Summary
Эта статья конспектирует набор методов в свет и электронной микроскопии для изучения анатомии внутренних и внешних глаз насекомых. К ним относятся несколько традиционных методов, оптимизированы для работы на муравей глаза, подробно устранение неполадок и предложения по оптимизации для различных образцов и областей, представляющих интерес.
Abstract
Эта статья конспектирует набор технологий в светлую микроскопию (LM) и электронной микроскопии (EM), которые могут быть использованы для изучения анатомии внутренних и внешних глаз насекомых. К ним относятся традиционные Гистологические техники оптимизирован для работы на глазах муравьев и адаптированы для работы во взаимодействии с другими методами просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и растровая электронная микроскопия (SEM). Эти методы, хотя значительно полезным, может быть трудно для новичка микроскописта, поэтому большой акцент в этой статьи по устранению неполадок и оптимизации для различных образцов. Мы предоставляем информацию о методы визуализации для всего образца (Фото микроскопия и SEM) и обсудить их преимущества и недостатки. Мы выделить метод, используемый при определении диаметра объектива для весь глаз и обсудить новые методы для улучшения. И наконец, мы обсуждаем методы подготовки образцов для LM и ТЕА, секционирование, окрашивание и эти примеры работы с изображениями. Мы обсуждаем с барьерами, которые одно может прийти через при подготовке проб и как лучше всего перемещаться вокруг них.
Introduction
Зрение является важным сенсорные механизм для большинства животных. Видение это особенно важно в контексте навигации для pinpointing целей, установления и соблюдения маршрутов и получения компас информации1,2. Насекомых обнаружить визуальной информации с помощью пары Составные глаза, и, в некоторых случаях, одного-трех дорзально помещены простые глаза под названием глазки3,4,5.
Особый интерес представляют глазах муравьев, потому что, в то время как муравьи являются удивительно разнообразны, они сохранить некоторые ключевые характеристики различных видов. Несмотря на драматические изменения в анатомии, размер и экологии подавляющее большинство видов являются эусоциальных и живут в колониях; в результате различных видов сталкиваются с аналогичными проблемами визуальные с точки зрения навигации взад и вперед между центральное место и ресурсами. Через муравьи же основные глаз bauplan можно наблюдать в животных, начиная от 0,5-26 мм, длина тела, от исключительно суточные для строго ночной вид и от медленной ходьбы подземные прыгали визуальные хищников6,7, 8,9,10. Все эти ошеломляющие различия в области экологии и поведения порождают бесчисленные перестановки же основные глаз структур с учетом различных сред, образ жизни и размеров тела11,12. Как следствие изучая визуального экологии муравьи предоставляет настоящую кладезь возможностей определяется следователю.
Понимание зрительной системы насекомых имеет важное значение в получении проницательность в их поведенческих возможностей. Это видно из комплексных исследований, которые красиво сочетать анатомии с экологии и поведения на большой успех в несколько групп насекомых (например, ссылки на13,14,,1516, 17). Хотя в целом области перехода ant и поведение муравьёв был довольно успешным, очень мало упор на видение муравей вне несколько отдельных видов. Здесь мы будем распространяться на методах, используемых в расследовании глаз дизайн муравьев. Хотя мы сосредоточимся на муравьев, эти методы могут применяться, с небольшими изменениями, для других насекомых, тоже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образца
Примечание: Это необходимо сначала понять относительное расположение составного глаза и глазки друг к другу и по голове. Это может быть достигнуто путем приобретения изображений спинной мнение руководителя. Для этого мы рекомендуем обработки образцов для Микрофотография или с помощью SEM методы. Ниже шаги принимают участие в обоих процессах.
-
Образцы коллекции
- Собирать и хранить образцы непосредственно на 70% этиловом спирте. Сбор различных каст, когда это возможно.
- Ярлык образцов с время, Дата и место, а также любые другие соответствующие замечания (например, собранных во время нагула, спаривания агрегации, гнездятся внутри ветки и т.д.)
- Соберите достаточное количество образцов иметь несколько реплицирует в каждом лечения.
-
Микрофотография и Z-укладчик
- Воздух сухой образцы и смонтировать их на треугольной точка карты, с помощью клея растворяется в воде, а затем на насекомых PIN-код. В разделе Ссылка18.
- Изображение с помощью большого увеличения стереомикроскопом с Z-шаговый двигатель и цветные камеры.
- Используйте диффузор равномерное освещение для образцов.
- Захват изображения на различных фокальной плоскости и сохранять изображения в формате без потерь файла (например, tiff) и фокус стек им с использованием имеющегося программного обеспечения.
-
Сканирование электронной микроскопии
Примечание: Тщательно очистите все инструменты и рабочие поверхности с этанолом, чтобы избежать загрязнения образца с пыли и других частиц.- На ночь обезвоживаются образцов в этаноле и воздух сухой в чашке Петри.
- Используйте острые лезвия бритвы для разделения головы от остальной части тела.
- Установите головку на требуемый угол (например, спинной вверх) на алюминиевой заглушки с использованием проводящих углерода ленты или вкладки. Нарезать тонкими полосками углерода ленты и складывать его для поддержки головной капсулой.
- Используйте распыления нанесения покрытий для применения золота на поверхности образца на 2 мин 20 мА с поворотный этап. Ток и время может потребоваться корректироваться в зависимости от инструмента.
- Передача образцов новой алюминиевой заглушку с свежими углерода ленты или вкладки.
Примечание: Немелованной углерода будет предоставлять черный фон, но передачи образцов может повредить золочения. - Проверьте ориентацию образца до сих пор под микроскопом рассечения и корректировать по мере необходимости с парой тонкой щипцами или подобный инструмент. Заботиться, чтобы не поцарапать Золотое покрытие; Дескриптор как можно меньше.
- Загрузить образцы на держателя заглушку SEM, делая к сведению позицию заглушки и образцы относительно друг друга.
Примечание: Некоторые SEMs оборудованы с камерой стадии, но многие из них не и это может быть трудно найти небольшие образцы с высоким увеличением. - Изображения образцов. Используйте низкий ускоряющего напряжения, чтобы избежать зарядки и малой апертурой для хорошей глубины резкости.
Примечание: Параметры лучше оптимизированы в консультации с техник специализируется в частности инструмент, который используется.
2. количественного аспекта чисел и диаметров
-
Роговицы реплик
- Используйте муравьи сохранились в этанол или монтируется на ПИН-код для этой цели (шаг 1.1.1).
- Смонтировать животное на насекомых ПИН или пластилином. Если руководитель является относительно большим, остальные части тела может быть удалены.
- Использование насекомых pin или тонкой зубочистку подобрать небольшое падение Быстросохнущий бесцветный лак и быстро распространился на глаз. Убедитесь, что ПИН-код не царапает глаз. Лак для ногтей должен охватывать весь глаз и некоторые из окружающих головной капсулы.
Примечание: Важно, что лак быть относительно равномерную толщину через глаза. - Оставьте Лак для задания при комнатной температуре.
- После того, как он полностью установлен, используйте штраф насекомых ПИН для осторожно поднимите реплики из головной капсулы вокруг глаз.
- Используйте пару прекрасные чистые пинцет поднять реплики, чтобы захватить часть реплики, которая покрывает голову и не глаза.
- Обеспечение осведомленности о ориентации глаза: передняя, задняя, спинной и брюшной области.
- Место реплики на стеклянное скольжение. Используйте лезвие бритвы обрезать реплики, тщательно удалив избыток материала вокруг глаз. Используйте иглы или пару щипцы для предотвращения перемещения реплики.
- Если глаза очень выпуклые, используйте лезвие бритвы сделать 3-4 штрафа частичной Радиальные разрезы вокруг края чтобы помочь «сгладить» реплики. Если глаза относительно «плоский», не нужно делать такие надрезы.
- Место крышку выскальзования мягко на глаз реплики, обеспечивая, что ориентация реплики известен. Не прикладывайте давление, как это можно устранить роговицы впечатление на лак.
- Печать coverslip, с помощью очень мало лак на четырех углах. Если лак потоков между крышку выскальзования и стеклянных скольжениях, это повредит реплики.
- Изображение слайда на составной микроскоп.
Примечание: если лишь некоторые аспекты в фокусе, то это говорит о том что реплика глаз не выравнивается достаточно. Сбросить и снова начать с шага 2.1.3. - Импорт изображения в свободно доступных программ, таких как ImageJ/Фиджи, где количество фасеточном и размер каждого фасеточном могут быть измерены.
Примечание: Этот метод может использоваться для подготовки реплики глазки, тоже. Поскольку это один объектив, мы рекомендуем, сохраняя все глазки вместе в одной реплике.
3. анализ структуры глаза
Примечание: Для изучения анатомии глаза требует в большинстве случаев два взаимодополняющих методов LM и ТЕА. На стадии первоначальной обработки требуют аналогичные методы для LM и ТЕА. Разница возникает из резания стадии года. Обработка образцов требует использования опасных химических веществ, которые должны быть обработаны с осторожностью и отбрасываются ответственно. Использование средств индивидуальной защиты, работать в вытяжного шкафа, всегда читать безопасности данных sheets(SDS) и провести оценку риска перед началом.
- Рассечение
- Обезболивают образцов охлаждения или под воздействием газообразных CO2.
- CO2 наркотизация очень быстро (как правило менее 1 мин) и следует позаботиться о том, чтобы избежать чрезмерного воздействия, как это может привести к смерти образца. При использовании гранулы сухого льда (твердых CO2) Избегайте прямого контакта с образцами, как это может вызвать ожоги холодной.
- Холодные анестезии медленнее; 4 ° C является достаточным, и холодных температур не рекомендуются. Установить соответствующее время охлаждения для видов. Большие или холодной устойчивостью муравьи например бык муравьи могут потребовать > 10 мин, чтобы стать полностью обездвиженных, в то время как меньшие видов может потребоваться только 1-2 мин чрезмерного охлаждения будет убивать образца (Избегайте прямого контакта со льдом). Образцы должны предпочтительно в небольших, пена пробкой, пластиковые контейнеры и помещены в холодильник, где они могут наблюдаться, а не в Электрический холодильник или морозильник.
- Поместите образцы на чашку Петри и настроить для просмотра под микроскопом рассечения. Работа быстро имеет важное значение для сохранения анестезии и избегать дегенерации ткани после надрезы (это может произойти в течение нескольких секунд).
- Удаление антенн с щипцами. При работе с язвительные насекомых, желательно ампутировать Гастер сначала для того, чтобы избежать быть задело.
- Удаление частей рот, используя острые лезвия бритвы; может использоваться щипцами удерживать образца. Вырежьте через переднюю часть глаза (большой образцов) или как можно ближе к глаза как можно скорее (небольшие образцы) без дергая на мозг, как это может вырвать сетчатки.
- Приготовьтесь открыть головной капсулой. Угла образца, так что первый разрез кверху; Это может быть сделано либо под микроскопом рассечения удерживая образца щипцами или под визуальным контролем удерживая образца между thumb и передний план палец.
- Сделать поперечный разрез через голову, чтобы удалить брюшной части головы; часть вентральной глаза могут быть удалены в крупных видов для улучшения фиксации и инфильтрации. Руководитель должен еще быть крепится к корпусу на данный момент.
- Север головной капсулы из тела, делая корональных разрез просто кзади составного глаза.
- Место расчлененных головной капсулы с составными глазами в лед холодной фиксатором: глутаровый и 2% параформальдегида 2,5% в фосфатного буфера (pH 7,2-7.5).
Предупреждение: Фиксатор коррозионные и токсичные; Носите надлежащей защиты и работать в зонта.
Примечание: Важно работать быстро, чтобы остановить дегенерация нервных тканей. Вскрытие должно быть завершено в 2 мин или менее (эффективный диссекции может потребовать некоторой практики).
Примечание: Если глаз необходимо адаптировать к условиям яркие или темные, затем первым разоблачить животных в необходимые условия освещения на несколько часов. Осуществляют вскрытия в соответствующих условиях освещения. Анатомирование может осуществляться под красные огни для имитации тьмы.
- Обезболивают образцов охлаждения или под воздействием газообразных CO2.
- Образец обработки
- Сохранить образцы в фиксатор при комнатной температуре с движением на орбитальный шейкер, х 2. большие образцы, может потребовать больше времени фиксации.
- Снимите фиксатор и распоряжаться его соответствующим образом. Вымойте образцов в комнатной температуре фосфатного буфера (3 раза по 5 минут) в шейкер.
Примечание: Фосфатного буфера состоит из 8 g NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4и 0,244 g KH2PO4 в 1 Л дистиллированной H2O (pH 7.2). - Удаление фосфатного буфера и добавить 2% OsO4. Поместите jar образца на шейкер в зонт для 1-2 ч. Это шаг после фиксации для устранения жиров и также обеспечивают контраст для ТЕА.
Примечание: Осмий фиксации раз подпадают под размер образца; как грубый правило Вычислите 1 h фиксации на 1 мм3. - Удаление решения осмий и распоряжаться им соответствующим образом. Вымойте образцов в комнатной температуре буфера (3 раза по 5 минут) в шейкер.
- Обезвоживает образцы, поместив их в увеличении концентрации этанола или ацетон; например 50, 70, 80 и 95% за 10 мин и наконец 100% (2 раза по 15 мин). Поместите образцы на шейкер между решения изменений.
Примечание: В случае необходимости, образцы могут храниться в 70% этанол на ночь. - Слейте этанола и добавьте 100% ацетона. Оставьте на 20 мин на шейкер (пропустить этот шаг, если обезвоживания в ацетон). Замените свежим ацетона и оставить его на дополнительные 20 мин.
- Проникнуть тканях смолой, используя следующие показатели ацетона для смолы: 2:1 (3 ч), 1:1 (на ночь), 1:2 (4 ч) и чистой смолы (на ночь). На каждом шаге оставьте образцов на шейкер внутри зонта и крышка контейнера для всех, кроме двух последних шагов.
Примечание: Смола слишком вязкой опорожнять так образцы должны быть перемещены в новый одноразовый контейнер на каждом шагу. - Подготовьте блоки для установки образцов. Блоки могут быть пользовательские сделал резки акрилового стекла на небольшие прямоугольные блоки (1.5 x 0.5 x 0,3 см). Блоки могут также быть сделаны заливки эпоксидной смолы (есть много коммерческих комплекты доступны) в кремний плесень и вылечить его в духовке в течение 12-14 ч при температуре 60 ° C.
Предупреждение: Неотвержденного смолы (жидкость) является канцерогенным и должны быть возвращены в духовке до тех пор, пока полностью закаленные. - Поместите блок вертикально в плесени. Тщательно взять образцы из жидкой смолы, позволяют избытков смолы для слива и поместите образец на верхней части блока. Небольшое количество дополнительных смолы может использоваться для связывания образца на блок.
- Метка блока. Печать бумажных этикеток и вставлять его в блоке или прикрепить его к грани блока.
- Держите плесень с встроенных блоков в духовке в течение 12-14 ч при температуре 60 ° C.
- Магазин образец блока в чистый конверт. Это может храниться таким образом, в течение нескольких месяцев до года.
- Оставьте используются контейнеры, Грязные Перчатки и других загрязненных оборудование в Зонта разрешить ацетона не испарится полностью (минимум 12 ч).
- Прежде чем выбросить располагаемого оборудования или выскабливание смолы от других элементов, таких как щипцы вылечить смолы в духовке.
- Секционирование
- Наблюдать за блок под микроскопом рассечения, чтобы обеспечить, что ориентация образца является подходящим для секущей плоскости.
- Если ориентация не подходит, используйте ювелирной увидел вырезать образца и переориентировать с использованием фрагментов набора смолы и свежей смолы для повторного сиденья образца. Руководитель также может быть разбит на две половинки в раздел два глаза отдельно. Вылечить смолы прежде чем снова.
- Смонтируйте блок на съемных микротом Чак. Снимите патрон и поместите держатель.
- Трим смолы блока с помощью лезвия бритвы под микроскопом рассечения.
Предупреждение: Не это, когда Чак монтируется на микротом руку, как он может толчка руки и повреждения подшипников. - Перемонтировать Чак на руку микротома и угол образца.
- Установите нож на держателе на соответствующий угол (0° для стекла ножи, см инструкции производителя алмазов ножи).
Примечание: Стекла ножи можно сделать дешевле с нож maker стекла, но должны быть заменены периодически, как они теряют свои края; высокое качество алмазов ножи могут быть приобретены но дорого, требуют особого ухода и не подходит для начинающих. - Заполните лодки нож с дистиллированной водой, с помощью шприца с фильтром (0,45 мкм поры).
- Заполните лодку до тех пор, пока уровень воды достигает края ножа; в других областях лодки может быть выпуклой мениска.
- Слейте воду лодку до тех пор, пока мениска очень слегка вогнутой, но по-прежнему достигает края ножа. Уровень воды может быть скорректирована в любой момент, но всегда от края ножа.
- Тщательно принести нож к образца и выравнивание блока к ножу. Лучше всего это делается, медленно, периодически проверяя близость нож через окуляр и со стороны.
Примечание: Проверьте инструмент руководства для получения инструкций, как инструменты различаются. - Установка толщины среза на микротома. Выбор правильной толщины будет зависеть размер образца, регион интереса и вида нож используется.
- Если с помощью ножа стекла выберите более высокое значение (например, 4 мкм), если много материала необходимо отрезать до достижения области интересов. Если используется Алмазный нож или если образец очень мала, 1-2 мкм может быть более подходящим.
- Начало «резки» (сгибать колеса микротом), когда рядом нож, но еще не резки в образец для выполнения последней частью подхода. Секции должны начать появляться в течение нескольких ротаций; Если нет, то остановите и очень тщательно принести нож чуть ближе.
- Настроить раздел сбора толщина (1 мкм для полутонкая секции) при приближении к области интереса.
- Собирайте любые разделы, с помощью средства для ресниц.
Примечание: Ресницы инструменты могут быть сделаны с ресниц смонтированы на тонкой палки с лаком. - Если необходимо удалить большое количество материала, позволяют разделов накапливаться и массово удалить, удалив нож и очищать его с водой. При использовании стекла нож, это может быть подходящее время, чтобы изменить для свежих часть ножа или новый нож.
- Место серии мелких капель дистиллированной воды на слайде с помощью пипетки Пастера, или в идеале фильтр оснащены шприц.
- Тщательно плавать разделе собраны на ресницы на капли воды.
- Соберите такие разделы, как это до тех пор, пока это целесообразно проверить глубину секционирование.
Примечание: Хотя это может быть утомительно, это всегда лучше, чтобы проверить часто. - Поместите слайд на конфорку, равным 60 ° C. Разрешить все воды испаряются и секции присоединиться к слайду.
- Краситель секции с толуидиновый синий для 10-60 s (окрашивание время зависит толщина среза). Отказаться от краски с помощью шприца с фильтром (как выше).
- Поместите каплю красителя на одном конце слайда и распространять его с помощью на стороне иглы без прикосновения или выскабливание разделы. Место слайда на конфорку для приблизительно 10-20 лет.
- Промойте слайд, поливая ее с дистиллированной водой в бутылке мыть и поместите его на горячей плите высушить его.
- Проверить под микроскопом соединения и их изображения.
- Повторяйте, пока не достигли области интереса.
- Для ультра-тонких секций: задать толщину резки между 40-60 Нм для сбора ТЕА секций.
- Вырезать о 3-5 секций и проверки толщины с помощью вмешательства цвет диаграммы. Секции должны отражать светло-серого цвета при просмотре под углом.
Примечание: Хлороформ паров может накапаны через разделы для отдыха любого складки. Это наиболее актуально для опытных пользователей и новичков, не нужно беспокоиться. Слишком много хлороформ, выпущен слишком близко к разделу может повредить секций. - Подберите сетку Formvar покрытием, медь, слот, проведены с щипцы с Formvar стороной. Будьте осторожны, чтобы не прокола Formvar покрытие.
- DIP сетки в лодку боком и от разделов, затем переведите сетке вверх параллельно поверхности по разделам. При необходимости используйте ресниц для руководства в разделах по сетке.
- Осторожно тыкать вокруг кончика щипцы с фильтровальной бумаги чтобы впитывать воду в ловушке между ветвями. Если это не сделано, воды напряженность может подтянуть сетки между оружия или сделать его придерживаться одной стороны. Это может привести к загрязнению или механического повреждения.
- Осторожно удалите лишнюю воду из сетки, сам, стоя сетки боком на фильтровальную бумагу.
- Поместите сетку в держателем сетки.
- Повторяйте, пока не собрано достаточно секции.
- Полутонкая секций может быть imaged непосредственно с любой составной микроскоп оснащен камерой. Масло иммерсионное могут быть размещены непосредственно на разделы. Слайды должны храниться в поле слайд для предотвращения обесцвечивания.
- Пятнать ультратонкий секции для контраста, ТЕА
Примечание: Следующие шаги должны осуществляться под прикрытием как красители и свет и CO2 чувствительной. Кроме того EM красителей используют тяжелых металлов для контраста и поэтому опасных веществ. Надлежащего ухода должны приниматься при обработке этих пятен.- Охватывать несколько крупных Петри с алюминиевой фольгой, чтобы блокировать свет. Работа по ним для следующих шагов. Частично раскройте им позволить рабочее пространство, но как можно скорее накройте одеялом.
- Вырезать кусок воска фильма и тщательно место пять капель 6% насыщенных уранила ацетата на него с помощью пипетки Пастера.
- Для приготовления раствора, смешать 2 g уранила ацетата 100 мл 50% метанола в дистиллированной воде и фильтровать решение перед использованием. Решение не может быть сохранен и следует свежий каждый раз19.
- Тщательно подобрать ТЕА сетки с щипцами и баланс на вершине капельки краски с раздела стороной вниз. Отпуск за 25 мин.
- Промойте решетки индивидуально погружением их быстро и из дистиллированной воды; прогресс через четыре различных ампул дистиллированной воды.
- Место пять капель цитрата свинца на свежий кусок пленки. Организовать несколько NaOH гранул вокруг капель краски (это поглощает атмосферные CO2 для предотвращения осаждения карбонат свинца).
- Для того чтобы привести цитрата, подготовьте би дистиллированной воды кипящей дистиллированной водой для 0,5 ч. разрешить воды для охлаждения и в контейнер под запайку, добавить цитрат свинец 0,3 г в 100 мл би дистиллированной воды. Добавьте 1 mL 10 M NaOH, печать контейнер плотно и встряхнуть до растворенного19.
- Место сетки на капли краски, как описано в разделе 4.3 и крышку. Пятно на 5 мин.
- Промыть в дистиллированной воде, как перед погружением сетки из дистиллированной воды 20 раз. Прогресс через три судна дистиллированной воды.
- Впитывать лишнюю воду с фильтровальной бумаги и позволяют сетки для просушки в поле Сетка.
- Изображение в ТЕА на низкой ускоряющего напряжения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанные здесь методы позволяют детальное изучение простые и составные глаза муравьев. Imaging спинной мнению головы, с использованием методов Микрофотография Z-стека позволяет получить обзор структуры зрительной системы (рис. 1). Это хорошая подготовка для вскрытия и определить требуемый угол резания. Этот метод также полезен для измерения ширина головы, глаз Длина и ocellar линз диаметром. SEM изображений также дает подробный обзор изображения, но дополнительно позволяет приобретение большого увеличения и изображений с высоким разрешением. Конкретных регионов интерес в глаза может быть рассмотрен в деталях и вариации в форме линзы могут быть определены (рис. 2). SEM изображения являются особенно полезными для урегулирования муравьи с маленькими глазами и глазки. Реплики роговицы представить информацию о форму, размер и количество линз в каждый глаз (рис. 3). Полутонкая разделы, отображаемого с помощью методов LM позволяют расследования валового внутреннего анатомии глаза (рис. 4 и 5); Это включает в себя толщина объектива, диаметр кристаллический конуса, наличие кристаллический конуса тракта, формы, ширина и длина рабдом, картирование области спинной ОПРАВЫ и расположение первичных и вторичных пигментных клеток. Эта техника может дополняться красиво ультра-тонких секций, отображаемого с помощью ТЕА, который позволяет для определения Ультраструктура особенно, microvillar ориентации (рис. 4) и меньше количественной структуры (например, ширина свёрнутые кристаллический конуса тракт, рис. 5).
Рисунок 1: Z-стек микрофотографиями три касты Австралийского сахара муравьёв Camponotus consobrinus. Это обеспечивает обзор структуры зрительной системы в все три касты. Адаптировано из ссылки20. Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: сканирование электронной микроскопии муравей зрительной системы, демонстрируя возможности визуализации этой техники. Верхняя строка показывает различные глаз позиции и размеры глаз в: (A) муравей nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; и (C) Amblyopone australis (Примечание очень маленькие глаза, белая стрелка). Изображения, полученные с высоким увеличением показаны: простые глаза (D) три рабочих муравей nigriceps; различных размера составного глаза в (E) Rhytidoponera metallica (Обратите внимание, различные формы фасеточном в различные регионы составного глаза желтым), (F) Amblyopone australis, (G) pyriformis муравей, (H) Orectognathus clarkiи (я) Pheidole видов. Масштаб баров = 1 мм (A-C), 100 мкм (D-H), (I) 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: реплики роговицы глаз муравей и глазка. (A) реплики составного глаза работника муравей nigriceps. Выпуклых реплики была выровнена путем разрезов. Врезные указывает кзади (p), передний () и спинной (d), вентральной (v) осей. (B) копия глазки рабочий муравей tarsata. Масштаб баров = 0,5 мм (A), 10 мкм (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: LM и EM изображений сечений рабдом. (A) сечение дистального rhabdoms в nigriceps муравей витражи в толуидиновый синий может использоваться для различения rhabdoms, которые являются круговой или прямоугольную форму. Передача электронной микроскопии шоу: (B) нескольких ориентаций микроворсинки в циркуляре рабдом и (C) микроворсинки ориентированная в двух противоположных направлениях в прямоугольной формы рабдом. (D) использование световой микроскопии, длинной оси прямоугольного rhabdoms сопоставляются Показать фан как Организации в регионе спинной глаз в королева Camponotus consobrinus; Врезные указывает, задняя (p), передний (a) и боковой (l), медиальной (m) осей. Группа D, адаптированный ссылки20. Масштаб баров = 10 мкм (A), 1 мкм (B-C), 100 мкм (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: LM и EM изображения Омматидий в свет адаптированных глаз муравей tarsata. (A) продольный разрез Омматидий показаны роговицы (C), кристаллический конус (CC), конус тракта (КТ), рабдом (Rh) и начальной пигментных клеток (КПП). (B) пунктир прямоугольной коробки панели A от другой секции Просмотрели под ТЕА для количественного определения узкой ширины тракта конуса. Адаптировано из ссылки21. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: общие проблемы с тонкий и ультра-тонких секций (фиксация и инфильтрации, резка и окрашивание). (A) плохой фиксации ткани из-за неадекватной проникновения (стрелка) в разделе полутонкая Pheidole видов; (B) копирования при резании в Iridomyrmex Кальв (полутонкая); (C) идеальное окрашивание (слева) и над окрашивание (справа) с толуидиновый синий муравей croslandi; (D) пигмент (круг) и ткани, копирования при резании (стрелки) за счет бедных соответствия смолы и ткани плотностью (смола слишком мягкий). Складные секции (звездочки), может произойти при сборе разделы из лодки нож; (E) бедных контрастный из-за недостаточной окрашивание (Сравните с вставкой), цитрат кристаллов свинца (белые стрелки) от воздействия CO2и Вертикальный нож Марк (черные стрелки); (F) отверстия ткани (белые стрелки), вызванных плохой фиксации в Melophorus hirsutus составного глаза; (G) смолы слишком мягкий, приводит к Эх при резании рассматривается как вертикальные ряби в секции; (H) раздела слишком толстая (~ 100 Нм) привели к темное изображение с плохой контраст, загрязненной дистиллированной воды приводят к бактерии и твердых частиц, разбросанных по всей секции (белые стрелки) в Pheidole видов. Шкалы бар = 25 мкм (A-B), 10 мкм (C-H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Набор методов, изложенных выше позволяют для эффективного расследования оптической системы муравьев и других насекомых. Эти методы сообщить наше понимание дискретизации, оптическая чувствительность и потенциальной поляризации чувствительность глаза изучается. Это знание обеспечивает важную основу для физиологических и поведенческих расследование их визуальные возможности. Кроме того в то время как методы, описанные здесь были сосредоточены на муравей визуальных систем, эти методы можно использовать на других насекомых, хотя и с незначительными изменениями в протоколе (например, увеличивая длительность фиксации и проникновение в толще ткани) . Слегка модифицированный протоколы были использованы для характеристики визуальных систем различных насекомых, включая цикад22, мух14, пчелы23, осы24, бабочки25и моли26. Хотя большинство методов изложенные здесь используются уже в течение некоторого времени, эта статья имеет возможность объединить их в контексте изучения муравья оптической системы и сравнения альтернативных методов и описания распространенных ошибок.
Есть много изображений имеющихся в настоящее время методов которые перекрывающихся заявок, и это может быть трудно оценить, какая техника подходит для выполнения этой задачи под рукой. Соответствующим примером здесь является выбор техника для обзор изображений. Внешняя морфология головы и глаз и относительное позиционирование оптической системы на голове может быть сделано с помощью SEM или Микрофотография. Сильные и слабые стороны этих методов были рассмотрены27, однако, есть некоторые особенности при визуализации глаза. При визуализации относительное расположение и размер глаз, оба метода имеют свои преимущества и недостатки. SEM изображения не имеют цветовую информацию и, следовательно, где соответствующие пигментации Микрофотография лучше. Однако SEM изображения можно проиллюстрировать тонких структур таких как между ommatidial волоски и границ аспект более подробно и даже раскрыть особенности поверхности не видно под Микрофотография методы (например, ocellar линзы, поверхности скульптурирование сложный глаз линзы). SEM — это универсальный метод, когда дело доходит до произвольного воображения и выявление особенности интерес потому, что он может работать на большой диапазон размеров образца при сохранении очень высоким разрешением во всем этом диапазоне. Однако это не является широко доступной как рассечение микроскопа и требует более высокого уровня знаний. Существует часто нет единого способа получения информации, которую требуется. В таком случае полезно рассмотреть то, что доступно и где наиболее важно инвестировать ресурсы.
Лак реплики роговицы оказались наиболее полезны в получении наиболее точное измерение числа аспект и аспект диаметров. Это теперь был использован в различных насекомых-11,-22,-28,-29. В то время как качество изображения, полученные от SEM намного превосходит, кривизны глаз предотвращает точных измерений массива весь аспект. Отображение размера аспект и аспект распределения также должно быть осуществимо из сканирования, полученные от микро компьютерная томография5.
В лм и ТЕА методики часто трудно знать ли образец подготовлен и обработаны хорошо до заключительного этапа визуализации. Чтобы избежать осложнений, важно создать передовой практики, например, поддержание чистой рабочих пространств и инструменты, подготовка свежие решения регулярно и тщательно фильтрации воды. Загрязняющие вещества, которые являются невидимыми для невооруженного глаза может разрушить EM образцы. По этой причине он может быть полезным обтереть вниз поверхностей и инструментов, с помощью растворителя, например этанол или ацетона и wipe-lint производства. Это наиболее актуальными при резании, окрашивание EM секции и при подготовке SEM образцов. Аналогичным образом, дистиллированной воды источников можно представить проблемы и ввести загрязняющих веществ, так что это всегда лучше, чтобы проверить фильтры, регулярно их менять и всегда использовать свежую отфильтрованной воды (не сохранять). Большинство фиксаторы, пятна и внедрения материалы не могут храниться на неопределенный срок, и это важно для обозначения всех решений с момента подготовки. Важно принять системный подход и выделить достаточно времени для выполнения протоколов без перерывов.
Адаптация методов для различных видов вызывает всегда проб и ошибок. При работе в пределах Formicidae, основные различия лежат в размер животного и мышечной массы в голову. Муравьи с больше мышц в их головы обычно займет больше времени, чтобы исправить. С очень большими муравьи то лучше удалить челюстных мышц, трахею и нижнечелюстной желез, при одновременном обеспечении минимального вмешательства с нервной ткани. В маленьких муравьев и те, с несколько челюстных мышц можно добиться надлежащей фиксации, просто удалив мандибулы и подвергая clypeal региона. В этих случаях маленькие отверстия с помощью булавки мелочи может производиться на голове для улучшения фиксации.
Важно отметить, что условия окружающей среды может также повлиять на подготовку. Жаркий и влажный среды (особенно на местах в тропиках) может оказаться проблемой во время стадии инфильтрата. Теплых условиях может привести смолы для частично полимеризоваться преждевременно результате неиспользованных смолы, становится все более вязкой. В этом случае лучшим вариантом является для хранения смолы в небольших, одного использования, контейнеры в холодильнике или морозильной камере. Охлаждение фиксативов может быть полезным для противодействия быстрее распада тканей в теплых условиях. Однако охлаждаемый решения разойдутся более медленно, что означает, что лечение раз следует обеспечить надлежащее проникновения.
С эти предостережения в виду расследование оптической системы муравьев и других насекомых может оказаться очень полезным. Изучая зрительной системы позволяет нам оценить размер поля зрения, interommatidial углы, оптическая чувствительность и выборки резолюций. Понимание анатомии глаза сообщает нашего понимания и интерпретации поведения животных. К примеру, Анатомия позволяет нам сделать прогнозы на визуальные возможности животных, таких как вне зависимости от того, являются ли они дневной или ночной образ жизни, который может не были зарегистрированы ранее. Учитывая текущие знания о системе визуального горсть муравьев, мы надеемся, что наши методы будут вдохновлять биологов и myrmecologists расследовать составного глаза и глазки в муравьев для дальнейшего нашего понимания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Мы благодарны Йохен Zeil, Пол Купер и Биргит Greiner для обмена своими знаниями в насекомых анатомии и для демонстрации некоторые из методов, мы описали здесь. Мы благодарны талантливых и вспомогательных сотрудников в центре передовых микроскопии в Ану и микроскопии агрегата в MQU. Эта работа была поддержана выпускник стипендию для FRE и гранты от австралийского исследовательского совета (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
