Summary
Cet article décrit un ensemble de méthodes en microscopie photonique et électronique pour étudier l’anatomie de le œil interne et externe des insectes. Il s’agit de plusieurs techniques traditionnelles, optimisés pour le travail sur les yeux fourmi, détaillée et dépannage ainsi que des propositions d’optimisation pour les différents spécimens et les régions d’intérêt.
Abstract
Cet article décrit un ensemble de méthodes en microscopie photonique (LM) et la microscopie électronique (EM) qui peut être utilisée pour étudier l’anatomie de le œil interne et externe des insectes. Il s’agit de techniques histologiques traditionnelles optimisé pour le travail sur les yeux de fourmi et adapté pour travailler de concert avec d’autres techniques telles que la microscopie électronique à transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage (SEM). Ces techniques, bien que très utile, peuvent être difficiles pour la microscopie de novice, alors l’accent a été placé dans cet article sur le dépannage et l’optimisation pour les différents échantillons. Nous fournir des informations sur les techniques d’imagerie pour l’échantillon entier (photo-microscopie et SEM) et discuter de leurs avantages et leurs inconvénients. Nous mettre en évidence la technique utilisée dans la détermination des diamètres de lentille pour le œil entier et discuter des nouvelles techniques d’amélioration. Enfin, nous discutons techniques intervenant dans la préparation des échantillons pour LM et TEM, coupes, coloration et imagerie de ces échantillons. Nous discutons les obstacles que l'on peut trouver dans quelle préparation des échantillons et la meilleure façon de naviguer autour d’eux.
Introduction
Vision est une modalité sensorielle importante pour la plupart des animaux. Vision est particulièrement cruciale dans le contexte de la navigation pour repérage buts, établissant et adhérant aux liaisons et l’obtention des informations boussole1,2. Détecter des informations visuelles à l’aide d’une paire d’yeux composés des insectes et, dans certains cas, yeux simples placés sur le dos d’un à trois appelés ocelles3,4,5.
Aux yeux des fourmis sont particulièrement intéressants parce que, tandis que les fourmis sont merveilleusement variés, ils conservent certaines caractéristiques clés selon les espèces. Malgré une variation dramatique dans l’anatomie, la taille et l’écologie, la grande majorité des espèces est eusocial et vive en colonies ; ainsi, différentes espèces rencontrent des défis visuels similaires en ce qui concerne la navigation en arrière entre les ressources et une place centrale. Dans l’ensemble de fourmis le même bauplan base oeil peut être observé dans animaux allant de 0,5-26 mm de longueur, d’exclusivement diurne d’espèces strictement nocturnes et de la lente marche souterraine à sauter des prédateurs visuels6,7, 8,9,10. Toutes ces différences stupéfiantes en écologie et comportement donnent lieu à des permutations innombrables des structures oculaires base même en fonction des différents environnements, modes de vie et tailles11,12. Par conséquent, étudier l’écologie visuelle des fourmis fournit une véritable mine d’or de possibilités à l’enquêteur déterminé.
Comprendre le système visuel des insectes est essentielle pour obtenir un aperçu de leurs capacités comportementales. Cela ressort des études intégrées qui combinent joliment anatomie avec l’écologie et le comportement d’un grand succès dans quelques groupes d’insectes (p. ex., références13,14,15,16, 17). bien que le domaine de la navigation de la fourmi et le comportement de la fourmi en général a été très réussi, très peu a insisté sur la vision de la fourmi en dehors de quelques espèces sélectionnées. Ici, nous élaborerons sur les techniques impliquées dans l’enquête sur la conception d’oeil de fourmis. Alors que nous nous concentrerons sur les fourmis, ces techniques peuvent être appliquées, avec de légères modifications, pour les autres insectes, trop.
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Protocol
1. préparation de l’échantillon
Remarque : Il faut d’abord comprendre l’emplacement relatif des yeux composés et ocelles les uns aux autres et sur la tête. Ceci peut être réalisé en faisant l’acquisition des images de la vue dorsale de la tête. Pour ce faire, nous vous recommandons d’échantillons de traitement pour la photomicrographie ou en utilisant des techniques de SEM. Ci-dessous les étapes sont impliquées dans ces deux processus.
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Prélèvement d’échantillons
- Collecter et stocker les échantillons directement dans l’éthanol à 70 %. Recueillir les différentes castes lorsque cela est possible.
- Étiqueter les échantillons avec heure, date et de placer ainsi que toutes autres observations pertinentes (p. ex., recueillis lors de recherche de nourriture, agrégation, l’accouplement nichent à l’intérieur d’une brindille, etc.)
- Recueillir assez de spécimens pour avoir plusieurs répétitions à chaque traitement.
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La photomicrographie et Z d’empilage
- Air secs spécimens et montez-les sur les cartes de points triangulaires, à l’aide de la colle soluble dans l’eau, puis sur une insecte broche. Pour plus d’informations, voir référence18.
- Image en utilisant un stéréomicroscope de fort grossissement avec une Z-commande de moteur et d’une caméra couleur.
- Utilisez un diffuseur pour avoir un éclairage uniform pour les spécimens.
- Capturer des images à différents plans focaux et enregistrer des images dans un format de fichier sans perte (comme tiff) et la pile de mise au point eux à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce.
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La microscopie électronique à balayage
NOTE : Nettoyer soigneusement tous les outils et les surfaces de travail avec de l’éthanol pour éviter la contamination de l’échantillon avec la poussière et autres particules.- Déshydrater pendant la nuit les spécimens dans l’éthanol et de l’air sec dans une boîte de Pétri.
- Utilisez une lame de rasoir tranchante pour séparer la tête du reste du corps.
- Monter la tête à l’angle de vision nécessaire (p. ex., dorsale vers le haut) sur les talons en aluminium à l’aide de ruban de carbone conductrices ou des tabulations. Couper le ruban de carbone en fines lanières et pliez-la pour prendre en charge de la capsule céphalique.
- Utilisez une coucheuse par pulvérisation cathodique pour appliquer l’or à la surface de l’échantillon pendant 2 min à 20 mA avec un étage rotatif. Le temps et le courant peuvent devoir être ajustée selon l’instrument.
- Transfert des spécimens à un nouveau talon en aluminium avec ruban carbone fraîches ou des tabulations.
Remarque : Le carbone non revêtu fournira un fond noir mais transférer des spécimens peut endommager le revêtement or. - Vérifiez que l’orientation de l’échantillon est encore correcte à l’aide d’un microscope à dissection et ajustez au besoin avec une paire de pince fine ou un outil similaire. Prendre soin de ne pas pour rayer le revêtement d’or ; poignée en aussi peu que possible.
- Charger les échantillons sur le support de talon de SEM, prenant note de la position des talons et des spécimens par rapport à l’autre.
Remarque : Certains SEMs sont équipés d’une caméra de la scène mais beaucoup ne le sont pas, et il peut être difficile de localiser les petits spécimens à fort grossissement. - Les spécimens de l’image. Utilisez une faible tension d’accélération pour éviter la charge et une petite ouverture pour la bonne profondeur de champ.
Remarque : Les paramètres sont mieux optimisés en consultation avec un technicien spécialisé dans l’instrument particulier utilisé.
2. quantifier la facette nombre et le diamètre
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Répliques de la cornée
- Utilisez les fourmis conservés dans de l’éthanol ou monté sur une broche à cet effet (étape 1.1.1).
- Monter l’animal sur une insecte broche ou sur la pâte à modeler. Si la tête est relativement importante, les autres parties du corps s’éliminent.
- Utilisez une insecte broche ou un cure-dent fin pour ramasser une petite goutte de vernis à ongles incolore-séchage rapide et l’étaler rapidement sur le œil. S’assurer que la goupille ne raye pas le œil. Le vernis à ongles devrait couvrir l’oeil entier et certains de la capsule céphalique environnante.
Remarque : Il est important que le vernis à ongles soient d’épaisseur relativement uniforme dans l’ensemble de le œil. - Laisser le vernis à ongles pour régler à la température ambiante.
- Une fois que c’est entièrement définie, utilisez une épingle insecte pour soulever doucement la réplique de la capsule entourant le œil.
- Une belle paire de pinces propres permet de soulever le réplica, saisissez la partie du réplica qui couvre la tête et pas le œil.
- Assurer la prise de conscience de l’orientation de l’oeil : la région antérieure, postérieure, dorsale et ventrale.
- Déposer la réplique sur une lame de verre. Utilisez une lame de rasoir pour couper la réplique en enlevant soigneusement le matériau excédentaire autour de le œil. Utiliser une aiguille ou une paire de pinces pour empêcher le mouvement de la réplique.
- Si le œil est très convexe, utilisez une lame de rasoir pour faire 3-4 fines incisions radiales partielles autour du bord pour aider à « aplatir » la réplique. Si le œil est relativement « plat », il n’y a pas besoin de faire ces incisions.
- Placez une lamelle couvre-objet doucement sur le réplica de le œil, veiller à ce que l’orientation de la réplique est connue. N’appliquez pas de pression, car cela permet d’éliminer l’impression cornée sur le vernis à ongles.
- Sceller la lamelle à l’aide de vernis à ongles très peu sur les quatre coins. Si le vernis à ongles s’écoule entre la lamelle couvre-objet et les lames de verre, cela endommagera la réplique.
- Image de la diapositive sur un microscope composé.
Remarque : si seulement certaines facettes sont en discussion, cela suggère alors que la réplique de le œil est aplatie pas assez. Jeter et recommencer à l’étape 2.1.3. - Importer l’image dans les programmes librement disponibles comme ImageJ/Fidji, où le nombre des ommatidies et taille de chaque ommatidie peuvent être mesurées.
NOTE : Cette méthode peut être utilisée pour préparer des répliques des ocelles, trop. Puisque c’est une lentille unique, nous vous recommandons de garder tous les ocelles ensemble dans un réplica.
3. analyse de la Structure de l’oeil
Remarque : Afin d’étudier l’anatomie de l’oeil nécessite dans la plupart des cas deux techniques complémentaires de LM et TEM. Les étapes du traitement initial nécessitent des techniques similaires pour LM et TEM. La différence se pose dès la phase sectionnement. Échantillons de traitement nécessite l’utilisation de produits chimiques dangereux qui doivent être manipulés avec soin et mis au rebut de manière responsable. Utiliser les équipements de protection individuelle, travailler sous une hotte, toujours lire les sheets(SDS) de données de sécurité et procéder à l’évaluation des risques avant de commencer.
- Dissection
- Anesthésier les spécimens en refroidissant ou par l’exposition aux gaz CO2.
- CO2 anesthésie est très rapide (généralement moins de 1 min) et il faut éviter une surexposition car cela peut entraîner la mort du spécimen. Si vous utilisez des pellets de glace (solide CO2) éviter tout contact direct avec des spécimens car cela peut causer des brûlures de froids.
- L’anesthésie froid est plus lente ; 4 ° C est suffisante, et des températures plus froides sont déconseillées. Établir un temps de refroidissement approprié pour l’espèce. Froids ou grandes fourmis résistantes comme les fourmis bull peuvent exiger > 10 min pour devenir complètement immobilisée, tandis que les espèces plus petites n’aurez besoin que 1-2 min. de refroidissement excessif va tuer le spécimen (éviter le contact direct avec de la glace). Spécimens devraient préférablement être contenus dans des récipients en plastique, petits bouchon de mousse et placés dans une glacière où ils peuvent être observés, plutôt que dans un congélateur ou un réfrigérateur électrique.
- Placer l’échantillon sur une boîte de Pétri et ajuster pour un affichage sous un microscope à dissection. Travailler rapidement est important pour préserver l’anesthésie et d’éviter la dégénérescence du tissu une fois que les incisions sont faites (ce peut) arriver quelques secondes.
- Retirer les antennes avec une pince. Si vous travaillez avec un insecte perçant, il est conseillé d’amputer le gaster tout d’abord pour éviter de se faire piquer.
- Enlever les parties de la bouche à l’aide d’une lame de rasoir tranchante ; forceps peut servir à maintenir le spécimen. Couper à travers la partie antérieure de le œil (gros spécimens) ou aussi près des yeux que possible (petites éprouvettes) sans tirant sur le cerveau comme cela peuvent déchirer la rétine.
- Se préparer à ouvrir la capsule céphalique. Angle de l’échantillon alors que la première incision est dirigée vers le haut ; Cela peut être fait soit sous le microscope à dissection tout en tenant le spécimen à pinces ou sous contrôle visuel tout en maintenant l’échantillon entre le doigt du pouce et de la fore.
- Faire une incision transversale à travers la tête pour enlever la portion ventrale de la tête ; partie de le œil ventrale peut être retiré de grandes espèces afin d’améliorer la fixation et l’infiltration. La tête doit toujours être attachée au corps à ce stade.
- Rompre la capsule céphalique de l’organisme en faisant une incision coronale juste en arrière de le œil composé.
- Placer la capsule céphalique disséquée avec les yeux composés dans le fixateur froid glace : paraformaldéhyde glutaraldéhyde et 2 % à 2,5 % dans un tampon phosphate (pH 7,2 à 7,5).
ATTENTION : Le fixateur est corrosif et toxique ; porter une protection appropriée et travailler sous une hotte.
Remarque : Il est important de travailler rapidement pour arrêter la dégénérescence des tissus nerveux. La dissection doit être rempli en 2 min ou moins (dissection efficace peut exiger certaines pratiques).
Remarque : Si le œil doit être adaptée aux conditions lumineuses ou sombres, puis exposer d’abord les animaux à l’état lège nécessaire pendant quelques heures. Réaliser la dissection dans les conditions de lumière respectifs. Les dissections peuvent être effectuées sous feux rouges pour simuler des ténèbres.
- Anesthésier les spécimens en refroidissant ou par l’exposition aux gaz CO2.
- Traitement des échantillons
- Conserver les échantillons dans le fixateur à température ambiante avec motion dans un agitateur orbital, de gros spécimens de 2 h. peuvent exiger plus longs temps de fixation.
- Retirez le fixateur et jeter correctement. Laver les spécimens dans un tampon phosphate (3 fois, 5 min chacun) température ambiante sur l’agitateur.
Remarque : Le tampon de phosphate est composé de 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na2HPO4et 0,244 g KH2PO4 dans 1 L de distillée H2O (pH 7,2). - Retirer le tampon phosphate et ajouter 2 % OsO4. Placer le bocal de spécimen sur le vibreur dans la hotte de laboratoire pendant 1-2 h. Il s’agit d’une étape après fixation pour fixer les graisses et aussi offrir un contraste pour TEM.
NOTE : Temps de fixation d’Osmium sont sous réserve de la taille de l’échantillon ; une règle approximative, calculer 1 h de fixation par 1 mm3. - Enlever la solution de l’osmium et disposer de façon appropriée. Laver les spécimens dans un tampon (3 fois, 5 min chacun) de la température ambiante sur l’agitateur.
- Déshydrater les spécimens en les plaçant dans l’augmentation des concentrations d’éthanol ou d’acétone ; par exemple, 50, 70, 80 et 95 % pour 10 min chacun et enfin 100 % (2 fois 15 min chacun). Placer les spécimens sur le vibreur entre les changements de la solution.
Remarque : Si nécessaire, échantillons peuvent être conservés dans l’éthanol à 70 % du jour au lendemain. - Égoutter l’éthanol et ajouter 100 % acétone. Laissez-le pendant 20 min sur le shaker (sauter cette étape si la déshydratation dans l’acétone). Remplacez l’acétone frais et laissez-le pendant une 20 mn supplémentaire.
- S’infiltrer dans les tissus avec la résine en utilisant les ratios suivants d’acétone à résine : 2:1 (3 h), 1:1 (nuit), 1:2 (4 h) et résine pure (la nuit). À chaque étape laisse spécimens sur le vibreur à l’intérieur de la hotte et culot le conteneur pour tous sauf les deux dernières étapes.
Remarque : La résine est trop visqueuse pour être vidangé pour spécimens doivent être déplacés vers un nouveau conteneur jetable à chaque étape. - Préparer des blocs pour monter les échantillons. Blocs peuvent être personnalisés réalisés par découpe de verre acrylique en petits blocs rectangulaires (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Blocs peuvent également être faites par verser la résine époxyde (il y a beaucoup de kits commerciaux disponibles) dans un moule silicone et guérir puis au four pendant 12-14 h à 60 ° C.
ATTENTION : Non durci résine (liquide) est cancérigène et doit être retourné au four jusqu'à ce que complètement durci. - Placez le bloc verticalement dans le moule. Soigneusement prendre les spécimens de la résine liquide, permettre des excès de résine drainer et placez l’échantillon sur le dessus du bloc. Une petite quantité de résine supplémentaire peut être utilisée pour lier le spécimen au bloc.
- Le bloc de l’étiquette. Imprimer les étiquettes de papier et incorporez-le dans le bloc ou attachez-le à une face du bloc.
- Garder le moule avec les blocs incorporés dans le four pendant 12-14 h à 60 ° C.
- Stocker le bloc de spécimen dans une enveloppe propre. Cela peut être stocké de cette façon pendant plusieurs mois à années.
- Laissez les contenants usagés, des gants sales et autre matériel contaminé dans la hotte de laboratoire pour permettre à l’acétone s’évapore complètement (minimum 12 h).
- Résine de cure dans le four avant de jeter des équipements jetables ou grattage résine hors autres éléments tels que des pinces.
- Sectionnement
- Observer le bloc sous le microscope à dissection pour s’assurer que l’orientation de l’échantillon est appropriée pour le plan de coupe.
- Si l’orientation n’est pas appropriée, utiliser la scie de bijoutier pour découper le spécimen et de réorienter l’utilisation de fragments de set résine et résine fraîche pour repositionner le spécimen. La tête peut également être divisée en deux moitiés à l’article les deux yeux séparément. Polymériser la résine à nouveau avant de procéder.
- Montez le bloc sur le mandrin amovible microtome. Retirer le mandrin et placer sur le support.
- Coupez le bloc de résine à l’aide d’une lame de rasoir sous le microscope à dissection.
ATTENTION : Ne le faites pas quand le mandrin est monté sur le bras du microtome car il peut secouer le bras et endommager les roulements. - Remonter le mandrin sur le bras du microtome et l’angle de l’échantillon.
- Monter le couteau sur le support situé à l’angle approprié (0° pour verre couteaux, voir les instructions du fabricant pour les couteaux diamant).
NOTE : Verre couteaux peut être faite à un prix avantageux avec un verre de coutelier, mais doit être remplacé périodiquement car ils perdent leur avantage ; couteaux diamant de haute qualité peut être achetés mais est chers, nécessite un soin particulier et ne conviennent pas pour les débutants. - Remplir le bateau de couteau avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue équipée d’un filtre (taille des pores 0,45 µm).
- Remplir le bateau jusqu'à ce que le niveau d’eau atteigne le bord du couteau ; le ménisque peut être convexe dans d’autres domaines du bateau.
- Vider le bateau jusqu'à ce que le ménisque est très légèrement concave, mais toujours atteint le bord du couteau. Le niveau de l’eau est réglable en un point quelconque, mais toujours loin du bord du couteau.
- Soigneusement, mettre le couteau vers le spécimen et aligner le bloc au couteau. C’est mieux fait lentement, régulièrement vérifier la proximité du couteau à travers l’oculaire et de côté.
Remarque : Consultez le Guide de l’instrument pour obtenir des instructions spécifiques comme instruments varient. - Définir l’épaisseur de la section sur le microtome. Choisir l’épaisseur appropriée sera tributaire de la taille de l’échantillon, région d’intérêt et le genre de couteau utilisé.
- Si à l’aide d’un couteau verre sélectionnez un réglage plus élevé (p. ex., 4 µm), si un grand nombre de matériel doit être éliminé avant d’atteindre la zone d’intérêt. Si un couteau diamant est utilisé ou si l’échantillon est très petit, 1-2 µm peut être plus approprié.
- Démarrer la « coupe » (démarrage la roue microtome) lorsque le couteau est étroit mais ne pas encore couper dans l’échantillon pour effectuer la dernière partie de l’approche. Sections devraient commencent à apparaître dans quelques rotations ; Si ce n’est pas le cas, arrêter et très soigneusement rapprocher le couteau un peu plus.
- Ajuster la section collecte de quelle épaisseur (1 µm pour les sections minces semi) approchant de la région d’intérêt.
- Collecter toutes les sections à l’aide d’un outil de cils.
Remarque : Les outils de cils peuvent être faits avec un cil monté sur un bâton mince avec vernis à ongles. - Si beaucoup de matière à enlever, laisser les sections d’accumuler et de supprimer massivement en enlevant le couteau et en évacuant l’eau. Si vous utilisez un couteau de verre, c’est peut-être le moment de changer pour une nouvelle section du couteau ou un nouveau couteau.
- Place une série de petites gouttelettes d’eau distillée dans une diapositive à l’aide d’une pipette Pasteur ou idéalement, le filtre équipé de seringue.
- Soigneusement flotter la section recueillie sur les cils sur la goutte d’eau.
- Recueillir des mèches comme cela jusqu'à ce qu’il y a lieu de vérifier la profondeur de coupe.
Remarque : Bien qu’il peut être fastidieux, il est toujours préférable de vérifier souvent. - Placer la lame sur une plaque chauffante réglée à 60 ° C. Permettre à toute l’eau s’évapore et la section d’adhérer à la diapositive.
- Teindre des sections avec toluidine bleu pour 10-60 s (temps de coloration varie avec l’épaisseur de coupe). Diluer le colorant avec une seringue équipée d’un filtre (voir ci-dessus).
- Déposez une goutte de colorant à une extrémité de la lame et l’étaler à l’aide du côté de l’aiguille sans la toucher ou de gratter les sections. Placer la lame sur la plaque chauffante pendant environ 10-20 s.
- Rincer la lame en vaporisant avec de l’eau distillée dans un flacon laveur et placez-le sur la plaque chauffante pour le sécher.
- Vérifier au microscope composé et leur image.
- Répétez jusqu'à ce que la région d’intérêt est atteint.
- Pour les sections ultra-minces : définir l’épaisseur de coupe entre 40 et 60 nm pour recueillir les tronçons TEM.
- Coupe de 3 à 5 sections et épaisseur de vérifier à l’aide d’un nuancier de brouillage. Sections devraient refléter gris clair vu sous un angle.
Remarque : Les vapeurs de chloroforme peuvent être reversés sections pour se détendre tout plis. C’est le plus pertinent pour les utilisateurs expérimentés et les débutants ne doivent pas s’inquiéter. Trop chloroforme sorti trop près de la section peut endommager les sections. - Ramasser une grille sous enduit Formvar, cuivre, qui s’est tenue avec une pince Formvar, face vers le haut. Veillez à ne pas percer le revêtement Formvar.
- Tremper la grille dans le bateau latéralement et à l’écart les sections, puis mettre la grille en place parallèlement à la surface sous les sections. Si nécessaire utiliser le CIL pour guider les sections sur la grille.
- Tamponnez délicatement autour de la pointe de la pince avec filtre en papier pour absorber l’eau coincée entre les bras. Si ce n’est pas fait, tension de l’eau peut tirer la grille vers le haut entre les branches ou à s’en tenir à l’écart. Cela peut entraîner une contamination ou détérioration mécanique.
- Retirer délicatement l’excès d’eau de la grille elle-même par permanent la grille ergot sur papier filtre.
- Placer la grille dans un support de grille.
- Répétez jusqu'à ce que suffisamment sections ont été collectées.
- Sections minces semi peuvent être photographiées directement avec n’importe quel microscope composé équipé d’une caméra. Huile d’immersion peut être placé directement sur les sections. Diapositives doivent être stockés dans une boîte de diapositive pour éviter la décoloration.
- Coloration section ultra-mince pour un contraste TEM
Remarque : Les étapes suivantes devraient effectués sous le couvert comme les colorants sont légères et sensibles de CO2 . En outre, les colorants EM utilisent des métaux lourds pour produire le contraste et sont donc des substances dangereuses. Appropriée il faut lors de la manipulation de ces taches.- Couvrir quelques grandes boîtes de Pétri avec papier d’aluminium pour bloquer la lumière. Travailler sous ces pour les étapes suivantes. Partiellement découvrir afin de laisser un espace de travail, mais remettez les couvercles sur dès que possible.
- Couper un morceau de film de cire et placez-la cinq gouttes d’acétate d’uranyle saturée de 6 % à ce sujet à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Pour préparer la solution, mélange acétate d’uranyle 2 g avec 100 mL de méthanol 50 % dans l’eau distillée et filtrer la solution avant de l’utiliser. La solution ne peut être stockée et convient de frais chaque fois19.
- Ramasser soigneusement les grilles TEM avec forceps et balance sur le dessus des gouttelettes de colorant avec le côté de la section vers le bas. Laissez pendant 25 min.
- Rincez les grilles individuellement en les plongeant rapidement dans et hors de l’eau distillée ; progrès réalisés par le biais de quatre différents flacons d’eau distillée.
- Placez cinq gouttes de citrate de plomb sur une feuille fraîche de film. Organiser quelques pastilles de NaOH autour les gouttes de colorant (cela absorbe atmosphériques de CO2 pour empêcher la précipitation du carbonate de plomb).
- Pour rendre la solution de citrate de plomb, préparer l’eau bi-distillée par l’eau distillée bouillante pour 0,5 h. autoriser l’eau refroidir et dans un récipient refermable, ajouter citrate de plomb 0,3 g pour 100 mL de l’eau bi-distillée. Ajouter 1 mL 10 M NaOH, fermer le récipient hermétiquement et secouez jusqu'à dissous19.
- Placer les grilles sur les gouttes de teinture comme décrit en 4.3 et couverture. Détachant pendant 5 min.
- Rincer à l’eau distillée comme avant en plongeant les grilles dans et hors de l’eau distillée 20 fois. Progrès réalisés par le biais de trois navires de l’eau distillée.
- Imprégnez-vous de l’égoutter avec du papier filtre et laisser les grilles sécher dans une maille.
- Image dans un TEM à faible tension d’accélération.
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Representative Results
Les méthodes décrites ici permettent une étude détaillée des simples et des yeux composés des fourmis. La vue dorsale de la tête à l’aide de techniques de la photomicrographie Z-pile d’imagerie permet d’obtenir un aperçu de la présentation du système visuel (Figure 1). Il s’agit d’une bonne préparation pour les dissections et pour déterminer l’angle de coupe souhaité. Cette technique est également utile pour prendre des mesures telles que la largeur de la tête, yeux longueur et diamètre de la lentille ocellaires. L’imagerie SEM donne également un aperçu détaillé des images, mais permet en outre l’acquisition de grossissement élevé et des images haute résolution. Certaines régions d’intérêt dans les yeux peuvent être examinées en détail et les variations de forme lenticulaire peuvent être identifié (Figure 2). Images de SEM sont particulièrement utiles pour résoudre les fourmis avec petits yeux et des ocelles. Les répliques de la cornée des renseignements sur la forme, la taille et le nombre de lentilles pour chaque oeil (Figure 3). Sections minces semi imagées à l’aide de techniques de LM permettent enquête du brut Anatomie interne de le œil (Figure 4 et Figure 5) ; Cela inclut l’épaisseur de la lentille, le diamètre du cône cristallin, présence d’un tract de cône cristallin, la forme, la largeur et la longueur de la rhabdome, cartographie de la région dorsale de la jante et l’emplacement des cellules pigmentaires primaires et secondaires. Cette technique peut être agréablement complétée par sections ultra-minces imagées à l’aide de TEM, ce qui permet de déterminer l’ultrastructure en particulier, l’orientation de microvillosités (Figure 4) et la quantification des plus petites structures (par exemple, largeur de les voies de cône cristallin resserrée, Figure 5).
Figure 1 : Microphotographies de Z-pile des trois castes de la fourmi de sucre australien, consobrinus Camponotus. Cela donne un aperçu de la présentation du système visuel à toutes les trois castes. Adapté de référence20. Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : microscopie électronique de l’appareil visuel de fourmi, démontrant les capacités d’imagerie de cette technique de balayage. Rangée du haut montre l’oeil taille dans et position de l’oeil différent : (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; et (C) Amblyopone australis (Notez la flèche de très petits yeux, blanc). Les images acquises à fort grossissement montrant : (D) les trois yeux simples chez les travailleurs de Myrmecia nigriceps ; différentes taille œil composé en (E) Rhytidoponera metallica (Notez la forme ommatidies dans différents différentes régions de le œil composé en jaune), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkietj’ai Pheidole espèces. Barreaux de l’échelle = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Répliques de la cornée des yeux de fourmi et ocelles. (A) réplique de le œil composé d’un travailleur de Myrmecia nigriceps. La réplique convexe a été aplatie en faisant des incisions. L’encart indique postérieur (p), antérieure (a) et dorsale (d), les axes ventrale (v). (B) réplique les ocelles du travailleur de Myrmecia tarsata. Barreaux de l’échelle = 0,5 mm (A), 10 µm (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : LM et EM images de coupes transversales rhabdome. (A) section distales rhabdomes dans Myrmecia nigriceps teinté toluidine bleu peut être utilisée pour distinguer les rhabdomes qui sont circulaires ou de forme rectangulaire. Spectacle de microscopie électronique de transmission : (B) des orientations multiples de microvillosités dans la circulaire rhabdome et microvillosités (C) orienté dans deux directions opposées dans le rhabdome en forme rectangulaire. (D) utilisant la microscopie photonique, l’axe longitudinal des rhabdomes rectangulaires sont mappés pour montrer une organisation fan-comme dans la région dorsale de le œil à une reine de consobrinus Camponotus; encart indique postérieur (p), antérieure (a) et latérale (l), les axes médiale (m). Panneau D adapté de référence20. Barreaux de l’échelle = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les images de LM et EM d’une ommatidie dans un œil adapté à la lumière de Myrmecia tarsata. (A) section longitudinale d’une ommatidie montrant la cornée (C), cônes cristallins (CC), voies de cône (ct), rhabdome (Rh) et primaire des cellules pigmentaires (PPC). (B) Dashed rectangulaire boîte en paroi A partir une section différente vue sous un TEM pour quantifier l’étroitesse des voies cône. Adapté de référence21. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : problèmes fréquents avec les sections semi minces et ultra-minces (fixation et infiltration, coupe et coloration). (A) mauvaise fixation des tissus due à la pénétration insuffisante (flèche) dans une section semi mince de Pheidole espèces ; (B) extraction lors de sectionnement dans detectus calvus (semi fine) ; (C) perfect coloration (à gauche) et plus de coloration (à droite) avec toluidine bleu en Myrmecia croslandi; (D) pigment (cercle) et tissu déchirant au cours de la section (flèches) en raison de la mauvaise correspondance de la densité de tissus et de résine (résine trop mou). Pliage de la section (astérisques), peut se produire lors de la collecte des sections du bateau de couteau ; (E) pauvre contraste en raison de la coloration insuffisante (comparez à encastré), cristaux de citrate de plomb (flèches blanches) de l’exposition au CO2et le couteau vertical marquent (flèches noires) ; (F) des trous dans le tissu (flèches blanches) causée par la mauvaise fixation dans un œil composé de Melophorus hirsutus ; (G) résine trop mou, conduit à chitter lorsque la section considérée comme des ondulations verticales dans la section ; (H) section trop épaisse (~ 100 nm) a entraîné une image sombre à faible contraste, plomb de contamination de l’eau distillée aux bactéries et particules dispersés à travers la section (flèches blanches) Pheidole espèces. Echelle = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La suite des méthodes décrites ci-dessus permettent une enquête efficace sur le système optique de fourmis et autres insectes. Ces techniques d’informent notre compréhension de la résolution d’échantillonnage, une sensibilité optique et sensibilité potentielle de polarisation de le œil à l’étude. Cette connaissance fournit une base importante pour physiologique et comportementaux enquête sur leurs capacités visuelles. En outre, alors que les méthodes détaillées ici ont mis l’accent sur les systèmes visuels de fourmi, ces techniques peuvent être utilisés sur d’autres insectes, mais avec légères modifications dans le protocole (par exemple, augmentation de la durée de fixation et d’infiltration dans les tissus plus épais) . Légèrement modifiée des protocoles ont été utilisées pour caractériser les systèmes visuels d’une variété d’insectes, notamment des cigales22mouches14, abeilles23, guêpes24, papillons25et papillons26. Bien que la plupart des techniques décrites ici ont été utilisés pendant un certain temps, cet article saisit l’occasion pour les rassembler dans le contexte d’étudier le système optique de la fourmi et comparer des techniques alternatives et décrire les pièges communs.
Il existe plusieurs techniques d’imagerie actuellement disponibles qui sont chevauchent des applications et il peut être difficile de déterminer quelle technique est approprié pour la tâche à accomplir. Un exemple pertinent ici c’est choisir une technique d’imagerie de l’aperçu. La morphologie externe de la tête et les yeux et le positionnement relatif de l’optique sur la tête peuvent être faits à l’aide de la SEM ou la photomicrographie. Les forces et les faiblesses de ces techniques ont été examinés27, toutefois, il existe certaines considérations particulières lorsque les yeux d’imagerie. Lorsque l’imagerie le positionnement relatif et la taille des yeux, les deux techniques ont leurs avantages et leurs inconvénients. SEM images manquent d’informations couleur et donc où la pigmentation est pertinente la photomicrographie est mieux. Cependant, les images de SEM peuvent illustrer les structures fines telles que les poils des ommatidies et limites de la facette plus en détail et même révéler des caractéristiques de surface non visibles sous techniques de la photomicrographie (p. ex., lentilles ocellaires, sculpture de surface lentilles yeux composés). SEM est une technique polyvalente lorsqu’il s’agit d’exploratoire d’imagerie et identifier les caractéristiques d’intérêt car elle peut fonctionner sur une large gamme de tailles d’échantillon, tout en conservant une résolution très élevée tout au long de cette plage. Cependant, il n’est pas aussi largement accessible sous un microscope à dissection et exige un degré plus élevé d’expertise. Il n’y a souvent aucun moyen simple d’obtenir les renseignements dont un besoin. Dans un tel scénario, il est utile d’examiner ce qui est disponible et où il est très important d’investir des ressources.
Vernis à ongles répliques de la cornée sont révélés pour être plus utile à obtenir la mesure plus précise du nombre de facettes et le diamètre de la facette. Cela a maintenant été utilisé dans une variété d’insectes11,22,28,29. Alors que la qualité des images acquises depuis une SEM est de loin supérieure, la courbure de le œil empêche des mesures précises du tableau entier facette. Cartographie de la taille de la facette et la distribution de la facette devrait également être possible de balayages acquis du micro-tomographie5.
Dans le LM et le TEM techniques, il est souvent difficile de savoir si l’échantillon a été préparé et traitée bien avant la phase finale de l’imagerie. Pour éviter les complications, il est important d’établir de bonnes pratiques comme le maintien de travail propres espaces et outils, préparer des solutions fraîches régulièrement et fond filtrant l’eau. Les contaminants qui sont invisibles à le œil nu peuvent ruiner les échantillons EM. Pour cette raison, il peut être utile essuyer les surfaces et instruments à l’aide d’un solvant, comme l’éthanol ou l’acétone et un chiffon non pelucheux produisant. C’est plus pertinent lorsque le sectionnement, souillant des sections de l’EM et lors de la préparation des échantillons de SEM. De même, les sources d’eau distillée peuvent posent des problèmes et introduire des contaminants donc il est toujours préférable de vérifier les filtres, les changer régulièrement et utilisez toujours de l’eau fraîchement filtrée (ne pas conserver). La plupart fixatifs, taches et incorporation de matériaux ne peuvent être stockées indéfiniment, et il est important d’étiqueter toutes les solutions avec la date de l’établissement. Il est important d’adopter une approche systématique et mettre de côté suffisamment de temps pour réaliser des protocoles sans interruptions.
Adapter les techniques aux différentes espèces, c’est toujours une question d’essais et d’erreurs. Lorsque vous travaillez au sein de Formicidae, les principales différences résident dans la taille de l’animal et la masse musculaire dans la tête. Fourmis et la musculature plus dans leur tête prend généralement plus de difficulté. De très grandes fourmis, il est préférable d’enlever les muscles mandibulaires, trachée et glandes mandibulaires, tout en assurant le minimum d’interférences avec le tissu neural. Petites fourmis et ceux avec quelques muscles mandibulaires, il est possible d’atteindre la fixation adéquate en juste enlever les mandibules et exposer la région clypeal. Dans ces cas, petits trous à l’aide de goupilles de minuties est possible sur la tête pour améliorer la fixation.
Il est important de noter que les conditions environnementales peuvent également affecter des préparations. Les environnements chauds et humides (surtout les stations de champ sous les tropiques) peuvent s’avérer un défi pendant la phase d’infiltration. Des conditions chaudes peuvent entraîner des résines partiellement polymériser prématurément entraînant la résine inutilisée, devenant de plus en plus plus visqueux. Dans ce cas, la meilleure option consiste à conserver la résine en petit, à usage unique, conteneurs au réfrigérateur ou au congélateur. Fixateurs de refroidissement peut être utile au dépérissement des tissus plus rapide comptoir dans des conditions chaudes. Cependant, des solutions refroidies dispersera plus lentement ce qui signifie que le temps de traitement devraient être étendues afin d’assurer la bonne pénétration.
Avec ces mises en garde à l’esprit, l’enquête sur le système optique de fourmis et autres insectes peut s’avérer très enrichissant. Étudier le système visuel permet d’estimer la taille du champ visuel, des angles interommatidial, sensibilité optique et résolutions d’échantillonnage. Comprendre l’anatomie de le œil informe la compréhension et l’interprétation du comportement animal. Par exemple, l’anatomie nous permet de faire des prédictions sur les capacités visuelles d’animaux tels qu’elles soient diurnes ou nocturnes, qui ne peut pas avoir été précédemment documenté. Compte tenu des connaissances actuelles sur le système visuel de poignée de fourmis, nous espérons que nos méthodes inspirera les biologistes et les myrmécologistes pour étudier les yeux composés et des ocelles à fourmis afin d’améliorer nos connaissances.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Jochen Zeil, Paul Cooper et Birgit Greiner pour partager leurs connaissances en anatomie insecte et pour avoir fait preuve de plusieurs des techniques que nous avons décrit ici. Nous sommes reconnaissants envers le personnel talentueux et de soutien au Centre de microscopie de pointe à ANU et microscopie de l’appareil à MQU. Ce travail a été soutenu par une bourse d’études supérieures de FRE et aux dons de l’Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
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