित सिरिंज का उपयोग कर के साथ चाकू नाव भरें ।
    8. पानी का स्तर चाकू के किनारे तक पहुंच जाता है जब तक नाव भरें; meniscus नाव के अन् य क्षेत्रों में उत्तल हो सकता है ।
    9. नाव नाली जब तक meniscus बहुत थोड़ा गुफा है, लेकिन अभी भी चाकू के किनारे तक पहुंचता है । पानी का स्तर किसी भी बिंदु पर समायोजित किया जा सकता है लेकिन हमेशा चाकू के किनारे से दूर ।
    10. ध्यान से नमूना की ओर चाकू लाने के लिए और चाकू के लिए ब्लॉक संरेखित करें । यह सबसे अच्छा है धीरे से किया, समय-ऐपिस के माध्यम से चाकू की निकटता की जांच और पक्ष से ।
      नोट: उपकरणों बदलती के रूप में विशिष्ट निर्देशों के लिए साधन पुस्तिका की जाँच करें.
    11. microtome पर अनुभाग मोटाई सेट करें । सही मोटाई का चयन नमूना आकार पर निर्भर हो जाएगा, ब्याज के क्षेत्र और चाकू की तरह इस्तेमाल किया जा रहा है ।
    12. यदि एक गिलास चाकू का उपयोग एक उच्च सेटिंग का चयन करें (उदा, 4 µm), अगर सामग्री का एक बहुत दूर ब्याज के क्षेत्र तक पहुंचने से पहले काटा जाना चाहिए । यदि एक हीरे चाकू इस्तेमाल किया जा रहा है या यदि नमूना बहुत छोटा है, 1-2 µm अधिक उपयुक्त हो सकता है ।
    13. शुरू "काटने" (microtome पहिया सनकी) जब चाकू बंद है, लेकिन नमूना में अभी तक काटने के लिए दृष्टिकोण के पिछले भाग प्रदर्शन नहीं है । अनुभागों को कुछ घुमावों के भीतर प्रकट होना प्रारंभ करना चाहिए; यदि नहीं, बंद करो और बहुत ध्यान से चाकू थोड़ा करीब ले आओ ।
    14. अनुभाग एकत्रित मोटाई (अर्द्ध पतली वर्गों के लिए 1 µm) जब ब्याज के क्षेत्र में आ समायोजित करें ।
    15. एक बरौनी उपकरण का उपयोग कर किसी भी वर्गों लीजिए.
      नोट: बरौनी उपकरण एक बरौनी नेल पॉलिश के साथ एक पतली छड़ी पर घुड़सवार के साथ बनाया जा सकता है ।
    16. सामग्री का एक बहुत हटा दिया जाना चाहिए, तो वर्गों जमा करने के लिए और चाकू हटाने और पानी के साथ इसे बाहर निस्तब्धता द्वारा सामूहिक रूप से हटाने के लिए अनुमति देते हैं । यदि एक ग्लास चाकू का उपयोग कर, यह एक उपयुक्त समय चाकू के एक ताजा अनुभाग के लिए या एक नया चाकू को बदलने के लिए हो सकता है ।
    17. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर स्लाइड पर आसुत जल की छोटी बूंदों की एक श्रृंखला प्लेस या आदर्श, फिल्टर सिरिंज सुसज्जित.
    18. ध्यान से पानी की छोटी बूंद पर बरौनी पर एकत्र अनुभाग फ्लोट ।
    19. अनुभाग की गहराई की जांच करने के लिए उपयुक्त है जब तक इस तरह वर्गों लीजिए ।
      नोट: हालांकि यह थकाऊ हो सकता है, यह हमेशा सबसे अच्छा है अक्सर जांच करने के लिए ।
    20. स्लाइड को चूल्हा सेट पर ६० ° c पर रखें । सभी पानी वाष्पीकरण और अनुभाग स्लाइड का पालन करने के लिए अनुमति दें ।
    21. 10-60 s के लिए toluidine ब्लू के साथ डाई वर्गों (धुंधला समय अनुभाग मोटाई के साथ भिन्न होगा). एक फिल्टर (ऊपर के रूप में) के साथ सुसज्जित सिरिंज के साथ डाई बांटना.
    22. स्लाइड के एक छोर पर डाई की एक बूंद रखें और इसे छूने या वर्गों परिमार्जन के बिना सुई की ओर का उपयोग कर फैला । स्लाइड को लगभग 10-20 के लिए चूल्हा पर रखें ।
    23. एक धोने की बोतल में आसुत पानी के साथ यह छिड़काव से स्लाइड कुल्ला और इसे सुखाने के लिए गर्म थाली पर जगह है ।
    24. यौगिक माइक्रोस्कोप के तहत जाँच करें और उन्हें छवि.
    25. जब तक ब्याज के क्षेत्र तक पहुंच जाता है दोहराएं ।
    26. अल्ट्रा पतली वर्गों के लिए: 40-60 एनएम के बीच काटने की मोटाई सेट करने के लिए उनि वर्गों इकट्ठा ।
    27. के बारे में 3-5 वर्गों में कटौती और एक हस्तक्षेप रंग चार्ट का उपयोग मोटाई की जांच करें । एक कोण पर देखा जब वर्गों प्रकाश ग्रे प्रतिबिंबित करना चाहिए ।
      नोट: क्लोरोफॉर्म धुएं वर्गों पर pipetted जा सकता है किसी भी क्रीज आराम करो । यह सबसे अनुभवी उपयोगकर्ताओं के लिए प्रासंगिक है, और शुरुआती चिंता नहीं की जरूरत है । बहुत ज्यादा क्लोरोफॉर्म जारी भी अनुभाग के करीब वर्गों को नुकसान पहुंचा सकता है ।
    28. एक Formvar-लेपित, तांबा, स्लॉट Formvar पक्ष के साथ संदंश के साथ आयोजित ग्रिड उठाओ । Formvar कोटिंग पंचर नहीं करने के लिए सावधान रहें ।
    29. नाव edgeways में ग्रिड डुबकी और वर्गों से दूर है, तो वर्गों के तहत सतह के समानांतर ग्रिड लाने के लिए । यदि आवश्यक हो तो बरौनी का उपयोग करने के लिए ग्रिड पर वर्गों का मार्गदर्शन ।
    30. ध्यान से फिल्टर कागज के साथ संदंश की नोक के आसपास ढाब को बाहों के बीच फंस पानी सोख । यदि ऐसा नहीं किया जाता है, तो पानी का तनाव ग्रिड को बाहों के बीच में खींच सकता है या इसे एक तरफ चिपका सकते हैं । यह दूषित या यांत्रिक क्षति में परिणाम कर सकते हैं ।
    31. ध्यान से ग्रिड से अतिरिक्त पानी ही फिल्टर कागज पर ग्रिड edgeways खड़े द्वारा निकाल दें ।
    32. ग्रिड को ग्रिड धारक में रखें ।
    33. दोहराएँ जब तक पर्याप्त अनुभाग संग्रहीत किया गया है ।
    34. अर्द्ध पतले वर्गों के किसी भी यौगिक एक कैमरे से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के साथ सीधे imaged किया जा सकता है । विसर्जन तेल सीधे वर्गों पर रखा जा सकता है । स्लाइड्स को रंग-रूप देने से रोकने के लिए स्लाइड बॉक्स में संग्रहित करना चाहिए ।
  4. उनि इसके विपरीत के लिए अल्ट्रा पतली अनुभाग धुंधला
    नोट: निम्नलिखित चरणों को कवर के तहत किया जाना चाहिए के रूप में रंजक प्रकाश और सह2 संवेदनशील हैं. इसके अलावा, EM रंजक इसके विपरीत उत्पादन करने के लिए भारी धातुओं का उपयोग करें और इसलिए खतरनाक पदार्थ हैं । इन दाग को संभालते समय उचित देखभाल अवश्य करनी चाहिए ।
    1. कवर एल्यूमीनियम पंनी के साथ कुछ बड़े पेट्री व्यंजन प्रकाश ब्लॉक करने के लिए । निंन चरणों के लिए इन के अंतर्गत कार्य करें । आंशिक रूप से उन्हें काम करने की अनुमति देने के लिए जगह है, लेकिन जगह को कवर पर वापस जितनी जल्दी हो सके ।
    2. मोम फिल्म का एक टुकड़ा काट और ध्यान से यह एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पर 6% संतृप्त uranyl एसीटेट की पांच बूंदों जगह है ।
      1. समाधान तैयार करने के लिए, आसुत जल में १०० मिलीलीटर ५०% मेथनॉल के साथ 2 ग्राम uranyl एसीटेट को मिलाएं, और उपयोग करने से पहले समाधान को फ़िल्टर करें । समाधान संग्रहीत नहीं किया जा सकता और प्रत्येक बार19को ताज़ा किया जाना चाहिए ।
    3. ध्यान से संदंश और खंड की ओर नीचे के साथ डाई बूंदों के शीर्ष पर संतुलन के साथ उनि ग्रिड उठाओ । 25 मिनट के लिए छोड़ दें ।
    4. व्यक्तिगत रूप से कुल्ला ग्रिड तेजी से उंहें में और आसुत पानी की सूई से; आसुत जल की चार विभिंन शीशियों के माध्यम से प्रगति ।
    5. फिल्म का एक ताजा टुकड़ा पर सीसा साइट्रेट के पांच बूंदें प्लेस । डाई बूंदों के आसपास कुछ NaOH छर्रों की व्यवस्था (इस वायुमंडलीय CO2 अवशोषित करने के लिए सीसा कार्बोनेट की वर्षा रोकने के लिए).
      1. लीड साइट्रेट समाधान बनाने के लिए, ०.५ घंटे के लिए आसुत जल द्वारा द्वि-आसुत पानी तैयार करने के लिए पानी की अनुमति दें ठंडा और एक सील कंटेनर में, ०.३ g लीड साइट्रेट के लिए १०० मिलीलीटर द्वि-आसुत पानी की जोड़ें । 1 मिलीलीटर 10 मीटर NaOH जोड़ें, कंटेनर को कसकर सील करें, और19भंग होने तक हिलाएं ।
    6. डाई बूंदों पर ग्रिड प्लेस के रूप में ४.३ में वर्णित है और कवर । 5 मिनट के लिए दाग ।
    7. पहले के रूप में आसुत जल में कुल्ला ग्रिड में और आसुत जल से बाहर 20 बार के बाद । आसुत जल के तीन जहाजों के माध्यम से प्रगति ।
    8. फिल्टर कागज के साथ अतिरिक्त पानी सोख और ग्रिड एक ग्रिड बॉक्स में सूखे के लिए अनुमति देते हैं ।
    9. कम तेजी वोल्टेज पर एक उनि में छवि ।

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Representative Results

यहाँ वर्णित विधियों में चींटियों की सरल और यौगिक आँखों का विस्तृत अध्ययन सक्षम है. इमेजिंग का उपयोग कर सिर के पृष्ठीय दृश्य Z-स्टैक photomicrography तकनीक एक दृश्य प्रणाली के लेआउट का एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है (चित्रा 1) । यह विच्छेदन के लिए अच्छी तैयारी है और आवश्यक अनुभाग कोण का निर्धारण करने के लिए । इस तकनीक का भी सिर चौड़ाई, आंख की लंबाई, और ocellar लेंस व्यास के रूप में माप लेने के लिए उपयोगी है । SEM इमेजिंग भी विस्तृत अवलोकन चित्र देता है, लेकिन इसके अतिरिक्त उच्च आवर्धन और उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण की इजाजत देता है । आंखों में रुचि के विशेष क्षेत्रों में विस्तार से जांच की जा सकती है और लेंस के आकार में बदलाव की पहचान की जा सकती है (चित्र 2) । SEM छवियां विशेष रूप से छोटी आंखें और ocelli के साथ चींटियों को हल करने के लिए उपयोगी होते हैं । कॉर्निया प्रतिकृतियों आकार, आकार, और प्रत्येक आँख में लेंस की संख्या के बारे में जानकारी प्रदान (चित्रा 3) । सेमी-पतले वर्गों LM तकनीक का उपयोग कर छवि आंख की सकल आंतरिक शरीर रचना की जांच की अनुमति (चित्रा 4 और चित्रा 5); यह लेंस की मोटाई, क्रिस्टलीय शंकु के व्यास, एक क्रिस्टलीय शंकु पथ की उपस्थिति, आकार, चौड़ाई, और rhabdom की लंबाई भी शामिल है, पृष्ठीय रिम क्षेत्र मानचित्रण, और प्राथमिक और माध्यमिक वर्णक कोशिकाओं के स्थान । इस तकनीक को अच्छी तरह से अति पतली द्वारा पूरित किया जा सकता है उनि, जो विशेष रूप से ultrastructure का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है, microvillar उंमुखीकरण (चित्रा 4) और बढ़ाता छोटे संरचनाओं (जैसे, चौड़ाई का उपयोग imaged वर्गों कसना क्रिस्टलीय शंकु पथ, चित्रा 5) ।

Figure 1
चित्र 1: ऑस्ट्रेलियाई चीनी चींटी की तीन जातियों की Z-स्टैक photomicrographs, Camponotus consobrinus। यह सभी तीन जातियों में दृश्य प्रणाली के लेआउट का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है । संदर्भ20से अनुकूलित । स्केल बार = 1 mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इस तकनीक की इमेजिंग क्षमताओं का प्रदर्शन करने वाली चींटी दृश्य प्रणाली की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ. शीर्ष पंक्ति में विभिन्न नेत्र स्थितियों और आँख के आकार से पता चलता है: (A) Myrmecia nigriceps; (ख) Opisthopsis pictus; और (ग) Amblyopone australis (बहुत छोटी आंखें, सफेद तीर) पर ध्यान दें । प्रदर्शित उच्च आवर्धन पर अधिग्रहीत छवियां: (घ) Myrmecia nigriceps के श्रमिकों में तीन साधारण आंखें; अलग आकार यौगिक नेत्र (ई) Rhytidoponera metallica में (नोट अलग आकार ommatidia में पीले रंग में यौगिक नेत्रों के विभिन्न क्षेत्र), (च) Amblyopone australis, (छ) Myrmecia pyriformis, (ज) Orectognathus clarki, और (I) Pheidole प्रजाति । स्केल पट्टियां = 1 mm (A-C), १०० µm (D-H), 10 µm (I) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चींटी आँख और ocelli के कॉर्निया प्रतिकृतियों. (क) Myrmecia nigricepsके एक कार्यकर्ता की यौगिक आँख की प्रतिकृति. चीरा लगाकर उत्तल प्रतिकृति को समतल किया गया.  इनसेट पीछे (पी) इंगित करता है, पूर्वकाल (एक), और पृष्ठीय (d), ventral (v) अक्षों । (ख) Myrmecia tarsataके कामगार की ocelli की प्रतिकृति । स्केल पट्टियां = ०.५ mm (A), 10 µm (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: rhabdom पार वर्गों के एल एम और EM छवियों. (क) Myrmecia nigriceps में बाहर की rhabdoms के पार की धारा toluidine नीले दाग में rhabdoms कि परिपत्र या आकार में आयताकार है भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ शो: (ख) परिपत्र rhabdom में microvilli के एकाधिक झुकाव और (ग) आयताकार आकार rhabdom में दो विपरीत दिशाओं में उंमुख microvilli । (D) प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, आयताकार rhabdoms की लंबी धुरी को Camponotus consobrinusकी रानी में आंख के पृष्ठीय क्षेत्र में एक प्रशंसक की तरह दिखाने के लिए मैप किया जाता है; इनसेट पीछे (पी) इंगित करता है, पूर्वकाल (एक), और पार्श्व (एल), औसत दर्जे का (एम) कुल्हाड़ियों । पैनल डी संदर्भ से20अनुकूलित । स्केल पट्टियां = 10 µm (A), 1 µm (B-C), १०० µm (D) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक प्रकाश में एक ommatidium के एल एम और EM छवियां Myrmecia tarsataकी नजर अनुकूलित । (एक) कॉर्निया (सी), क्रिस्टलीय शंकु (CC), कोन पथ (सीटी), rhabdom (आरएच) और प्राथमिक वर्णक कोशिकाओं (पीपीसी) दिखा ommatidium के अनुदैर्ध्य अनुभाग । (ख) शंकु पथ की संकीर्ण चौड़ाई को बढ़ाता है एक उनि के नीचे देखा एक अलग अनुभाग से पैनल में एक आयताकार बॉक्स धराशायी । संदर्भ21से अनुकूलित । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: अर्द्ध पतली और अति पतली वर्गों (निर्धारण और घुसपैठ, काटने और दाग) के साथ आम समस्याओं । (क) अपर्याप्त प्रवेश के कारण ऊतक के गरीब निर्धारण (तीर) Pheidole प्रजातियों में से एक अर्द्ध पतली अनुभाग में; (ख) Iridomyrmex calvus में सेक्शनिंग के दौरान रिप (अर्द्ध पतली); (ग) सही धुंधला (बाएं) और Myrmecia croslandiमें toluidine नीले रंग के साथ धुंधला (सही); (घ) वर्णक (सर्कल) और (तीर) राल और ऊतक घनत्व के गरीब मिलान के कारण (बहुत नरम राल) के दौरान खंड (तीरों) फट ऊतक । खंड (तारक) की तह, हो सकता है जब चाकू नाव से वर्गों का संग्रह; (ई) गरीब विपरीत अपर्याप्त धुंधला होने के कारण (इनसेट में तुलना), नेतृत्व साइट्रेट क्रिस्टल (सफेद तीर) से सह2के लिए जोखिम, और ऊर्ध्वाधर चाकू चिह्न (काले तीर); (च) ऊतक में छिद्र (सफेद तीर) एक Melophorus hirsutus यौगिक आँख में खराब निर्धारण की वजह से; (जी) बहुत नरम राल, छिट्टो की ओर जाता है जब खंड में ऊर्ध्वाधर तरंग के रूप में देखा अनुभाग; (एच) अनुभाग बहुत मोटी (~ १०० एनएम) गरीब इसके विपरीत के साथ अंधेरे छवि के परिणामस्वरूप, दूषित आसुत जल सीसा बैक्टीरिया और बात कण को खंड भर में बिखरे हुए (सफेद तीर) Pheidole प्रजातियों में । स्केल बार = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ऊपर उल्लिखित विधियों के सुइट चींटियों और अंय कीड़ों की ऑप्टिकल प्रणाली में एक प्रभावी जांच के लिए अनुमति देते हैं । इन तकनीकों का नमूना संकल्प, ऑप्टिकल संवेदनशीलता, और आंख के संभावित ध्रुवीकरण संवेदनशीलता का अध्ययन किया जा रहा है की हमारी समझ को सूचित । यह ज्ञान उनके दृश्य क्षमताओं में शारीरिक और व्यवहार जांच के लिए एक महत्वपूर्ण आधार प्रदान करता है । इसके अलावा, जबकि यहां विस्तृत तरीकों चींटी दृश्य प्रणालियों पर ध्यान केंद्रित किया है, इन तकनीकों अंय कीड़ों पर इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि प्रोटोकॉल में मामूली संशोधनों के साथ (उदा, मोटा ऊतकों में निर्धारण और घुसपैठ की अवधि में वृद्धि) . थोड़ा संशोधित प्रोटोकॉल cicadas22, मक्खियों14, मधुमक्खियों23, ततैया24, तितलियों25, और पतंगे26सहित कीड़ों की एक किस्म के दृश्य प्रणालियों की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि यहां उल्लिखित तकनीकों का सबसे उपयोग में कुछ समय के लिए किया गया है, इस अनुच्छेद के लिए उंहें एक साथ लाने के लिए है चींटी ऑप्टिकल प्रणाली का अध्ययन और वैकल्पिक तकनीकों की तुलना और आम नुकसान का वर्णन के संदर्भ में अवसर लेता है ।

वहां कई इमेजिंग वर्तमान में उपलब्ध है कि अनुप्रयोगों ओवरलैपिंग तकनीक है और यह आकलन करने के लिए जो तकनीक हाथ में काम के लिए उपयुक्त है मुश्किल हो सकता है । एक प्रासंगिक उदाहरण यहां सिंहावलोकन इमेजिंग के लिए एक तकनीक का चयन है । सिर और आंख और सिर पर ऑप्टिकल प्रणाली के सापेक्ष स्थिति के बाहरी आकृति विज्ञान SEM या photomicrography का उपयोग किया जा सकता है । शक्तियों और इन तकनीकों की कमजोरियों की समीक्षा की गई है27, हालांकि, वहां कुछ विशेष विचार कर रहे है जब इमेजिंग आंखें । जब इमेजिंग रिश्तेदार स्थिति और आंखों के आकार, दोनों तकनीकों अपने फायदे और नुकसान है । SEM छवियां रंग जानकारी की कमी है और इसलिए जहां रंजकता प्रासंगिक है photomicrography बेहतर है । हालांकि, SEM छवियां इस तरह के अंतर के रूप में ठीक संरचनाओं ommatidial बाल और अधिक विस्तार में पहलू सीमाएं वर्णन कर सकते है और यहां तक कि सतह photomicrography तकनीकों के तहत दिखाई नहीं सुविधाएं (उदा, ocellar लेंस, सतह sculpturing का पता चलता है यौगिक नेत्र लेंस) । SEM एक बहुमुखी तकनीक है जब यह खोजपूर्ण इमेजिंग की बात आती है और ब्याज की सुविधाओं की पहचान क्योंकि यह नमूना आकार की एक बड़ी रेंज पर काम करते हुए अभी भी इस रेंज में बहुत उच्च संकल्प को बनाए रखने कर सकते हैं । हालांकि, यह एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के रूप में व्यापक रूप से सुलभ नहीं है और विशेषज्ञता के एक उच्च स्तर की आवश्यकता है । वहां अक्सर जानकारी प्राप्त करने का कोई एक तरीका की आवश्यकता है । ऐसे परिदृश्य में, यह विचार करने के लिए उपयोगी है कि क्या उपलब्ध है और कहां संसाधनों का निवेश करना सबसे महत्वपूर्ण है ।

कील-पोलिश कॉर्निया की प्रतिकृतियां पहलू संख्या और पहलू व्यास का सबसे सटीक उपाय प्राप्त करने में सबसे उपयोगी साबित हो गया है । इसमें अब विभिन्न प्रकार के कीड़े11,22,28,29का प्रयोग किया गया है । जबकि एक SEM से अधिग्रहीत छवियों की गुणवत्ता तक बेहतर है, आंख की वक्रता पूरे पहलू सरणी के सटीक माप रोकता है । पहलू आकार और पहलू वितरण मानचित्रण भी सूक्ष्म से प्राप्त स्कैन से संभव होना चाहिए गणना टोमोग्राफी5।

दोनों LM और उनि तकनीक में, यह अक्सर पता है कि नमूना तैयार किया गया है और इमेजिंग के अंतिम चरण तक अच्छी तरह से संसाधित करने के लिए मुश्किल है । जटिलताओं से बचने के लिए, यह साफ काम कर रहे रिक्त स्थान और उपकरण बनाए रखने के रूप में अच्छी प्रथाओं स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, ताजा समाधान नियमित रूप से तैयारी, और अच्छी तरह से पानी छानने । कि नग्न आंखों को अदृश्य कर रहे है संदूषण उंहें नमूनों को बर्बाद कर सकते हैं । इस कारण से, यह इस तरह के इथेनॉल या एसीटोन के रूप में एक विलायक, का उपयोग सतहों और उपकरणों को मिटा उपयोगी हो सकता है, और एक गैर-एक प्रकार का वृक्ष का उत्पादन पोंछ । यह सबसे अधिक प्रासंगिक है जब, अनुभाग धुंधला उंहें वर्गों, और जब SEM नमूनों की तैयारी । इसी प्रकार, आसुत जल स्रोतों समस्याओं को पेश कर सकते है और दूषित पदार्थों का परिचय तो यह हमेशा सबसे अच्छा है फिल्टर की जांच, उंहें नियमित रूप से बदल जाते हैं, और हमेशा ताजा फ़िल्टर्ड पानी का उपयोग करें (स्टोर) नहीं है । अधिकांश fixatives, दाग, और एंबेडिंग सामग्री अनिश्चित काल तक संग्रहीत नहीं किया जा सकता है और यह तैयारी की तारीख के साथ सभी समाधान लेबल महत्वपूर्ण है । एक व्यवस्थित दृष्टिकोण रखना और बिना किसी रुकावट के प्रोटोकॉल को पूरा करने के लिए पर्याप्त समय निर्धारित करना महत्वपूर्ण है ।

विभिंन प्रजातियों के लिए तकनीक अनुकूलन हमेशा परीक्षण और त्रुटि की बात है । Formicidae के भीतर काम करते समय, मुख्य मतभेदों के सिर के भीतर पशु और मांसपेशियों के आकार में झूठ । उनके सिर में अधिक पेशियां के साथ चींटियों आमतौर पर तय करने के लिए अब ले जाएगा । बहुत बड़ी चींटियों के साथ, यह mandibular मांसपेशियों, श्वासनली, और mandibular ग्रंथियों को दूर करने के लिए सबसे अच्छा है, जबकि तंत्रिका ऊतक के साथ ंयूनतम हस्तक्षेप सुनिश्चित करने । छोटी चींटियों और कुछ mandibular मांसपेशियों के साथ उन में, यह सिर्फ mandibles को दूर करने और clypeal क्षेत्र को उजागर द्वारा पर्याप्त निर्धारण प्राप्त करने के लिए संभव है । इन मामलों में, ज़रा पिन का उपयोग करते हुए छोटे छेद, निर्धारण में सुधार करने के लिए सिर पर बनाया जा सकता है ।

इस बात पर ध्यान देना जरूरी है कि पर्यावरणीय स्थितियाँ भी तैयारियों को प्रभावित कर सकती हैं. गर्म और आर्द्र वातावरण (विशेष रूप से उष्णकटिबंधीय में क्षेत्र स्टेशनों) घुसपैठ की अवस्था के दौरान एक चुनौती साबित हो सकता है । उष्ण स्थितियां रेजिन का नेतृत्व करने के लिए आंशिक रूप से समय से पहले अप्रयुक्त राल में जिसके परिणामस्वरूप polymerize तेजी से अधिक चिपचिपा होता जा सकता है । इस मामले में, सबसे अच्छा विकल्प के लिए छोटे, एकल उपयोग, फ्रिज या फ्रीजर में कंटेनरों में राल की दुकान है । शीतलक fixatives गर्म स्थितियों में तेजी से ऊतक क्षय का मुकाबला करने के लिए सहायक हो सकता है । हालांकि, ठंडा समाधान और धीरे से फैलाने का मतलब है कि उपचार के समय उचित पैठ सुनिश्चित करने के लिए विस्तारित किया जाना चाहिए ।

मन में इन सावधानियों के साथ, चींटियों और अन्य कीड़ों की ऑप्टिकल प्रणाली में जांच बहुत फायदेमंद साबित हो सकती है । दृश्य प्रणाली का अध्ययन हमें दृश्य क्षेत्रों के आकार का अनुमान लगाने के लिए अनुमति देता है, interommatidial कोण, ऑप्टिकल संवेदनशीलता, और नमूना संकल्प. आंख के एनाटॉमी को समझना हमारी समझ और पशु व्यवहार की व्याख्या को सूचित । उदाहरण के लिए, एनाटॉमी हमें जानवरों के दृश्य क्षमताओं पर भविष्यवाणी करने के लिए अनुमति देता है जैसे कि वे प्रतिदिन या स्वप्नदोष, जो पहले दर्ज़ नहीं किया गया हो सकता है । चींटियों की मुट्ठी के दृश्य प्रणाली के बारे में वर्तमान ज्ञान को देखते हुए, हमें उंमीद है कि हमारे तरीकों जीव और myrmecologists को प्रेरित करने के लिए यौगिक आंख और चींटियों में ocelli की जांच करने के लिए हमारी समझ आगे होगा ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं घोषित करते हैं ।

Acknowledgments

हम Jochen Zeil, पॉल कूपर और Birgit Greiner के लिए आभारी है कीट शरीर रचना विज्ञान में अपने ज्ञान बांटने के लिए और तकनीक हम यहां वर्णित है के कई प्रदर्शन के लिए । हम अनु और MQU में माइक्रोस्कोपिक यूनिट पर उन्नत माइक्रोस्कोपी के लिए केंद्र में प्रतिभाशाली और सहायक स्टाफ के लिए आभारी हैं । यह काम एक स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा FRE और अनुदान के लिए ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद (DE120100019, FT140100221, DP150101172) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ant Myrmecia midas
Stereomicroscope Leica M205 FA
Sputter coater Pro Sci Tech
Ethanol Sigma Aldrich
Petri dish ProSciTech
Dissecting microscope Leica MZ6
Insect Pin ProSciTech
Colourless nail polish Non branded: from any cosmetic store
Glass slide ProSciTech
Razor blade ProSciTech
Foreceps ProSciTech
Cover slip ProSciTech
Compound microscope Leica DM5000 B
Glutaraldehyde Sigma Aldrich
Paraformalydehyde Sigma Aldrich
Potassium Chloride (KCl) Sigma Aldrich
di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) Sigma Aldrich
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma Aldrich
Sodium Chloride (NaCl) Sigma Aldrich
Osmium tetroxide Sigma Aldrich
Acetone Sigma Aldrich
Araldite Epoxy Resin Sigma Aldrich
Pasteur pipette Sigma Aldrich
Toluidie Blue Sigma Aldrich
Hotplate Riechert HK120

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References

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Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A.,… More

Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. J. Vis. Exp. (129), e56339, doi:10.3791/56339 (2017).

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