Summary
Denna artikel beskriver en uppsättning tekniker i ljus- och elektronmikroskopi att studera de inre och yttre ögat anatomin av insekter. Dessa inkluderar flera traditionella tekniker optimerad för arbete på ant ögon, detaljerad felsökning, och förslag för optimering för olika prover och regioner av intresse.
Abstract
Denna artikel beskriver en uppsättning tekniker i ljusmikroskop (LM) och elektronmikroskopi (EM) som kan användas för att studera de inre och yttre ögat anatomin av insekter. Dessa inkluderar traditionella histologiska tekniker optimerad för arbete på ant ögon och anpassas för att arbeta i samförstånd med andra tekniker såsom transmissionselektronmikroskopi (TEM) och scanning electron microscopy (SEM). Dessa tekniker, kan även väldigt användbar, vara svårt för en novis botaniker, så stor tonvikt har placerats i denna artikel på felsökning och optimering för olika exemplar. Vi informerar avbildningstekniker för hela preparatet (foto-mikroskopi och SEM) och diskutera sina fördelar och nackdelar. Vi lyfter fram den teknik som används för att fastställa lins diametrar för hela ögat och diskutera nya tekniker för förbättring. Slutligen diskuterar vi tekniker som används i förbereda prover för LM och TEM, snittning, färgning och imaging dessa prover. Vi diskutera de hinder som man kan komma över när förbereda prover och hur man bäst att navigera runt dem.
Introduction
Vision är ett viktigt sensorisk modalitet för de flesta djur. Vision är särskilt viktigt i samband med navigering för precisera mål, upprätta och följa rutter, och att erhålla kompass information1,2. Insekter upptäcker visuell information med hjälp av ett par förening ögon och, i vissa fall, en till tre dorsalt placerade enkla ögon kallas vingribborna3,4,5.
Ögonen på myror är av särskilt intresse eftersom, medan myror är härligt skiftande, de bevara vissa nyckelegenskaper mellan arter. Trots dramatiska variation i anatomi, storlek och ekologi, den stora majoriteten av arter är eusociala och lever i kolonier. som ett resultat, olika arter står inför liknande visuella utmaningar när det gäller navigera fram och tillbaka mellan en central plats och resurser. Över myror kan den samma grundläggande öga bauplan observeras i djur allt från 0,5-26 mm i kroppslängd, från uteslutande dagaktiva strikt nattaktiva arter och långsamma promenader underjordiska till leaping visuella predatorer6,7, 8,9,10. Alla dessa häpnadsväckande skillnader i ekologi och beteende ger upphov till otaliga varianter av samma grundläggande ögat strukturer som passar olika miljöer, livsstilar och storlekar11,12. Följaktligen, ger studera myror visuella ekologi en veritabel guldgruva av möjligheter till beslutsamma prövaren.
Förstå det visuella systemet av insekter är viktigt att få en inblick i deras beteendemässiga kapacitet. Detta framgår av integrativ studier som kombinerar fint anatomi med ekologi och beteende till en stor framgång i några insekt grupper (t.ex., referenser13,14,15,16, 17). även fältet ant navigering och ant beteende i allmänhet har varit ganska framgångsrik, mycket lite tonvikten har lagts på ant vision utanför några utvalda arter. Här kommer vi att utveckla teknikerna som är inblandade i att undersöka ögat design av myror. Medan vi kommer att fokusera på myror, kan dessa tekniker användas, med smärre ändringar, till andra insekter, alltför.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prov förberedelse
Obs: Det är nödvändigt att först förstå den relativa placeringen av förening öga och vingribborna till varandra och på huvudet. Detta kan uppnås genom att förvärva bilder av dorsala beskådar av huvudet. För detta rekommenderar vi behandling prover för fotomikrografi eller använda SEM tekniker. Nedan är steg involverade i båda processerna.
-
Provtagning
- Samla in och lagra exemplar direkt i 70% etanol. Samla olika kaster när så är möjligt.
- Märk proverna med tid, datum, och placera samt alla andra relevanta observationer (t.ex., samlade medan födosök, parning aggregering, kapsla inuti en kvist, etc.)
- Samla tillräckligt många exemplar ha flera replikerar i varje behandling.
-
Fotomikrografi och Z-stapling
- Air torra exemplar och montera dem på triangulära punkt kort, använda vattenlösligt lim, och sedan på en insekt stift. För detaljer, se referens18.
- Bild med en hög förstoring stereomikroskopet med en Z-stegmotor och en färgkamera.
- Använd en diffuser för att ha enhetlig belysning för exemplar.
- Fånga bilder på olika focal plan och spara bilder i en icke-förstörande filformat (till exempel tiff) och fokus stack dem med hjälp av kommersiellt tillgängliga program.
-
Scanning elektronmikrografier
Obs: Ren noggrant alla verktyg och arbetsytor med etanol att undvika kontaminering av preparatet med damm och andra partiklar.- Torkar ut exemplar i etanol över natten och lufttorka i en petriskål.
- Använda ett vasst rakblad för att skilja huvudet från resten av kroppen.
- Montera huvudet på krävs visningsvinkel (t.ex., dorsala uppåt) på aluminium stubbar med ledande kol band eller flikar. Skär kol tejpen i tunna strimlor och vik för att stödja huvudet kapseln.
- Använda en fräsande bestrykare guld på ytan av preparatet under 2 minuter vid 20 mA med en roterande scenen. Tid och ström kan behöva justeras beroende på instrumentet.
- Överföra exemplar till väsentlig ny aluminium med färska kol tejp eller flikar.
Obs: Obestruket kol ger en svart bakgrund men överföra exemplar kan skada guld beläggning. - Kontrollera att preparatorientering är fortfarande rätt med dissekera Mikroskop och justera vid behov med ett par fina pincett eller liknande verktyg. Se till att inte repa guld beläggning; handtag så lite som möjligt.
- Ladda prover med innehavaren SEM påbörjad, att göra anmärkning av placera av stubbar och exemplar i förhållande till varandra.
Obs: Vissa SEMs är utrustade med en scen kamera men många är inte och det kan vara svårt att hitta små prover med hög förstoring. - Bild exemplaren. Använd en accelererande lågspänning för att undvika laddning och en liten bländare för bra skärpedjup.
Obs: Inställningar optimeras bäst i samråd med en tekniker specialiserade på de särskilda instrument som används.
2. kvantifiera fasett siffror och diametrar
-
Hornhinnan repliker
- Använda myror bevaras i etanol eller monterad på en PIN-kod för detta ändamål (steg 1.1.1).
- Montera djuret på en insekt stift eller modellera. Om huvudet är förhållandevis stort, kan resterande kroppsdelar tas bort.
- Använd en insekt stift eller en fin tandpetare att plocka upp en liten droppe av snabbtorkande färglös nagellack och snabbt sprida det över ögat. Se till att PIN-koden inte repa ögat. Nagellacket bör omfatta hela ögat och några av de omgivande huvud kapseln.
Obs: Det är viktigt att nagellacket är relativt enhetlig tjocklek över ögat. - Lämna nagellacket att ställa vid rumstemperatur.
- När det är fullt Ställ, Använd en fin insekt stift att försiktigt lyfta repliken från huvudet kapseln kring ögat.
- Använd ett fint par rena tången att lyfta repliken, greppa delen av repliken som täcker huvudet och inte ögat.
- Säkerställa kännedom om orienteringen för ögat: den främre, bakre, dorsala och ventrala regionen.
- Placera repliken på en glasskiva. Använd ett rakblad för att trimma repliken genom att noggrant avlägsna överskottsmaterial runt ögat. Använda en nål eller ett par pincett för att förhindra repliken från att flytta.
- Om ögat är mycket konvexa, använda ett rakblad för att göra 3-4 fina partiell radiella snitt runt kanten att hjälpa 'platta' repliken. Om ögat är relativt 'platt', finns det ingen anledning att göra sådana snitt.
- Placera ett täckglas försiktigt på ögat repliken, att säkerställa att orienteringen av repliken är känt. Gäller inte trycket eftersom detta kan eliminera det hornhinna intrycket på nagellacket.
- Försegla den täckglas med mycket lite nagellack på fyra hörn. Om nagellacket rinner mellan täckglas och glasskivor, skadar repliken.
- Bild bilden på ett compound-Mikroskop.
Obs: om bara vissa aspekter är i fokus, sedan detta tyder ögat repliken inte plattas nog. Kasta och börja om från steg 2.1.3. - Importera bilden till fritt tillgängliga program som ImageJ/Fiji där antalet ommatidia och storleken på varje ommatidia kan mätas.
Obs: Denna metod kan användas för att förbereda repliker av ocelli, också. Eftersom det är en enda objektiv, rekommenderar vi att hålla alla vingribborna tillsammans i en replik.
3. analysera strukturen i ögat
Obs: För att studera anatomi av ögat kräver i de flesta fall två kompletterande tekniker av LM och TEM. De inledande beredningsledet kräver liknande tekniker för både LM och TEM. Skillnaden uppstår från snittningen scenen och framåt. Bearbetning prover kräver användning av farliga kemikalier som måste hanteras med omsorg och kasseras ansvarsfullt. Använd personlig skyddsutrustning, arbeta i dragskåp, alltid läsa den säkerhet data sheets(SDS) och utföra riskbedömningar innan du börjar.
- Dissektion
- Bedöva exemplar genom kylning eller exponering för gasformiga CO2.
- CO2 anestesi är mycket snabb (vanligtvis under 1 min) och vård bör vidtas för att undvika överexponering som detta kan leda till döden av preparatet. Om du använder torr-is pellets (solid CO2) Undvik direktkontakt med exemplar som detta kan orsaka köldskador.
- Kall anestesi är långsammare; 4 ° C är tillräckligt och kallare temperaturer rekommenderas inte. Upprätta en lämplig kylning tid för arten. Stora eller kalla resistenta myror såsom bull myror kan kräva > 10 min att bli helt orörlig, medan mindre arter kanske bara behöver 1-2 min. överdriven kylning kommer att döda preparatet (Undvik direkt kontakt med is). Prover bör helst hållas i små, skum glaspropp, plast behållare och placeras i en icebox där de kan observeras i stället för en elektrisk kyl eller frys.
- Placera preparatet på en petriskål och justera för visning i dissekera Mikroskop. Arbetar snabbt är viktigt att bevara anestesi och undvika degeneration av vävnaden när snitt görs (detta kan hända inom sekunder).
- Ta bort antenner med pincett. Om arbetar med en stickande insekt, lönar det sig att amputera gaster först för att undvika att bli stucken.
- Ta bort munnen delar med ett vasst rakblad; tången kan användas nedtryckt för preparatet. Skär genom den främre delen av ögat (stora exemplar) eller så nära ögonen som möjligt (små exemplar) utan att rycka i hjärnan som detta kan riva ut näthinnan.
- Förbereda att öppna huvud kapseln. Vinkla preparatet så att första snittet pekar uppåt; Detta kan ske antingen under mikroskopet dissekera medan du håller preparatet i pincett eller under visuell kontroll medan du håller preparatet mellan fore med tummen och pekfingret.
- Gör en tvärgående snitt genom huvudet att ta bort den ventrala delen av huvudet; delen av ventrala ögat kan tas bort i stora arter att förbättra fixering och infiltration. Huvudet ska fortfarande kopplas till kroppen på denna punkt.
- Sever huvud kapseln från kroppen genom att göra en koronalt snitt bara posteriort förening ögat.
- Placera dissekerade huvud kapseln med fasettögon i is kallt fixativ: 2,5% glutaraldehyd och 2% PARAFORMALDEHYD i fosfatbuffert (pH 7,2-7,5).
Försiktighet: Fixativ är frätande och giftigt; bär lämpligt skydd och arbeta i dragskåp.
Obs: Det är viktigt att arbeta snabbt för att arrestera nervvävnad degeneration. Dissektionen bör vara slutförda i 2 min eller mindre (effektiva dissektion kan kräva lite övning).
Obs: Om ögat behöver anpassas till ljusa eller mörka förhållanden, då först utsätta djuren krävs ljus villkoret för ett par timmar. Genomföra dissektionerna i respektive ljusförhållandena. Dissektioner kan utföras under röda lampor att simulera mörker.
- Bedöva exemplar genom kylning eller exponering för gasformiga CO2.
- Preparatet bearbetning
- Hålla exemplaren i fixeringsvätskan vid rumstemperatur med rörelse i orbitalskak, för 2 h. stora exemplar kan kräva längre fixering gånger.
- Ta bort fixeringsvätskan och kassera det på lämpligt sätt. Tvätta exemplar i rumstemperatur fosfatbuffert (3 gånger, 5 min varje) på shakern.
Obs: Fosfatbuffert består av 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4och 0.244 g KH2PO4 i 1 L destillerat H2O (pH 7,2). - Bort fosfatbuffert och lägger till 2% OsO4. Placera preparatet burken på skakapparaten i dragskåp för 1-2 h. Detta är ett efter fixering steg att fixa fetter och även ge kontrast för TEM.
Anmärkning: Osmium fixering gånger omfattas preparatstorleken; som en grov tumregel, beräkna 1 h av fixering per 1 mm3. - Ta bort osmium lösningen och kassera det på lämpligt sätt. Tvätta exemplar i rumstemperatur buffert (3 gånger, 5 min varje) på shakern.
- Torka exemplaren genom att placera dem i ökande koncentrationer av etanol eller aceton; exempelvis 50, 70, 80, och 95% för 10 min varje och slutligen 100% (2 gånger, 15 min varje). Placera exemplaren på shakern mellan lösning förändringar.
Obs: Om det behövs prover kan lagras i 70% etanol över natten. - Töm etanolen och lägga 100% aceton. Lämna den i 20 min på shaker (hoppa över detta steg om uttorkande det i aceton). Ersätta med färsk aceton och lämna den för en ytterligare 20 min.
- Infiltrera vävnader med harts använder de följande förhållanden aceton till kåda: 2:1 (3 h), 1:1 (natten), 1:2 (4 h) och ren kåda (natten). Vid varje steg lämna prover på shakern inuti spiskåpa, och cap i behållaren för alla utom de sista två stegen.
Obs: Harts är för trögflytande tömmas så exemplar måste flyttas till en ny disponibla behållare vid varje steg. - Förbereda block att montera proverna. Block kan skräddarsys genom styckning akrylglas i små rektangulära block (1,5 x 0,5 x 0,3 cm). Block kan också göras av hälla epoxiharts (det finns många kommersiella kits) till en silikon mögel och bota den sedan i ugnen i 12-14 h vid 60 ° C.
Försiktighet: Ohärdat (flytande) harts är cancerframkallande och ska returneras till ugnen tills helt härdad. - Placera blocket vertikalt i mögel. Försiktigt ta exemplaren från flytande harts, tillåta överskott harts att dränera och placera preparatet på toppen av blocket. En liten mängd ytterligare harts kan användas för att binda förlagan till blocket.
- Etikett blocket. Skriva ut pappersetiketter och bädda in den i blocket eller bifoga det till ett block ansikte.
- Håll formen med de inbäddade block i ugnen i 12-14 h vid 60 ° C.
- Lagra preparatet i en ren kuvert. Detta kan lagras på detta sätt under flera månader till år.
- Lämna de begagnade containrarna, smutsiga handskar och annan förorenad utrustning i dragskåp att tillåta aceton avdunsta helt (minst 12 h).
- Bota harts i ugnen innan kasta engångsutrustning eller skrapning harts av andra föremål såsom pincett.
- Snittning
- Iaktta blocket under mikroskopet dissekera för att säkerställa att preparatorientering är lämpliga för snittning planet.
- Om orienteringen inte är lämpligt, använda en JUVELERARAFFÄR såg att skära ut preparatet och rikta med fragment av set harts och färsk harts att åter placera preparatet. Huvudet kan också delas i två halvor avsnitt två ögonen separat. Bota harts igen innan du fortsätter.
- Montera blocket på flyttbara mikrotomen chucken. Ta bort chucken och placera på innehavaren.
- Trimma harts blocket med hjälp av ett rakblad under mikroskopet dissekera.
Varning: Gör inte detta när chucken monteras på mikrotomen armen eftersom det kan skaka armen och skada lagren. - Montera chucken på mikrotomen armen och vinkla preparatet.
- Montera kniven på hållaren i lämplig vinkel (0° för glasknivar, se tillverkarens instruktioner för diamond knivar).
Obs: Glasknivar kan göras billigt med en glas kniv maker men måste bytas med jämna mellanrum eftersom de förlora sin kant; hög kvalitet diamond knivar kan köpas men är dyra, kräver särskild omsorg och lämpar sig inte för nybörjare. - Fyll kniv båten med destillerat vatten med hjälp av en spruta försedd med ett filter (0,45 µm porstorlek).
- Fylla båten tills vattennivån når kanten av kniven; menisken kan vara konvex i andra delar av båten.
- Töm båten tills menisken är mycket svagt konkav men fortfarande når kanten av kniven. Nivån på vattnet kan justeras när som helst men alltid med eggen på kniven.
- Försiktigt ta kniven mot preparatet och justera blocket att kniven. Detta görs bäst långsamt, regelbundet kontrollera närheten av kniven genom okularet och från sidan.
Obs: Kontrollera instrument handboken för specifika instruktioner som instrument varierar. - Ställ in snittjocklek på mikrotomen. Att välja rätt tjocklek kommer att vara beroende av preparatstorleken, regionen av intresse och typ av kniv som används.
- Om med en glas-kniv väljer en högre inställning (t.ex., 4 µm), om en hel del material måste klippas bort innan de når området av intresse. Om en diamant kniv som används eller om preparatet är mycket liten, kan 1-2 µm vara lämpligare.
- Starta ”styckning” (veva mikrotomen hjulet) när kniven är nära men ännu inte skära i preparatet till utföra den sista delen av metoden. Sektioner bör börja visas inom några rotationer; om inte, sluta och mycket noga föra kniven lite närmare.
- Justera avsnittet samlande tjocklek (1 µm för semi tunna snitt) när närmar sig regionen av intresse.
- Samla alla sektioner med en ögonfrans-verktyg.
Obs: Ögonfrans verktyg kan göras med en ögonfrans som monteras på en tunn pinne med nagellack. - Om en hel del material måste avlägsnas, tillåta avsnitten att samla och ta bort massor genom att ta bort kniven och spola det ut med vatten. Om du använder en glas-kniv, kan detta vara ett lämpligt tillfälle att ändra till ett färskt avsnitt av kniv eller en ny kniv.
- Plats en rad små droppar destillerat vatten på ett objektsglas med en Pasteur-pipett eller helst filtret utrustade spruta.
- Noggrant flyta avsnittet insamlade på ögonfrans på vatten droplet-programmet.
- Samla delar såhär tills det är lämpligt att kontrollera djupet av snittning.
Obs: Även om det kan vara jobbigt, det är alltid bäst att kolla ofta. - Placera bilden på en värmeplatta som anges till 60 ° C. Låt allt vatten avdunsta och avsnittet att följa bilden.
- Färga sektioner med toluidinblått blå för 10-60 s (färgning tid varierar med snittjockleken). Dosera färgen med en spruta försedd med ett filter (se ovan).
- Placera en droppe av färgen på ena änden av bilden och sprida den använder sidan av nålen utan att röra eller skrapning avsnitten. Placera bilden på värmeplattan för cirka 10-20s.
- Skölj bilden genom besprutning med destillerat vatten i en tvättflaska och placera den på den varma plattan torka den.
- Kolla under mikroskopet förening och bild dem.
- Upprepa tills regionen av intresse nås.
- För Ultra-tunn sektioner: Ange skärande tjocklek mellan 40-60 nm att samla TEM sektioner.
- Snittet om 3-5 sektioner och kontrollera tjocklek med hjälp av en störning färgkarta. Sektioner bör återspegla ljusgrå sedd snett.
Obs: Kloroform ångor kan vara pipetteras över sektioner att slappna av några veck. Detta är mest relevant för erfarna användare och nybörjare behöver inte oroa dig. För mycket kloroform släppt för nära till avsnittet kan skada sektioner. - Plocka upp ett Formvar-belagd, koppar, slot rutnät höll med pincett med Formvar sida upp. Var noga med att inte punktera Formvar beläggning.
- Doppa i rutnätet i båten högkant och från avsnitten, sedan ta rutnätet upp parallellt med ytan under avsnitt. Vid behov Använd ögonfrans för att vägleda avsnitten över nätet.
- Badda försiktigt runt spetsen av tången med filterpapper att suga upp vatten fångade mellan armarna. Om detta inte görs, kan vatten spänning dra nätet upp mellan armarna göra det eller hålla sig till ena sidan. Detta kan leda till kontaminering eller mekaniska skador.
- Ta försiktigt bort överflödigt vatten från rutnätet själv av ständiga rutnätet högkant på filterpapper.
- Placera rutnätet i ett rutnät hållare.
- Upprepa tills tillräckligt sektioner har samlats.
- Semi tunna snitt kan avbildas direkt med någon förening Mikroskop utrustad med en kamera. Nedsänkning olja kan placeras direkt på avsnitten. Bilder bör förvaras i en bild om du vill förhindra missfärgning.
- Färgning ultratunn avsnitt för TEM kontrast
Obs: Följande steg bör utföras under försättsblad som färgerna är ljus och CO2 känslig. Dessutom EM färgämnen använda tungmetaller producera kontrast och är därför farliga ämnen. Lämpliga försiktighet måste iakttas vid hantering av dessa fläckar.- Täcka några stora petriskålar med aluminiumfolie att blockera ljuset. Arbeta under dessa för följande steg. Delvis avslöja dem för att tillåta arbetsrymd men placera täcket tillbaka så snart som möjligt.
- Skär en bit av vax film och noggrant placera fem droppar av 6% mättat uranyl acetat genom att använda en Pasteur-pipett.
- För att förbereda lösningen, blanda 2 g uranyl acetat med 100 mL 50% metanol i destillerat vatten och filtrera lösningen innan du använder. Lösningen kan inte lagras och kan göras färsk varje gång19.
- Försiktigt plocka upp gallren för TEM med pincett och balans ovanpå dye droppar med avsnitt sida ner. Ledighet för 25 min.
- Skölj rutnät individuellt genom att snabbt doppa dem in och ut ur destillerat vatten; framsteg genom fyra olika flaskor med destillerat vatten.
- Placera fem droppar av bly citrate på en färsk bit av filmen. Ordna några NaOH pellets runt dye droppar (detta absorberar atmosfäriskt CO2 för att förhindra utfällning av blykarbonat).
- Att göra bly citratlösningen, förbereda bi-destillerat vatten av kokande destillerat vatten 0,5 h. Tillåt vattnet svalna och i en förslutningsbar behållare, lägga till 0,3 g bly citrat 100 mL av det bi-destillerat vattnet. Tillsätt 1 mL 10 M NaOH, täta behållaren tätt och skaka tills upplöst19.
- Placera gallren på dye dropparna som beskrivs i 4.3 och täck. Fläcken för 5 min.
- Skölj med destillerat vatten som innan genom att doppa gallren och ur destillerat vatten 20 gånger. Framsteg genom tre fartyg destillerat vatten.
- Suga upp överflödigt vatten med filterpapper och tillåta gallren för att torka i en ruta i rutnätet.
- Bilden i en TEM på accelererande lågspänning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoderna som beskrivs här aktivera detaljerad studie av enkelt och fasettögon av myror. Imaging dorsala vyn av huvudet med hjälp av Z-stack fotomikrografi tekniker gör att man kan få en översikt över layouten för det visuella systemet (figur 1). Detta är bra förberedelse för dissektioner och bestämma snittningen vinkeln. Denna teknik är också användbart för att företa mätningar som huvudet bredd, ögat längd och ocellar lins diametrar. SEM imaging också ger detaljerad översiktsbilder men dessutom förvärv av hög förstoring och högupplösta bilder. Vissa regioner av intresse i ögat kan undersökas i detalj och variationer i linsform kan identifieras (figur 2). SEM-bilder är särskilt användbara för att lösa myror med små ögon och vingribborna. Hornhinnan replikerna ger information om form, storlek och antal linser i varje öga (figur 3). Semi tunna snitt avbildas med LM teknik möjliggöra undersökning av ögat (figur 4 och figur 5) brutto inre anatomi Detta inkluderar tjockleken av linsen, diameter av kristallina konen, förekomsten av en kristallin kon-tarmkanalen, form, bredd och längd på den rhabdom, mappning av den dorsala rim området, och platsen för de primära och sekundära pigmentceller. Denna teknik kan kompletteras fint av ultratunna sektioner avbildas med TEM, som gör det möjligt att fastställa ultrastruktur särskilt, microvillar orientering (figur 4) och den kvantifiera mindre strukturer (t.ex., bredden på den förträngda kristallina kon tarmkanalen, figur 5).
Figur 1: Z-stack mikrofotografier av de tre kasterna av australiska socker myran, Camponotus consobrinus. Detta ger en översikt över layouten för det visuella systemet i alla tre kaster. Anpassad från referens20. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Skanna elektronmikrografier ant visuella systemet visar imaging funktionerna i denna teknik. Översta raden visar olika eye positioner och ögat storlekar i: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; och (C) Amblyopone australis (notera den mycket små ögon, vita pilen). Bilder som förvärvas vid hög förstoring visar: (D) tre enkla ögon i arbetstagare av Myrmecia nigriceps; olika storlek förening öga i (E) Rhytidoponera metallica (notera de olika formade ommatidia i olika regioner i förening ögat i gult), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkioch (jag) Pheidole arter. Skala barer = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: hornhinnan repliker av ant ögat och vingribborna. (A) replik av en arbetstagare av Myrmecia nigricepsförening öga. Den konvexa repliken var tillplattad genom att göra snitt. Infällt anger posterior (p), främre (a), och dorsala (d), ventrala (v) axlar. (B) replik av ocelli av arbetaren av Myrmecia tarsata. Skala barer = 0,5 mm (A), 10 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: LM och EM bilder av rhabdom tvärsnitt. (A) tvärsnitt av distala rhabdoms i Myrmecia nigriceps betsad i toluidin blå kan användas för att särskilja rhabdoms som är cirkulär eller rektangulär form. Överföring elektronmikrografier Visa: (B) flera riktningar av Mikrovilli i den cirkulära rhabdom och (C) Mikrovilli orienterade i två motsatta riktningar i den rektangulära formade rhabdom. (D) använda ljusmikroskop, den långa axeln av de rektangulära rhabdoms mappas för att visa en fläkt-liknande organisation i regionen dorsala i ögat i en drottning av Camponotus consobrinus; infälld anger posterior (p), främre (a) och lateralt (l), mediala (m) axlar. Panelen D anpassad från referens20. Skala barer = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: LM och EM bilder av en ommatidium i en ljus-anpassad öga Myrmecia tarsata. (A) längdsnitt av en ommatidium som visar den hornhinnan (C), kristallint kon (CC), kon-tarmkanalen (ct), rhabdom (Rh) och primär pigmentceller (PPC). (B) streckad rektangulära rutan i panel A från ett annat avsnitt som tittade på under en TEM att kvantifiera den smala bredden av kon-tarmkanalen. Anpassad från referens21. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: vanliga problem med semi tunn och Ultra-tunn sektioner (fixering och infiltration, skära och färgning). (A) dålig fixering av vävnad på grund av otillräcklig penetration (pil) i en halv tunna avsnitt av Pheidole arter. (B) rippning vid snittning i Iridomyrmex calvus (semi tunna); (C) perfekt färgning (vänster) och över färgning (höger) med toluidinblått blå i Myrmecia croslandi; (D) pigment (cirkel) och vävnad rippning vid snittning (pilar) på grund av dålig matchning av harts och vävnad densiteten (kåda för mjuk). Vikning av avsnittet (asterisker), kan hända när samla sektioner från båtens kniv; (E) dålig kontrast på grund av otillräcklig färgning (jämför med infälld), bly citrat kristaller (vita pilar) från exponering för CO2, och vertikala kniv märke (svarta pilar); (F) hål i vävnaden (vita pilar) orsakas av dålig fixering i en Melophorus hirsutus förening öga; (G) harts för mjuk, leder till chitter vid snittning ses som vertikala krusningar i avsnittet; (H) avsnitt för tjock (~ 100 nm) resulterade i mörk bild med dålig kontrast, förorenat destillerat vatten leda till bakterier och partiklar utspridda i avsnittet (vita pilar) i Pheidole arter. Skalstapeln = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sviten av metoderna som beskrivs ovan möjliggör en effektiv utredning av det optiska systemet av myror och andra insekter. Dessa tekniker informera vår förståelse av samplingsupplösning, optisk känslighet och potentiella polarisering känslighet i ögat som studeras. Denna kunskap ger en viktig grund för fysiologiska och beteendemässiga utredning av deras visuella funktioner. Dessutom de metoder som beskrivs här har fokuserat på ant visuella system, kan dessa tekniker användas på andra insekter, om än med smärre ändringar i protokollet (t.ex., öka varaktigheten av fixering och infiltration i tjockare vävnader) . Något modifierad protokoll har använts för att karakterisera de visuella system för en mängd insekter däribland cikador22, flugor14, bina23, getingar24, fjärilar25och malar26. Även om de flesta metoder som beskrivs här har varit i bruk under en tid, denna artikel tar tillfället i akt att sammanföra dem i samband med studera Myrans optiska systemet och jämföra alternativa tekniker och beskriva vanliga fallgropar.
Det finns många imaging tekniker tillgängliga som har överlappande ansökningar och det kan vara svårt att bedöma vilken teknik är lämplig för uppgiften. Ett relevant exempel här är att välja en teknik för översikt imaging. Den yttre morfologin i huvud och ögon och relativ placering av det optiska systemet på huvudet kan göras med hjälp av SEM eller fotomikrografi. Styrkor och svagheter av dessa tekniker har varit granskade27, dock finns det några särskilda överväganden när imaging ögon. När imaging av relativ placering och storlek av ögon, har båda teknikerna sina fördelar och nackdelar. SEM-bilder saknar färginformation och därmed där pigmentering är relevanta fotomikrografi är bättre. Dock kan SEM-bilder illustrera böter strukturer såsom Inter ommatidial hårstrån och fasett gränser mer i detalj och även avslöja surface-funktioner inte synlig under fotomikrografi tekniker (t.ex., det ocellar linser, surface skulptur av förening eye linser). SEM är en mångsidig teknik när det kommer till undersökande imaging och identifiera funktioner av intresse eftersom det kan verka på ett stort utbud av specimen storlekar samtidigt behålla mycket hög upplösning i hela detta område. Men, det är inte lika lättillgänglig som en dissektion Mikroskop och kräver en högre nivå av expertis. Ofta finns det inget enda sätt att få den information som en kräver. I ett sådant scenario är det lämpligt att överväga vad som finns och där det är viktigast att satsa resurser.
Nagellack repliker av hornhinnan har visat sig vara mest användbara i att få det mest exakta måttet på facet siffror och fasett diametrar. Detta har nu använts i en mängd insekter11,22,28,29. Kvaliteten på de bilder som förvärvats från en SEM är vida överlägsen, förhindrar krökning av ögat noggranna mätningar i hela facet matrisen. Kartläggning fasett storleken och fasett fördelningen bör också vara möjligt från genomsökningar som förvärvats från mikro-datortomografi5.
I både LM och TEM tekniker är det ofta svårt att veta om provet har upprättats och behandlas väl tills den sista etappen av imaging. För att undvika komplikationer, är det viktigt att fastställa god praxis såsom att upprätthålla rena arbetar utrymmen och verktyg, förbereda färska lösningar regelbundet och grundligt filtrering vatten. Föroreningar som är osynliga för blotta ögat kan förstöra EM prover. Därför kan det vara användbart att torka ytor och instrument med ett lösningsmedel, såsom etanol eller aceton och en icke-lint producerar torka. Detta är mest relevant när snittning, färgning EM sektioner, och förbereder SEM prover. Likaså destillerat vattenkällor kan presentera problem och införa främmande ämnen så är det alltid bäst att kontrollera filter, ändra dem regelbundet och Använd alltid fräscht filtrerat vatten (förvara inte). De flesta fixativ, fläckar och inbäddning material kan inte lagras på obestämd tid och det är viktigt att märka alla lösningar med datum för beredning. Det är viktigt att ta ett systematiskt tillvägagångssätt och avsätta tillräckligt med tid för att utföra protokoll utan avbrott.
Anpassa tekniker för att olika arter är alltid en fråga av trial and error. När du arbetar inom Formicidae, ligga de största skillnaderna i storlek på djuret och muskelmassa i huvudet. Myror med mer muskulatur i huvudet tar normalt längre tid att fixa. Med mycket stora myror är det bäst att ta bort den mandibular muskler, luftstrupen och mandibular körtlar, samtidigt som man garanterar minsta möjliga störning med nervvävnad. I små myror och de med några mandibular muskler är det möjligt att uppnå adekvat fixering genom att bara ta bort Underkäkar och utsätta den clypeal regionen. I dessa fall kan små hål med hjälp av minutiae pins göras på huvudet att förbättra fixering.
Det är viktigt att notera att miljöförhållanden kan också påverka preparat. Varma och fuktiga miljöer (särskilt fältstationer i tropikerna) kan visa sig vara en utmaning under infiltration. Varma förhållanden kan leda hartser att delvis polymerisera förtidigt resulterar i oanvända kådan blir allt mer trögflytande. I det här fallet är det bästa alternativet att lagra kådan i liten, enkel användning, behållare i kylen eller frysen. Kylning fixativ kan vara till hjälp för counter snabbare vävnad sönderfall i varma förhållanden. Dock är kyls lösningar kommer att skingra långsammare vilket innebär att behandlingstider bör förlängas för att säkerställa korrekt penetration.
Med dessa varningar i åtanke, kan utredning av det optiska systemet av myror och andra insekter bevisa mycket givande. Studera det visuella systemet gör det möjligt för oss att uppskatta storleken på visuella fält, interommatidial vinklar, optisk känslighet och provtagning resolutioner. Förstå anatomin av ögat informerar vår förståelse och tolkning av djurens beteende. Till exempel anatomi tillåter oss att göra prognoser på visuella funktionerna i djur som om de är nattaktiva eller nattdjur, som kanske inte har tidigare dokumenterats. Med tanke på den nuvarande kunskapen om det visuella systemet av handfull myror, hoppas vi att våra metoder kan inspirera biologer och myrmecologists att undersöka förening öga och vingribborna i myror för att främja vår förståelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Jochen Zeil, Paul Cooper och Birgit Greiner för att dela sin kunskap i insekters anatomi och för att demonstrera flera av teknikerna vi har beskrivit här. Vi är tacksamma för den begåvade och stödjande Personalen på centrum för avancerad mikroskopi på ANU och The Microscopy Unit på MQU. Detta arbete stöds av en graduate stipendium till FRE och bidrag från det australiska forskningsrådet (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
