Summary
Este artículo describe un conjunto de técnicas de luz y microscopía electrónica para estudiar la anatomía interna y externa del ojo de los insectos. Estos incluyen diversas técnicas tradicionales optimizadas para trabajo en ojos de hormiga, detalladas de solución de problemas y sugerencias para la optimización para diferentes especies y regiones de interés.
Abstract
Este artículo describe un conjunto de técnicas en microscopía de luz (LM) y la microscopia electrónica (EM) que puede utilizarse para estudiar la anatomía interna y externa del ojo de los insectos. Estos incluyen técnicas histológicas tradicionales optimizada para trabajo en ojos de hormiga y adaptado para trabajar en conjunto con otras técnicas como la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica (SEM). Estas técnicas, aunque muy útil, pueden ser difíciles para el microscopista de principiante, por lo que ha hecho gran hincapié en este artículo de solución de problemas y optimización para diferentes muestras. Proporcionar información sobre las técnicas de imagen para la muestra entera (foto-microscopía y SEM) y analizar sus ventajas y desventajas. Destacar la técnica utilizada en la determinación de diámetros de lente para el ojo entero y discutir nuevas técnicas para la mejora. Por último, se discuten técnicas de preparación de muestras para LM y TEM, corte, tinción y estas muestras de la proyección de imagen. Se discuten los obstáculos que podría venir cuando preparación de muestras y la mejor manera de navegar por ellos.
Introduction
La visión es una modalidad sensorial importante para la mayoría de los animales. La visión es especialmente crucial en el contexto de navegación para objetivos de localización, establecimiento y adhiriéndose a las rutas y obtener información brújula1,2. Insectos detectan información visual utilizando un par de ojos compuestos y, en algunos casos, uno a tres ojos simples de colocado dorsalmente llaman ocelos3,4,5.
Los ojos de las hormigas son de particular interés porque, mientras que las hormigas son muy diversas, conservan algunas características claves entre especies. A pesar de la dramática variación en la anatomía, tamaño y ecología, la gran mayoría de especies es eusociales y vive en colonias; en consecuencia, diferentes especies enfrentan retos visuales similares en términos de navegación hacia adelante y hacia atrás entre un lugar central y los recursos. A través de las hormigas el mismo bauplan ojo básico puede observarse en los animales que van desde 0.5-26 mm de longitud corporal, de exclusivamente diurna a especie estrictamente nocturna y de lento caminar subterráneo a saltar los depredadores visuales6,7, 8,9,10. Todas estas diferencias asombrosas en ecología y comportamiento dan lugar a innumerables permutaciones de las mismas estructuras básicas del ojo para adaptarse a diferentes ambientes, estilos y tamaños de cuerpo11,12. En consecuencia, estudiar la ecología visual de hormigas proporciona un verdadero tesoro de posibilidades al investigador determinado.
Comprensión del sistema visual de los insectos es esencial para ganar una penetración en sus capacidades conductuales. Se trata de estudios integrados que combinan muy bien la anatomía con la ecología y comportamiento de un gran éxito en algunos grupos de insectos (p. ej., referencias13,14,15,16, 17). aunque en general el campo de la navegación de ant y ant comportamiento ha sido absolutamente acertado, ha hecho hincapié muy poca visión de hormiga fuera de unas pocas especies seleccionadas. Aquí, elaboramos las técnicas involucradas en la investigación de diseño ojo de hormigas. Si bien nos centraremos en las hormigas, estas técnicas pueden aplicarse, con ligeras modificaciones, a otros insectos, también.
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Protocol
1. PREPARACION
Nota: Es necesario conocer primero la ubicación relativa del ojo compuesto y ocelos entre sí y en la cabeza. Esto puede lograrse mediante la adquisición de imágenes de la vista dorsal de la cabeza. Para esto, recomendamos el procesamiento de muestras para la microfotografía o utilizando técnicas de SEM. A continuación son los pasos involucrados en ambos procesos.
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Recogida de muestras
- Recoger y almacenar a las muestras directamente en etanol al 70%. Recoger diferentes castas siempre que sea posible.
- Etiquetar las muestras con hora, fecha y lugar así como cualquier otras observaciones relevantes (por ejemplo, recoge al mismo tiempo de forrajeo, apareamiento agregación, jerarquía dentro de una rama, etc.)
- Recoger las suficientes muestras para tener múltiples repeticiones en cada tratamiento.
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Microfotografía y apilado de Z
- Aire seco especímenes y montarlos en punto triangular tarjetas, usando pegamento soluble en agua y luego en un pin de insectos. Para más detalles, véase la referencia18.
- Imagen mediante un estereomicroscopio de alta magnificación con un motor Z-paso a paso y una cámara de color.
- Utilice un difusor para tener iluminación uniforme de las muestras.
- Capturar imágenes en diferentes planos focales y guardar imágenes en un formato sin pérdida (por ejemplo, tiff) y foco pila usando software comercialmente disponible.
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Micrografías electrónicas de barrido
Nota: Limpie a fondo todas las herramientas y las superficies con etanol para evitar la contaminación de la muestra con polvo y otras partículas.- Deshidratar a los especímenes en etanol durante la noche y aire seco en una placa Petri.
- Utilice una cuchilla afilada para separar la cabeza del resto del cuerpo.
- Monte el cabezal en el ángulo de visión necesario (p. ej., dorsal hacia arriba) en los talones de aluminio con cinta conductiva de carbón o las pestañas. Corte la cinta de carbón en tiras finas y doble para apoyar la cápsula principal.
- Utilizar un recubridor sputter para aplicar oro sobre la superficie de la muestra por 2 min a 20 mA con un escenario giratorio. El tiempo y la corriente pueden necesitar ser ajustado dependiendo del instrumento.
- Transferir a las muestras a un nuevo trozo de aluminio con cinta de carbón fresco o pestañas.
Nota: El carbón sin recubrimiento proporcionará un fondo negro pero transferir muestras puede dañar el recubrimiento de oro. - Compruebe que la orientación del espécimen es todavía correcta utilizando un microscopio de disección y ajustar según sea necesario con un par de fórceps fino o herramienta similar. Tenga cuidado de no rayar el recubrimiento dorado; mango lo menos posible.
- Carga de muestras en el soporte de trozo de SEM, tomando nota de la posición de los talones y las muestras entre sí.
Nota: Algunos SEMs cuentan con una cámara de etapa pero muchos no lo son y puede ser difícil localizar a ejemplares pequeños en gran aumento. - Las muestras de la imagen. Utilizar un voltaje de aceleración baja para evitar la carga y una pequeña abertura para la buena profundidad de campo.
Nota: Ajustes se optimizan mejor en consulta con un técnico especializado en el instrumento particular que se utiliza.
2. cuantificar el número de facetas y diámetros
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Réplicas de córnea
- Hormigas de uso conservan en etanol o montada sobre un alfiler para este propósito (paso 1.1.1).
- Montar el animal en un pin de insectos o en plastilina. Si la cabeza es relativamente grande, pueden eliminarse las restantes partes del cuerpo.
- Utilice un perno de insectos o un palillo fino para recoger una pequeña gota de esmalte incoloro de secado rápido y se extendió rápidamente sobre el ojo. Asegúrese de que el pasador no dañar el ojo. El esmalte debe cubrir el ojo entero y algunas de la cápsula circundante de la cabeza.
Nota: Es importante que el esmalte de espesor relativamente uniforme a través de los ojos. - Deja el esmalte de uñas establecer a temperatura ambiente.
- Una vez que esté totalmente, utilice un alfiler insectos fino para levantar suavemente la réplica de la cápsula principal que rodea el ojo.
- Use un buen par de pinzas limpias para levantar la réplica, tome la parte de la réplica que cubre la cabeza y no el ojo.
- Asegurar el conocimiento de la orientación del ojo: la región anterior, posterior, dorsal y ventral.
- Lugar la réplica sobre un portaobjetos de vidrio. Utilice una cuchilla para recortar la réplica quitando cuidadosamente el material sobrante alrededor del ojo. Utilizar una aguja o unas pinzas para evitar la réplica de la mudanza.
- Si el ojo es muy convexo, utilice una cuchilla para realizar 3-4 finas incisiones radiales parciales alrededor del borde para 'aplanar' la réplica. Si el ojo es relativamente 'plano', no hay para realizar dichas incisiones.
- Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la réplica de ojo, asegurando que la orientación de la réplica es conocida. No aplique presión como esto puede eliminar la impresión corneal en el esmalte de uñas.
- Sellar el cubreobjetos con muy poco esmalte en cuatro esquinas. Si el esmalte de uñas fluye entre el cubreobjetos y portaobjetos de vidrio, se dañará la réplica.
- Imagen de la diapositiva en un microscopio compuesto.
Nota: Si sólo algunas facetas están en foco, entonces esto sugiere que la réplica de ojo no es aplanada bastante. Descarte y empezar de nuevo desde el paso 2.1.3. - Importar la imagen a disposición programas como ImageJ/Fiji donde pueden medirse el número de ommatidia y tamaño de cada ommatidia.
Nota: Este método se puede utilizar para elaborar réplicas de ocelos, demasiado. Puesto que es una sola lente, recomendamos mantener los ocelos juntos en una réplica.
3. analizar la estructura del ojo
Nota: Para estudiar la anatomía del ojo requiere en la mayoría casos dos complementarias técnicas de LM y TEM. Las etapas de procesamiento inicial requieren técnicas similares para LM y TEM. La diferencia surge de la etapa seccionamiento. Procesamiento de las muestras requiere el uso de productos químicos peligrosos que deben ser manejados con cuidado y descarta responsablemente. Utilizar equipo de protección personal, trabajar en una campana de humos, siempre leer el sheets(SDS) de datos de seguridad y llevar a cabo evaluaciones de riesgo antes de comenzar.
- Disección
- Anestesiar a las muestras por enfriamiento o por la exposición a gases CO2.
- CO2 anestesia es muy rápido (generalmente menos de 1 min) y debe tenerse cuidado para evitar la sobreexposición como esto puede resultar en la muerte del espécimen. Si se utiliza hielo seco en pelets (solid CO2) Evite el contacto directo con las muestras ya que esto puede causar quemaduras de frío.
- Frío anestesia es más lenta; 4 ° C es suficiente, y no se recomiendan temperaturas más frías. Establecer un tiempo de enfriamiento adecuado para las especies. Requieran grandes o frío resistente a hormigas como las hormigas Toro > 10 min a ser completamente inmovilizados, mientras que especies más pequeñas pueden necesitar solamente 1-2 min de enfriamiento excesivo matará la muestra (evitar el contacto directo con el hielo). Muestras deben preferiblemente celebradas en envases pequeños, cierre hermético de espuma, plástico y colocadas en una nevera donde puede observar en lugar de una eléctrica refrigerador o congelador.
- Coloque el espécimen en una caja Petri y ajuste para su visualización en un microscopio de disección. Rápidamente es importante para preservar la anestesia y para evitar la degeneración de los tejidos una vez que se realizan incisiones (este poder) ocurren dentro de segundos.
- Eliminar antenas con fórceps. Si trabaja con una picadura de insectos, conviene amputar el gaster primero para evitar ser picado.
- Quitar las partes de la boca con una afilada hoja de afeitar; pueden usarse pinzas para sostener a la muestra hacia abajo. Corte a través de la parte anterior del ojo (muestras grandes) o como a los ojos como sea posible (muestras pequeñas) sin tirones en el cerebro ya que esto pueden desgarrar la retina.
- Se preparan para abrir la cápsula de la cabeza. La muestra del ángulo para que la primera incisión es hacia arriba; Esto se puede hacer ya sea con el microscopio de disección mientras se mantiene a la muestra en fórceps o bajo control visual manteniendo la muestra entre el dedo pulgar y el primer plano.
- Hacer una incisión transversal a través de la cabeza para eliminar la porción ventral de la cabeza; parte del ojo ventral puede ser quitada de grandes especies para mejorar la fijación y la infiltración. La cabeza debe todavía fijarse al cuerpo en este momento.
- Cortar la cápsula de la cabeza del cuerpo realizando una incisión coronal justo posterior al ojo compuesto.
- Coloque la cápsula cabeza disecada con los ojos compuestos en fijador frío de hielo: 2.5% glutaraldehído y 2% paraformaldehído en tampón fosfato (pH 7,2-7,5).
PRECAUCIÓN: El fijador es corrosivo y tóxico; usar protección adecuada y trabajar en una campana de humos.
Nota: Es importante trabajar rápidamente para detener la degeneración del tejido neural. La disección debe ser completado en 2 minutos o menos (disección eficiente puede requerir algo de práctica).
Nota: Si el ojo debe adaptarse a las condiciones luminosas u oscuras, entonces primero exponer a los animales a la condición necesaria de la luz por unas horas. Llevar a cabo las disecciones en las respectivas condiciones de luz. Disecciones pueden realizarse bajo luces rojas para simular la oscuridad.
- Anestesiar a las muestras por enfriamiento o por la exposición a gases CO2.
- Procesamiento de muestras
- Mantener a las muestras en el fijador a temperatura ambiente con movimiento en un agitador orbital, para muestras grandes de 2 h. pueden requerir tiempos más largos de la fijación.
- Retirar el fijador y deséchelo adecuadamente. Lavar a las muestras en temperatura de tampón fosfato (3 veces, 5 minutos cada uno) en la coctelera.
Nota: El tampón fosfato se compone de 8 g NaCl 0,2 g KCl, 1,44 g de Na2HPO4y g 0,244 KH2PO4 en 1 L de agua destilada H2O (pH 7.2). - Retirar el tampón fosfato y añadir 2% OsO4. Coloca el frasco de muestras en la coctelera en la campana para 1-2 h. Este es un paso de la fijación para fijar las grasas y también proporcionan contraste para TEM.
Nota: Tiempos de fijación de osmio son sujetos a tamaño de la muestra; como una regla del pulgar áspera, calcular 1 h de fijación por 1 mm3. - Retirar la solución de osmio y disponer de ella adecuadamente. Lavar a las muestras en el búfer de temperatura (3 veces, 5 minutos cada uno) en el agitador.
- Deshidratan a las muestras colocándolas en el aumento de las concentraciones de etanol o acetona; por ejemplo, 50, 70, 80 y 95% por 10 min y finalmente 100% (2 veces, 15 minutos cada uno). Coloque a las muestras en el agitador entre los cambios de la solución.
Nota: Si es necesario, muestras pueden ser conservadas en etanol al 70% durante la noche. - Escurrir el etanol y añadir acetona al 100%. Dejarlo durante 20 minutos en el agitador (saltar este paso si deshidratación en acetona). Reemplace con acetona fresca y dejarlo por una 20 min adicional.
- Infiltrarse en los tejidos con la resina usando los siguientes cocientes de acetona para resina: 2:1 (3 h), 1:1 (noche), 1:2 (4 h) y puro de la resina (la noche). En cada paso dejar a ejemplares en el agitador dentro de la campana de humo y la tapa el contenedor para todos pero los dos últimos pasos.
Nota: La resina es demasiado viscosa para drenar por lo que las muestras se deben mover a un nuevo contenedor desechable en cada paso. - Preparar bloques para montar las muestras. Bloques pueden ser personalizados por el vidrio de acrílico de corte en pequeños bloques rectangulares (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). También puede ser hecho por verter la resina de epoxy (hay muchos kits comerciales disponibles) en un molde de silicona y luego la cura en el horno durante 12-14 horas a 60 ° C.
PRECAUCIÓN: Resina no polimerizada (líquida) es cancerígeno y debe devolverse al horno hasta que totalmente endurecido. - Coloque verticalmente el bloque en el molde. Cuidadosamente tome a las muestras de la resina líquida, permiten drenar el exceso de resina y coloque al espécimen en la parte superior del bloque. Una pequeña cantidad de resina adicional puede utilizarse para la muestra se unen al bloque.
- El bloque de etiquetas. Imprimir las etiquetas de papel e incrustarlo en el bloque o adjuntarlo a una cara del bloque.
- Mantenga el molde con los bloques integrados en el horno durante 12-14 horas a 60 ° C.
- Guarde el bloque de muestra en una envoltura limpia. Esto puede guardarse de esta manera durante varios meses a años.
- Deje los envases usados, guantes sucios y otros equipos contaminados en la campana para permitir que la acetona se evapore completamente (mínimo 12 h).
- Resina de curado en el horno antes de desechar equipos desechables o raspar la resina de otros elementos como pinzas.
- De seccionamiento
- Observar el bloque con el microscopio de disección para asegurar que la orientación de la muestra es apropiada para el plano de seccionamiento.
- Si la orientación no es apropiada, use Sierra de joyero para cortar la muestra y reorientar mediante fragmentos de set resina y resina fresca para reponer al ejemplar. La cabeza también puede dividirse en dos mitades a la sección de los dos ojos por separado. Curación de resina otra vez antes de proceder.
- Monte el bloque en el portabrocas del micrótomo extraíble. Retire el portabrocas y colocar sobre soporte.
- Corte el bloque de resina usando una cuchilla de afeitar con el microscopio de disección.
PRECAUCIÓN: No hacer esto cuando la tirada está montado en el brazo de micrótomo como puede sacudir el brazo y dañar los cojinetes. - Vuelva a montar el portabrocas sobre el brazo del microtomo y ángulo de la muestra.
- Monte la cuchilla en el soporte en el ángulo adecuado (0° de cristal cuchillos, consulte las instrucciones del fabricante de cuchillas de diamante).
Nota: Cuchillos de cristal se pueden hacer barato con un fabricante de cuchillos de cristal pero deben sustituirse periódicamente como pierden su borde; cuchillas de diamante de alta calidad se pueden comprar pero son caros, requieren un cuidado especial y no son adecuados para principiantes. - Llenar el bote de cuchillo con agua destilada utilizando una jeringa equipada con un filtro (tamaño de poro de 0.45 μm).
- Llenar el barco hasta el nivel del agua alcanza el borde de la cuchilla; el menisco puede ser convexo en otras áreas del barco.
- Drene el barco hasta que el menisco es muy ligeramente cóncavo, pero todavía alcanza el borde de la cuchilla. El nivel del agua puede ajustarse en cualquier momento pero siempre lejos del borde de la cuchilla.
- Traer el cuchillo hacia el espécimen y alinear el bloque a la cuchilla cuidadosamente. Se recomienda hacerlo poco a poco, periódicamente comprobando la proximidad del cuchillo a través del ocular y del lado.
Nota: Revise el manual del instrumento para obtener instrucciones específicas como instrumentos varían. - Establecer el espesor de la sección en el micrótomo. Seleccionar el espesor correcto será dependiente en tamaño de muestra, región de interés y el tipo de cuchillo se utiliza.
- Si con un cuchillo de vidrio selecciona un ajuste más alto (p. ej., 4 μm), si una gran cantidad de material debe ser corte antes de llegar a la zona de interés. Si se utiliza una cuchilla de diamante o si la muestra es muy pequeña, 1-2 μm pueden ser más apropiados.
- Iniciar el "corte" (que pone la rueda de micrótomo) cuando el cuchillo está cercano pero no cortar la muestra para realizar la última parte de la estrategia. Secciones deben comienzan a aparecer dentro de unas pocas rotaciones; Si no es así, detener y llevar con mucho cuidado el cuchillo un poco más.
- Ajustar la sección recolección de espesor (1 μm para secciones semi-delgadas) cuando acercarse a la región de interés.
- Recoger las secciones utilizando una herramienta de pestañas.
Nota: Herramientas de la pestaña pueden hacerse con una pestaña montada en un palito con esmalte de uñas. - Si hay que sacar mucho material, permiten las secciones acumular y eliminar masivamente por quitar el cuchillo y el barrido hacia fuera con agua. Si utiliza una cuchilla de vidrio, esto puede ser un momento adecuado para cambiar a una nueva sección del cuchillo o una navaja nueva.
- Lugar una serie de pequeñas gotas de agua destilada en un portaobjetos con una pipeta Pasteur o idealmente, el filtro dispone de jeringa.
- Flotador con cuidado la sección recogida en la pestaña sobre la gota de agua.
- Recoge secciones como esta hasta que es apropiado comprobar la profundidad de corte.
Nota: Aunque puede ser tedioso, siempre es mejor consultar a menudo. - Coloque el portaobjetos en la placa caliente a 60 ° C. Permita que toda el agua se evapore y la sección a la diapositiva.
- Teñir las secciones con toluidina azul para 10-60 s (tiempo la coloración dependerá del espesor de la sección). Distribuir el tinte con una jeringa equipada con un filtro (como arriba).
- Coloque una gota de colorante en un extremo de la diapositiva y extenderlo con el lado de la aguja sin tocar ni rascar las secciones. Colocar el portaobjetos en la placa de aproximadamente 10-20.
- Enjuagar el portaobjetos rociando con agua destilada en un frasco lavado y colocar en el plato de caliente para secarla.
- Ver bajo el microscopio compuesto y les de la imagen.
- Repita hasta que se alcanza la región de interés.
- Para secciones ultra delgadas: establece el grosor de corte entre 40-60 nm para recoger secciones TEM.
- Corte de secciones 3-5 y espesor de verificación utilizando una carta de colores de interferencia. Las secciones deberían reflejar gris claro cuando se ve en un ángulo.
Nota: Los vapores de cloroformo se pueden pipetearse en secciones para relajarse cualquier pliegues. Esto es más relevante para los usuarios experimentados y principiantes no necesitan preocuparse. Demasiado cloroformo lanzado demasiado cerca a la sección puede dañar las secciones. - Recoger una cuadrícula de ranura Formvar recubierto, cobre, sostenida con pinzas con la parte de Formvar. Tenga cuidado de no perforar el revestimiento de Formvar.
- Sumerja la rejilla en el barco polacos y de las secciones, a continuación, llevar la rejilla encima de paralelo a la superficie en las secciones. Si es necesario utilice la pestaña guía las secciones sobre la rejilla.
- Limpie cuidadosamente alrededor de la punta de las pinzas con papel de filtro para absorber agua atrapada entre los brazos. Si esto no se hace, agua tensión puede tire de la rejilla entre los brazos o hacer pegarse a un lado. Esto puede resultar en contaminación o daños mecánicos.
- Cuidadosamente Quite exceso del agua de la red sí mismo de pie la rejilla polacos en papel de filtro.
- Coloque la parrilla en un soporte de red.
- Repita hasta que se han recogido bastantes secciones.
- Secciones semi-delgadas pueden ser reflejadas directamente con cualquier microscopio compuesto equipado con una cámara. Aceite de inmersión puede ser colocado directamente sobre las secciones. Portaobjetos deben ser almacenados en una caja deslizante para evitar que se decolore.
- Coloración ultra finos de la sección de contraste TEM
Nota: Los siguientes pasos deben llevarse a cabo bajo cubierta como los tintes son luz y CO2 sensibles. Además, EM tintes usan metales pesados para producir contraste y por lo tanto son sustancias peligrosas. Debe ser apropiado cuidado al manipular estas manchas.- Cubrir unos grandes platos de Petri con papel de aluminio para bloquear la luz. Trabajar bajo estos siguientes pasos. Descubrir parcialmente para permitir espacio de trabajo, pero volver a colocar las cubiertas tan pronto como sea posible.
- Cortar un trozo de la película de cera y con cuidado coloque cinco gotas de acetato de uranilo 6% saturado en él mediante una pipeta Pasteur.
- Para preparar la solución, mezcle 2 g de acetato de uranilo con 100 mL de metanol de 50% en agua destilada y filtrar la solución antes de usar. La solución no se puede almacenar y debe hacerse fresca cada vez19.
- Cuidadosamente levante las rejillas TEM con fórceps y el equilibrio encima de gotas del tinte con el lado de la sección hacia abajo. Dejar durante 25 minutos.
- Enjuague las rejillas individualmente sumergiendo rápidamente les dentro y fuera de agua destilada; progreso a través de cuatro diferentes frascos de agua destilada.
- Coloque cinco gotas de citrato de plomo en un fresco pedazo de película. Arreglar unas pastillas de NaOH alrededor de las gotitas de colorante (absorbe el CO atmosférico2 para evitar la precipitación de carbonato de plomo).
- Para hacer la solución de citrato de plomo, preparar 0,5 h. permita que el agua se enfríe y en un recipiente precintable, añadir citrato de plomo de 0.3 g a 100 mL de agua bidestilada agua bidestilada, agua destilada hirviendo. Añadir 1 mL de 10 M NaOH, sellar bien el envase y agitar hasta disuelto19.
- Coloque las rejillas en las gotas de colorante como se describe en 4.3 y la cubierta. Teñir durante 5 minutos.
- Enjuague en agua destilada como antes por inmersión de las cuadrículas dentro y fuera del agua destilada 20 veces. Progreso a través de tres vasos de agua destilada.
- Tomar exceso de agua con papel de filtro y permitir las rejillas secar en una caja de rejilla.
- Imagen de un TEM a bajo voltaje de aceleración.
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Representative Results
Los métodos aquí descritos permiten el estudio detallado de los simples y ojos compuestos de las hormigas. Vista dorsal de la cabeza usando técnicas de microfotografía Z-stack de imágenes permite obtener una visión general de la disposición del sistema visual (figura 1). Se trata de una buena preparación para disecciones y para determinar el ángulo requerido de seccionamiento. Esta técnica también es útil para la toma de medidas tales como la anchura de la cabeza, longitud ojo y lente ocellar diámetros. Proyección de imagen de SEM también ofrece imágenes de descripción detallada pero además permite la adquisición de alta magnificación e imágenes de alta resolución. Determinadas regiones de interés en el ojo pueden ser examinadas en detalle y las variaciones en la forma de la lente pueden ser identificados (figura 2). Imágenes de SEM son especialmente útiles para la resolución de las hormigas con pequeños ojos y ocelos. Las réplicas de córnea proporcionan información sobre la forma, tamaño y número de lentes en cada ojo (figura 3). Secciones semi-delgadas reflejadas mediante técnicas de LM permiten investigación del bruta anatomía interna del ojo (figura 4 y figura 5); Esto incluye el espesor de la lente, el diámetro del cono cristalino, presencia de un tracto de cono cristalino, forma, ancho y longitud del rhabdom, traz el área del borde dorsal y la ubicación de las células del pigmento primarias y secundarias. Esta técnica puede ser muy bien complementada por secciones ultra delgadas reflejadas mediante TEM, que permite determinar la ultraestructura especialmente, la orientación microvillar (figura 4) y la cuantificación de estructuras más pequeñas (por ejemplo, ancho de las vías estrechas cono cristalino, figura 5).
Figura 1: Microfotografías de Z-stack de las tres castas de la hormiga de azúcar Australia, Camponotus consobrinus.. Esto proporciona una visión general de la disposición del sistema visual en todas las tres castas. Adaptado de la referencia20. Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de micrografías electrónicas del sistema visual y demostrando las capacidades de proyección de imagen de esta técnica. Fila superior muestra ojo diferentes posiciones y tamaños de ojos en: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; y (C) Amblyopone australis (observe la flecha de ojos muy pequeños, blancos). Imágenes adquiridas en gran aumento mostrando: (D) los tres ojos simples en trabajadores de Myrmecia nigriceps; diferentes tamaño de ojo compuesto en (E) Rhytidoponera metallica (tenga en cuenta las diferentes forma de ommatidia en diferentes regiones del ojo compuesto en amarillo), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkiy () especie Pheidole . Barras de escala = 1 mm (A-C), 100 μm (D-H), 10 μm (I). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: réplicas de la córnea del ojo de hormiga y ocelos. (A) réplica del ojo compuesto de un trabajador de Myrmecia nigriceps. La réplica convexa fue aplanada haciendo incisiones. El recuadro indica posterior (p), anterior (a) y dorsal (d), ejes de ventral (v). (B) la réplica de los ocelos de trabajador de Myrmecia tarsata. Barras de escala = 0,5 mm (A), (B) de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: EM y LM imágenes de cortes transversales rhabdom. (A) corte transversal de rhabdoms distales en Myrmecia nigriceps tinción de toluidina azul se puede utilizar para distinguir rhabdoms que son circulares o rectangulares en forma. Ver micrografías de transmisión: (B) múltiples orientaciones de microvellosidades en el rhabdom circular y microvellosidades (C) orientan en dos direcciones opuestas en el rhabdom en forma rectangular. (D) usando microscopia ligera, el eje largo de las rhabdoms rectangulares se asignan para mostrar una organización de abanico en la región dorsal del ojo en una reina de Camponotus consobrinus.; recuadro indica posterior (p), anterior (a) y lateral (l), ejes intermedio (m). Panel D adaptado de la referencia20. Barras de la escala = 10 μm (A), 1 μm (B-C), 100 μm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imágenes de la EM y LM de un ommatidium en un ojo adaptado a la luz de Myrmecia tarsata. (A) sección Longitudinal de un ommatidium mostrando la córnea (C), cono cristalino (CC), zona de cono (ct), rhabdom (Rh) y primaria células del pigmento (PPC). (B) Dashed rectangular caja de panel A una sección diferente vistas bajo un TEM para cuantificar la anchura estrecha de la zona de cono. Adaptado de referencia21. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: problemas comunes con secciones semi-delgadas y ultrafina (fijación y la infiltración, corte y tinción). (A) pobre fijación del tejido debido a la insuficiente penetración (flecha) en semifino de Pheidole especies; (B) ripeo durante el seccionamiento en Iridomyrmex calvus (semi fina); (C) perfecta coloración (izquierda) y por coloración (derecha) con toluidina azul en Myrmecia croslandi; (D) pigmento (círculo) y tejido ripeo durante el seccionamiento (flechas) debido al pobre juego de la densidad del tejido y resina (resina demasiado suave). Plegable de la sección (asteriscos), pasa al recoger secciones del barco de cuchillo; (E) pobres de contraste debido a la insuficiente coloración (Comparar con el de la inserción), citrato de plomo cristales (flechas blancas) de la exposición a CO2y cuchillo vertical marcan (flechas negras); (F) los agujeros en el tejido (flechas blancas) causada por la mala fijación de un ojo compuesto de Melophorus hirsutus ; (G) resina demasiado suave, conduce a gorjeos cuando secciones como ondulaciones verticales de la sección; (H) sección demasiado grueso (~ 100 nm) dio lugar a la imagen oscura, con poco contraste, contaminado agua destilada plomo a las bacterias y partículas dispersas a lo largo de la sección (flechas blancas) en especie Pheidole . Barra de escala = (A-B) de 25 μm, 10 μm (C-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El conjunto de los métodos señalados anteriormente permiten una investigación efectiva sobre el sistema óptico de hormigas y otros insectos. Estas técnicas informar a nuestra comprensión de la resolución de muestreo, sensibilidad óptica y sensibilidad potencial de polarización del ojo en estudio. Este conocimiento proporciona una base importante para la investigación fisiológica y de comportamiento en sus capacidades visuales. Además, mientras que los métodos detallados aquí se han centrado en los sistemas hormiga, estas técnicas pueden ser utilizadas en otros insectos, aunque con ligeras modificaciones en el protocolo (p. ej., aumento de la duración de la fijación y la infiltración en los tejidos más gruesos) . Protocolos ligeramente modificados se han utilizado para caracterizar los sistemas visuales de una gran variedad de insectos incluyendo las cigarras22, moscas14,23de las abejas, avispas24, mariposas25y polillas26. Aunque la mayoría de las técnicas descritas aquí han estado en uso por algún tiempo, este artículo tiene la oportunidad de reunirlos en el contexto del estudio de sistema óptico de la hormiga y comparar técnicas alternativas y describir errores comunes.
Hay muchas técnicas de imagen actualmente disponibles que tienen superposición de aplicaciones y puede ser difícil determinar qué técnica es apropiada para la tarea. Un ejemplo relevante aquí es elegir una técnica de proyección de imagen de resumen. La morfología externa de la cabeza y el ojo y la colocación relativa del sistema óptico en la cabeza pueden hacerse usando SEM o microfotografía. Las fortalezas y debilidades de estas técnicas han sido ha comentado27, sin embargo, hay algunas consideraciones especiales cuando los ojos de la proyección de imagen. Cuando la posición relativa y tamaño de los ojos la proyección de imagen, ambas técnicas tienen sus ventajas y desventajas. Imágenes SEM carecen de información de color y por lo tanto, cuando la pigmentación es relevante microfotografía es mejor. Sin embargo, imágenes de SEM pueden ilustrar estructuras finas como pelos entre ommatidial y límites de la faceta más detalladamente e incluso revelan características de superficies no visibles con técnicas de microfotografía (p. ej., lentes ocellar, escultura de la superficies lentes de ojo compuesto). SEM es una técnica versátil cuando se trata de exploratorio imágenes e identificar características de interés debido a que puede funcionar en una amplia gama de tamaños de muestra conservando en toda esta gama de muy alta resolución. Sin embargo, no es tan ampliamente accesible como un microscopio de disección y requiere un mayor nivel de conocimientos. A menudo no es solo forma de obtener la información que uno requiere. En tal escenario, es útil considerar lo que hay disponible y donde es más importante invertir recursos.
Réplicas de esmalte de uñas de la córnea han demostrado para ser más útil en la obtención de la medida más precisa del número de faceta y faceta diámetros. Ahora se ha utilizado en una variedad de insectos11,22,28,29. Mientras la calidad de las imágenes adquiridas de un SEM es muy superior, la curvatura del ojo evita las medidas exactas de la matriz de toda faceta. Asignación del tamaño de faceta y faceta distribución también debe ser factible de las exploraciones de la tomografía micro computada5.
En técnicas de la LM y el TEM, a menudo es difícil saber si la muestra ha sido preparada y procesada hasta la etapa final de la proyección de imagen. Para evitar complicaciones, es importante establecer buenas prácticas tales como mantener limpio trabajo espacios y herramientas, preparar soluciones frescas regularmente y bien filtrado agua. Contaminantes que son invisibles para el ojo desnudo pueden arruinar las muestras EM. Por esta razón, puede ser útil limpiar las superficies e instrumentos utilizando un solvente como etanol o acetona y un trapo sin pelusa produciendo. Esto es más relevante cuando secciones, secciones de EM, la coloración y preparación de muestras SEM. Asimismo, fuentes de agua destilada pueden presentar problemas e introducir contaminantes por lo que siempre es mejor comprobar los filtros, cambiarlos regularmente y utilice siempre agua recién filtrada (no tienda). Mayoría de fijadores, manchas y materiales incrustación no se puede almacenar indefinidamente y es importante que todas las soluciones con la fecha de realización de la etiqueta. Es importante adoptar un enfoque sistemático y apartar suficiente tiempo para llevar a cabo protocolos sin interrupciones.
Adaptación de técnicas a diferentes especies siempre es una cuestión de ensayo y error. Cuando se trabaja dentro de Formicidae, las principales diferencias radica en el tamaño del animal y la masa muscular dentro de la cabeza. Hormigas con más musculatura en la cabeza normalmente tomará más tiempo para solucionar. Con hormigas muy grandes, es mejor quitar los músculos mandibulares, tráquea y glándulas mandibulares, asegurando mínima interferencia con el tejido neural. Hormigas pequeñas y con pocos músculos mandibulares, es posible lograr la fijación adecuada simplemente quitando las mandíbulas y exponer la región clypeal. En estos casos, se pueden hacer pequeños agujeros utilizando pernos de minucias en la cabeza para mejorar la fijación.
Es importante tener en cuenta que las condiciones ambientales también pueden afectar los preparativos. Ambientes calientes y húmedos (sobre todo estaciones de campo en los trópicos) pueden resultar un desafío durante la etapa de infiltración. Condiciones cálidas pueden llevar resinas parcialmente polimerizarse prematuramente, dando como resultado en la resina convertirse en cada vez más viscoso. En este caso, la mejor opción es almacenar la resina en pequeño, de un uso, envases en el refrigerador o el congelador. Fijadores de enfriamiento puede ayudar a la descomposición de tejido más rápido contador en condiciones cálidas. Sin embargo, soluciones refrigeradas dispersan más lentamente lo que significa que los tiempos de tratamiento deberían extenderse para asegurar la penetración correcta.
Con estas precauciones en mente, la investigación en el sistema óptico de hormigas y otros insectos puede resultar muy gratificante. Estudia el sistema visual nos permite estimar el tamaño de los campos visuales, ángulos interommatidial, sensibilidad óptica y resoluciones de muestreo. Comprensión de la anatomía del ojo informa nuestra comprensión e interpretación del comportamiento animal. Por ejemplo, anatomía nos permite hacer predicciones sobre la capacidad visual de los animales como si son diurnas o nocturnas, que puede no haber sido documentado previamente. Dado el conocimiento actual sobre el sistema visual de puñado de hormigas, esperamos que inspiren a nuestros métodos de biólogos y myrmecologists para investigar los ojos compuestos y ocelos en las hormigas para mejorar nuestra comprensión.
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Disclosures
Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Estamos agradecidos a Jochen Zeil, Paul Cooper y Birgit Greiner para compartir sus conocimientos en anatomía de insecto y para la demostración de varias de las técnicas que hemos descrito aquí. Agradecemos al personal de apoyo y talento en el centro de microscopía avanzada en ANU y la unidad de microscopía en MQU. Este trabajo fue financiado por una beca de posgrado a FRE y becas del Consejo australiano de investigación (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
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