Summary
Dit artikel beschrijft een reeks van technieken in licht- en elektronenmicroscopie te bestuderen van de interne en externe oog anatomie van insecten. Het gaat hierbij om verschillende traditionele technieken geoptimaliseerd voor werk op mier ogen, gedetailleerde probleemoplossing, en suggesties voor optimalisatie voor verschillende exemplaren en regio's van belang.
Abstract
Dit artikel schetst een suite van technieken in (LM) de lichte microscopie en elektronenmicroscopie (EM) die kan worden gebruikt voor de studie van de anatomie van de interne en externe oog van insecten. Het gaat hierbij om traditionele histologische technieken geoptimaliseerd voor werk op mier ogen en aangepast om te werken in concert met andere technieken zoals Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) en scanning elektronen microscopie (SEM). Deze technieken, kunnen hoewel enorm nuttig, moeilijk zijn voor de beginnende microscopist, zodat grote nadruk in dit artikel over probleemoplossing en optimalisatie voor verschillende exemplaren. Wij verstrekken informatie over imaging technieken voor het hele model (foto-microscopie en SEM) en bespreken hun voor- en nadelen. We markeren de techniek die gebruikt wordt bij het bepalen van de diameter van de lens voor het hele oog en bespreken van nieuwe technieken voor verbetering. Tot slot bespreken we technieken die betrokken zijn bij de voorbereiding van monsters voor LM- en TEM, afdelen, kleuring en imaging van deze monsters. We bespreken de horden die één zouden kunnen komen over als voorbereiding van monsters en de beste manier om te navigeren naar hen.
Introduction
Visie is een belangrijke sensorische modaliteit voor de meeste dieren. Visie is vooral belangrijk in het kader van navigatie voor het aanwijzen van doelstellingen, vaststelling van vast te houden aan routes en verkrijgen van kompas informatie1,2. Insecten detecteren visuele informatie met behulp van een paar samengestelde ogen en, in sommige gevallen één tot drie dorsally geplaatste eenvoudige ogen genoemd ocelli3,4,5.
De ogen van mieren zijn van bijzonder belang omdat, terwijl de mieren zijn verbazingwekkend verschillend, ze enkele belangrijke kenmerken over soorten besparen. Ondanks de dramatische variatie in de anatomie, de grootte en ecologie, de overgrote meerderheid van de soorten zijn eusociale en leven in kolonies; Dientengevolge, uitdagingen verschillende soorten soortgelijke visuele in termen van het heen en weer navigeren tussen een centrale plaats en middelen. Over mieren kan de dezelfde fundamentele oog-bauplan worden waargenomen bij dieren variërend van 0,5-26 mm in lengte, uitsluitend dagverloop naar strikt nachtactieve soorten, en traag lopen ondergrondse naar visuele roofdieren6,7, springen 8,9,10. Al deze duizelingwekkende verschillen in ecologie en gedrag geeft aanleiding tot talloze permutaties van de dezelfde fundamentele oog structuren aanpassen aan verschillende omgevingen, levensstijlen en lichaam-maten11,12. Dientengevolge, biedt bestuderen van de visuele ecologie van mieren een ware schat aan mogelijkheden om de vastberaden onderzoeker.
Inzicht van het visuele systeem van insecten is essentieel bij het verkrijgen van inzicht in hun gedrags vermogens. Dit blijkt uit integrative studies die mooi anatomie met ecologie en gedrag tot een groot succes in een paar insecten groepen (bijvoorbeeldverwijzingen13,14,15,16, combineren 17). Hoewel het gebied van ant navigatie en ant gedrag in het algemeen heel succesvol geweest, heel weinig nadruk is gelegd op mier visie buiten een paar geselecteerde soorten. Hier, zullen we ingaan op de technieken die betrokken zijn bij het onderzoeken van oog ontwerp van mieren. Terwijl we ons op mieren richten zullen, deze technieken kunnen worden toegepast, met kleine aanpassingen, aan andere insecten, ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. model voorbereiding
Opmerking: Het is noodzakelijk om te begrijpen eerst de relatieve locatie van de samengestelde ogen en ocelli aan elkaar en op het hoofd. Dit kan worden bereikt door de verwerving van de beelden van de dorsale weergave van het hoofd. Hiervoor raden we verwerking monsters voor photomicrography of met behulp van SEM technieken. Hieronder zijn de stappen betrokken bij beide processen.
-
Monster collectie
- Verzamelen en opslaan van specimens rechtstreeks in 70% ethanol. Verzamel verschillende kasten waar mogelijk.
- Exemplaren met de tijd, datum, label en plaats en eventuele andere relevante opmerkingen (bijvoorbeeldverzameld tijdens het foerageren, aggregatie, paring nesten binnen een takje, enz.)
- Verzamel genoeg exemplaren als u wilt dat meerdere replicatieonderzoeken bij elke behandeling.
-
Photomicrography and Z-stapelen
- Droge monsters lucht en hen te monteren op driehoekig punt kaarten, met behulp van water oplosbare lijm, en vervolgens op een insect Pins. Voor meer informatie, zie referentie18.
- Beeld met behulp van een hoge vergroting stereomicroscoop met een Z-Stappenmotor en een kleurencamera.
- Gebruik een diffuser om uniforme verlichting voor specimens.
- Beelden op verschillende vlakken die focal vastleggen en opslaan van afbeeldingen in een lossless-bestandsindeling (zoals TIFF-bestand) en de focus stack hen met behulp van commercieel beschikbare software.
-
Scanning electron microfoto
Opmerking: Grondig schoon alle tools en werkende oppervlakken met ethanol om te voorkomen dat besmetting van het specimen met stof en andere deeltjes.- 'S nachts specimens in ethanol uitdrogen en lucht droog in een petrischaal.
- Gebruik een scherp scheermesje te scheiden van het hoofd van de rest van het lichaam.
- Mount het hoofd onder de vereiste kijkhoek (bijvoorbeelddorsale naar boven) op aluminium stubs met geleidende koolstof tape of tabbladen. De koolstof-tape in dunne reepjes gesneden en vouw het ter ondersteuning van de hoofd capsule.
- Gebruik een sputter coater goud toepassen op het oppervlak van het model voor 2 min 20 mA met een roterende stadium. De tijd en het huidige wellicht worden aangepast op basis van het instrument.
- Specimens overbrengen in een nieuwe aluminium beginnetje met verse koolstof tape of tabbladen.
Opmerking: De ongecoate koolstof zal een zwarte achtergrond maar overdracht van specimens de gouden coating kan beschadigen. - Controleer dat het specimen oriëntatie klopt nog steeds met behulp van een Microscoop ontleden en pas desgewenst met een paar fijne pincet of soortgelijk gereedschap. Wees voorzichtig niet te krabben van de gouden coating; handvat zo weinig mogelijk.
- Laden exemplaren op de SEM stub houder, maken van de nota van het standpunt van stubs en monsters ten opzichte van elkaar.
Opmerking: Sommige SEMs zijn uitgerust met een fase-camera, maar velen zijn niet en het kan moeilijk zijn om kleine exemplaren vinden op hoge vergroting. - Het imago van de specimens. Gebruik een versnellende laagspanning te voorkomen opladen en een klein diafragma voor goede diepte van het veld.
Opmerking: Instellingen zijn beste geoptimaliseerd in overleg met een technicus gespecialiseerd in het bepaalde instrument wordt gebruikt.
2. het kwantificeren van Facet nummers en Diameters
-
Hoornvlies replica 's
- Gebruik mieren bewaard in ethanol of gemonteerd op een PIN-code voor dit doel (stap 1.1.1).
- Monteer het dier op een insect pins of plasticine. Als het hoofd relatief groot is, kunnen de overige lichaamsdelen worden verwijderd.
- Gebruik een insect pin of een fijne tandenstoker te halen van een kleine daling van kleurloze nagellak sneldrogende en het snel verspreid over het oog. Zorg ervoor dat de pin doet geen krassen op het oog. De nagellak dient het hele oog en een aantal van de omliggende hoofd capsule.
Opmerking: Het is belangrijk dat de nagellak van relatief uniforme dikte over het oog. - Laat de nagellak om in te stellen bij kamertemperatuur.
- Nadat het volledig is ingesteld, gebruik een fijne insect pin te heffen zachtjes de replica van de hoofd capsule rond het oog.
- Gebruik een fijn paar schone pincet te heffen van de replica, begrijpen van het deel van de replica die betrekking heeft op het hoofd en niet het oog.
- Zorgen voor bewustwording van de oriëntatie van het oog: de regio anterior, achterste dorsale en ventrale.
- Plaats de replica op een glasplaatje. Gebruik een scheermesje de replica door het zorgvuldig verwijderen van overtollig materiaal rond het oog trim. Gebruik een naald of een paar van de verlostang om te voorkomen dat de replica verplaatsen.
- Als het oog zeer convex is, gebruik een scheermesje te maken van 3-4 fijne gedeeltelijke radiale insnijdingen op de rand te helpen 'plat' de replica. Als het oog is relatief 'vlakke', is er niet nodig om dergelijke insnijdingen.
- Plaats een cover slip zachtjes op het oog replica, ervoor te zorgen dat de oriëntatie van de replica is bekend. Niet van toepassing druk zoals dit een einde aan het hoornvlies indruk op de nagellak maken kan.
- Zegel van het dekglaasje aan met behulp van zeer weinig nagellak op de vier hoeken. Als de nagellak tussen de cover slip en glas slides stroomt, beschadigt het de replica.
- Het imago van de dia op een samengestelde microscoop.
Opmerking: als er slechts enkele facetten in focus zijn, dan dit suggereert dat de replica van het oog is niet afgeplat genoeg. Verwijderen en opnieuw te beginnen vanaf stap 2.1.3. - De afbeelding importeren in vrij beschikbare programma's zoals ImageJ/Fiji waar het aantal ommatidia en de grootte van elke ommatidia kunnen worden gemeten.
Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt om voor te bereiden van replica's van ocelli, ook. Aangezien het een enkele lens, raden we alle de ocelli samen in de ene replica.
3. het analyseren van de structuur van het oog
Opmerking: Om de studie van de anatomie van het oog vereist in de meeste gevallen twee complementaire technieken van LM- en TEM. De eerste verwerking stadia vereisen vergelijkbare technieken voor LM zowel TEM. Het verschil komt voort uit de vectorafbeeldingsbestanden fase vanaf. Verwerking van de monsters, vereist het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen die moeten worden behandeld met zorg en op verantwoorde wijze verwijderd. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, werken in een zuurkast, lees altijd de veiligheid gegevens sheets(SDS), en risico-evaluaties uitvoeren voordat u begint.
- Dissectie
- Anaesthetize exemplaren door afkoeling of door blootstelling aan verontreinigende gassen CO2.
- CO2 anesthesie is zeer snel (over het algemeen onder 1 min) en moet worden gezorgd om te voorkomen dat de overmatige blootstelling, zoals dit in de dood van het specimen resulteren kan. Als met behulp van droogijs pellets (solid CO2) Vermijd direct contact met exemplaren, zoals dit koude brandwonden kan veroorzaken.
- Koude anesthesie is langzamer; 4 ° C volstaat, en koudere temperaturen worden niet aanbevolen. Vast een geschikte koeling tijd voor de soort. Grote of koude bestendig mieren zoals stier mieren voorschrijven > 10 min tot volledig geïmmobiliseerdet, terwijl kleinere soorten slechts 1-2 min. buitensporige koeling wellicht het monster zal doden (Vermijd direct contact met ijs). Monsters moeten bij voorkeur worden gehouden in kleine, schuim-kolven, plastic containers en geplaatst in een koelbox waar ze kunnen worden waargenomen in plaats van in een elektrische koelkast of diepvriezer.
- Specimen op een petrischaal plaatsen en aanpassen voor het bekijken onder een Microscoop ontleden. Snel werken is belangrijk voor het behoud van anesthesie en om te voorkomen dat de degeneratie van het weefsel, zodra incisies worden gemaakt (dit kan gebeuren binnen enkele seconden).
- Verwijder antennes met een tang. Als u werkt met een stekende insecten, is het raadzaam te amputeren de gaster eerst om te voorkomen dat wordt gestoken.
- Verwijder de mond delen met behulp van een scherp scheermesje; pincet kan worden gebruikt om het model ingedrukt. Snijden door het voorste deel van het oog (grote exemplaren) of zo dicht bij de ogen mogelijk (kleine exemplaren) zonder het trekken op de hersenen als dit van het netvlies scheuren kunnen.
- Voorbereiden om te openen de hoofd capsule. Hoek van het model, zodat de eerste snede is omhoog; Dit kan geschieden hetzij onder de ontleden Microscoop terwijl het model in de pincet of onder visuele controle terwijl het model tussen de duim en voorgrond vinger.
- Maken van een dwarse incisie door het hoofd te verwijderen het ventrale gedeelte van het hoofd; deel van het ventrale oog worden verwijderd in de grote soorten fixatie en infiltratie te verbeteren. Het hoofd moet nog steeds worden gekoppeld aan het lichaam op dit punt.
- Het verbreken van de hoofd capsule uit het lichaam doordat een coronale insnijding net posterieure voor het oog van de compound.
- Plaats de ontleed hoofd capsule met de samengestelde ogen in ijs koud fixeerspray: 2,5% Glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in fosfaatbuffer (pH 7,2-7,5).
Let op: Fixeer is bijtende en giftige; Draag passende bescherming en werken in een zuurkast.
Opmerking: Het is belangrijk om snel te arresteren zenuwweefsel degeneratie. De dissectie moet worden voltooid in 2 minuten of minder (efficiënte dissectie kan enige oefening vereisen).
Opmerking: Als het oog moet worden aangepast aan de omstandigheden van licht of donker, dan eerst bloot de dieren naar de vereist lichte voorwaarde voor een paar uur. Verrichten de ontledingen in de respectieve lichtomstandigheden. Dissecties kunnen worden uitgevoerd onder de rode lichten te simuleren van duisternis.
- Anaesthetize exemplaren door afkoeling of door blootstelling aan verontreinigende gassen CO2.
- Specimen verwerking
- Houden de specimens in het fixeer bij kamertemperatuur met beweging op een roteerschudapparaat, want 2 h. grote exemplaren mogelijk langere fixatie tijden.
- Verwijder de fixeer en gooi het op de juiste manier. Wassen modellen in de kamertemperatuur fosfaatbuffer (3 keer, 5 minuten elk) op het schudapparaat.
Opmerking: De fosfaatbuffer bestaat uit 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g nb2HPO4en 0.244 g KH2PO4 in 1 liter gedistilleerd H2O (pH 7,2). - De fosfaatbuffer verwijderen en toevoegen van 2% OsO4. Plaats de specimen jar op het schudapparaat in de zuurkast voor 1-2 h. Dit is een stap na fixatie op te lossen van vetten en contrast ook voorzien in TEM.
Opmerking: Osmium fixatie tijden zijn afhankelijk van de grootte van het specimen; berekenen als een ruwe vuistregel, 1 h van fixatie per 1 mm3. - De osmium-oplossing verwijderen en verwijdering van het op de juiste manier. Wassen modellen in de kamertemperatuur buffer (3 keer, 5 minuten elk) op het schudapparaat.
- Uitdrogen van de specimens door ze te plaatsen in toenemende concentraties van ethanol of aceton; bijvoorbeeld 50, 70, 80 en 95% voor elke 10 min en tot slot 100% (2 keer 15 minuten elk). Plaats de specimens op het schudapparaat tussen de oplossing verandert.
Opmerking: Indien nodig, monsters kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol's nachts. - Drain de ethanol en 100% aceton toevoegen. Laat het gedurende 20 minuten op het schudapparaat (Sla deze stap als het drogen in aceton). Vervangen door verse aceton en laat het voor een extra 20 min.
- Infiltreren in de weefsels met hars met behulp van de volgende verhoudingen van aceton aan hars: 2:1 (3 h), 1:1 ('s nachts), 1:2 (4 h) en pure hars ('s nachts). Bij elke stap laat exemplaren op het schudapparaat binnen de zuurkast en cap van de container voor alle, maar de laatste twee stappen.
Opmerking: Hars is al te visceus te worden afgevoerd zodat exemplaren moeten worden verplaatst naar een nieuwe besteedbaar container bij elke stap. - Bereiden blokken te monteren van de monsters. Blokken kunnen aangepaste verfilmd door snijden acrylglas kleine rechthoekige blokken (1,5 x 0.5 x 0.3 cm). Blokken kunnen ook worden gedaan door gieten epoxyhars (er zijn veel commerciële kits beschikbaar) in een mal van silicium en dan genezen in de oven gedurende 12-14 uur bij 60 ° C.
Let op: Niet-uitgeharde (vloeibare) hars is kankerverwekkend en moet worden teruggestuurd naar de oven totdat volledig gehard. - Plaats het blok verticaal in de mal. Zorgvuldig Neem de specimens van de vloeibare hars, laat overtollige hars voor de afvoer, en plaats van het model op de bovenkant van het blok. Een kleine hoeveelheid extra hars kan worden gebruikt voor binding van het model aan het blok.
- Het label van het blok. De etiketten van het papier afdrukken en insluiten in het blok of koppelen aan een blok-gezicht.
- Houden van de schimmel met de ingesloten blokken in de oven gedurende 12-14 uur bij 60 ° C.
- Het specimen blok in een schone envelop opslaan. Dit kan op deze manier worden opgeslagen gedurende enkele maanden tot jaren.
- Laat de gebruikte containers, vuile handschoenen en andere verontreinigde apparatuur in de zuurkast dat aceton volledig verdampen (minimaal 12 h).
- Uitharden hars in de oven voordat teruggooi wegwerp apparatuur of schrapen hars uit andere items zoals pincet.
- Afdelen
- Let op het blok onder de ontleden Microscoop om ervoor te zorgen dat het specimen afdrukstand geschikt voor het vectorafbeeldingsbestanden vliegtuig is.
- Als de afdrukstand niet geschikt is, gebruikt u een juwelier zag te snijden uit het model en heroriënteren met fragmenten van set hars en verse hars opnieuw plaats biedt aan het model. Het hoofd kunnen ook worden verdeeld in twee helften afzonderlijk deel van de twee ogen. Genezen hars opnieuw voordat u verdergaat.
- Monteren van het blok op de verwisselbare microtoom chuck. Verwijder de chuck en plaats op de houder.
- Trim het blok van de hars met behulp van een scheermesje onder de Microscoop ontleden.
Let op: Doe dit niet wanneer de chuck is gemonteerd op de microtoom arm als het kan de arm schok en schade van de lagers. - De chuck op de arm van de microtoom remount en hoek van het model.
- Monteren van het mes op de houder op de juiste hoek (0° voor glas messen, zie de instructies van de fabrikant voor diamant messen).
Opmerking: Glas messen goedkoop gemaakt kunnen worden met een glas mes maker maar moeten periodiek worden vervangen als ze hun rand verliezen; hoge kwaliteit diamant messen kunnen worden gekocht, maar zijn duur, speciale zorg behoeven, en zijn niet geschikt voor beginners. - Vul de mes boot met gedestilleerd water met een injectiespuit voorzien van een filter (0,45 µm poriëngrootte).
- Vul de boot totdat het water de rand van het mes bereikt; de meniscus mogelijk convexe in andere gebieden van de boot.
- Giet de boot totdat de meniscus zeer licht concave is maar nog steeds de rand van het mes bereikt. Het niveau van het water kan worden aangepast op elk gewenst moment, maar altijd uit de buurt van de rand van het mes.
- Zorgvuldig het mes naar het model brengen en uitlijnen van het blok aan het mes. Dit gebeurt best langzaam, regelmatig controleren van de nabijheid van het mes door het oculair en vanaf de zijkant.
Opmerking: Controleer het instrument handboek voor specifieke instructies zoals instrumenten variëren. - De dikte van de sectie instellen op de microtoom. Selecteren van de juiste dikte zal afhankelijk van model grootte, regio van belang en het soort mes wordt gebruikt worden.
- Als met behulp van een glas mes een hogere instelling (bijv., 4 µm), selecteert als een heleboel materiaal weggesneden worden moet vóór het bereiken van het interessegebied. Als een diamant mes wordt gebruikt of als het model zeer klein is, 1-2 µm meer geschikt wellicht.
- Start de "snijden" (het aanzwengelen van de microtoom wiel) wanneer het mes dicht is, maar nog niet het snijden in het model voor het uitvoeren van het laatste deel van de aanpak. Secties moeten beginnen te verschijnen binnen een paar rotaties; Als dat niet het geval is, stop en zeer zorgvuldig het mes een beetje dichter brengen.
- Aanpassen van de sectie verzamelen dikte (1 µm voor semi-dunne secties) wanneer het naderen van de regio van belang.
- Verzamelen geen secties met een wimper-gereedschap.
Nota: Wimper tools kunnen worden gemaakt met een wimper gemonteerd op een dunne stok met nagellak. - Als een heleboel materiaal moet worden verwijderd, kunt u de secties te accumuleren en massaal verwijderen door het verwijderen van het mes en het uit te spoelen met water. Als met behulp van een glas-mes, kan dit een geschikte tijd om te veranderen naar een nieuwe sectie van het mes of naar een nieuw mes worden.
- Plaats een serie van kleine druppels met gedestilleerd water op een dia met behulp van een pipet van Pasteur of ideaal, het filter voorzien spuit.
- Voorzichtig zweven de verzamelde sectie op de wimper op de druppel water.
- Verzamelen afdelingen zoals dit totdat het is dienstig om te controleren de diepte van het segmenteren.
Opmerking: Hoewel het vervelend worden kan, het is altijd het beste om te controleren vaak. - Plaats van de dia op een kookplaat ingesteld op 60 ° C. Toestaan dat al het water te laten verdampen en de sectie aan de dia te houden.
- Secties met toluïdine blauw voor 10-60 s kleurstof (kleuring van tijd zal variëren met de dikte van de sectie). Afzien van de kleurstof met een injectiespuit voorzien van een filter (zoals hierboven).
- Breng een druppel van de kleurstof aan het ene uiteinde van de dia en verspreid met behulp van de kant van de naald zonder aan te raken of schrapen van de secties. Plaats de dia op de kookplaat voor ongeveer 10-20s.
- De dia door te besproeien het met gedestilleerd water in een fles van wassen spoelen en plaats deze op de hete plaat om te drogen.
- Controleer onder de samengestelde microscoop en beeld hen.
- Herhaal totdat regio van belang is bereikt.
- Voor ultra-dunne secties: instellen van de snijdikte tussen 40-60 nm tot het verzamelen van TEM secties.
- Gesneden over 3-5 secties en een selectievakje dikte met behulp van een kleurenoverzicht van interferentie. Secties moeten nadenken lichtgrijs wanneer bekeken in een hoek.
Opmerking: Chloroform dampen kunnen worden pipetted over secties om te ontspannen van eventuele kreukels. Dit is het meest relevant zijn voor ervaren gebruikers en beginners hoeft geen zorgen te maken. Teveel chloroform vrijgegeven te dicht naar de sectie kan beschadigen secties. - Een raster van de Formvar-gecoat, koper, sleuf opgehouden met een tang met de Formvar kant halen. Wees voorzichtig niet om het doorprikken van de Formvar-coating.
- Dompel het raster in de boot edgeways en uit de buurt van de secties, breng vervolgens het raster van parallel aan het oppervlak onder de secties. Indien nodig kunt de wimper begeleiden de secties over het raster.
- Schar zorgvuldig rond de tip van de verlostang met filtreerpapier te genieten van water gevangen tussen de armen. Als dit niet gebeurt, kan water spanning het raster optrekken tussen de takken of het vasthouden aan de ene kant maken. Dit kan leiden tot besmetting of mechanische schade.
- Verwijder voorzichtig door het raster edgeways op filterpapier permanent overtollig water van het raster zelf.
- Plaats het rooster in een raster-houder.
- Herhaal totdat voldoende secties zijn verzameld.
- Semi-dunne secties kunnen worden beeld direct met een samengestelde microscoop uitgerust met een camera. Onderdompeling olie kan rechtstreeks op de secties worden geplaatst. Dia's moeten worden opgeslagen in een dia-vak om te voorkomen dat de verkleuring.
- Kleuring van de ultra-dunne sectie voor TEM contrast
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder dekking zoals de kleurstoffen licht en CO2 gevoelig zijn. Bovendien, EM verfstoffen gebruiken zware metalen om te produceren van contrast en zijn daarom gevaarlijke stoffen. Passende zorg moet worden genomen bij de behandeling van deze vlekken.- Dekking van een paar grote petrischaaltjes met aluminiumfolie aan het licht blokkeren. Werken onder deze voor de volgende stappen uit. Gedeeltelijk ontdekken ze werken ruimte maar plaats de covers terug op zo spoedig mogelijk.
- Knip een stukje van de film wax en zorgvuldig plaats vijf druppels van 6% verzadigd uranyl acetaat op met behulp van een pipet van Pasteur.
- Ter voorbereiding van de oplossing, 2 g uranyl acetaat met 100 mL 50% methanol in gedistilleerd water meng en filtreer de oplossing vóór gebruik. De oplossing kan niet worden opgeslagen en elke tijd19vers moet worden gemaakt.
- Zorgvuldig pikken de TEM-rasters met pincet en evenwicht op de top van kleurstof druppeltjes met de sectie zijde naar beneden. Laat gedurende 25 minuten.
- Spoel rasters individueel door dompelen hen snel in en uit gedistilleerd water; vooruitgang door middel van vier verschillende flesjes van gedestilleerd water.
- Plaats vijf druppels voor lood citraat op een nieuw stuk van de film. Regelen van een paar NaOH pellets rond de druppels kleurstof (dit absorbeert atmosferische CO2 om te voorkomen dat neerslag van lood carbonaat).
- Om de voorsprong citraatoplossing, bi-gedestilleerd water door kokend gedestilleerd water voorbereiden 0.5 h. toestaan het water afkoelen en voeg in een afsluitbare container, 0,3 g voorsprong citraat tot 100 mL van de bi-gedestilleerd water. Voeg 1 mL 10 M NaOH, verzegelen van de container strak, en schud tot opgeloste19.
- Plaats de rasters op de druppels kleurstof zoals beschreven in de punten 4.3 en dekking. Vlek gedurende 5 minuten.
- Spoel in gedistilleerd water als vóór door dompelen de rasters in en uit gedistilleerd water 20 keer. Vooruitgang door middel van drie schepen van gedestilleerd water.
- Opzuigen van overtollig water met filtreerpapier en laat de rasters te drogen in een raster-vak.
- Afbeelding in een TEM op laagspanning versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven methoden inschakelen gedetailleerde studie van de eenvoudige en samengestelde ogen van mieren. Beeldvorming van de dorsale weergave van het hoofd met behulp van Z-stack photomicrography technieken kan men krijgen een overzicht van de indeling van het visueel systeem (Figuur 1). Dit is een goede voorbereiding voor ontledingen en om te bepalen van de vereiste vectorafbeeldingsbestanden hoek. Deze techniek is ook handig voor metingen zoals ocellar lens diameter hoofd breedte en lengte van het oog. SEM imaging geeft ook gedetailleerde overzicht beelden maar bovendien kunt verwerving van hoge vergroting en hoge resolutiebeelden. Bepaalde gebieden van belang in het oog kunnen worden onderzocht in detail en variaties in de vorm van de lens kunnen worden geïdentificeerd (Figuur 2). SEM beelden zijn vooral nuttig voor het oplossen van mieren met kleine ogen en ocelli. Het hoornvlies replica's bevatten informatie over de vorm, de grootte en het aantal lenzen in elk van beide ogen (Figuur 3). Semi-dunne secties image gemaakt met behulp van LM technieken mogelijk onderzoek van de bruto binnenlandse anatomie van het oog (Figuur 4 en Figuur 5); het gaat hierbij om de dikte van de lens, de diameter van de kristallijne kegel, aanwezigheid van een kristallijne kegel tractus, vorm, breedte en lengte van de rhabdom, de dorsale rim gebied, en de locatie van de primaire en secundaire pigment cellen toewijzen. Deze techniek kan worden mooi aangevuld met uiterst dunne secties image gemaakt met behulp van TEM, die het mogelijk maakt voor het bepalen van de ultrastructuur vooral de microvillar oriëntatie (Figuur 4) en het kwantificeren van de kleinere structuren (bijvoorbeeld breedte van de vernauwde kristallijne kegel tractus, Figuur 5).
Figuur 1: Z-stapel photomicrographs van de drie kasten voor de Australische suiker ant, Camponotus consobrinus. Dit geeft een overzicht van de indeling van het visuele systeem in alle drie kasten. Aangepast van referentie20. Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Scanning electron microfoto van het visuele systeem van mier aan te tonen de beeldvormende mogelijkheden van deze techniek. Bovenste rij toont verschillende oog posities en oog maten in: (A) Buldogmier nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; en (C) Amblyopone australis (Let op de zeer kleine ogen, witte pijl). Beelden verworven bij hoge vergroting weergegeven: (D) de drie eenvoudige ogen in werknemers van Buldogmier nigriceps; verschillende formaat compound eye in (E) Rhytidoponera metallica (Let op de verschillende ommatidia in de vorm verschillende regio's van de compound eye in geel), (F) Amblyopone australis(G) Buldogmier pyriformis, (H) Orectognathus clarki, en (ik) Pheidole soorten. Schaal bars = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: hoornvlies replica's van ant oog en ocelli. (A) Replica van het oog van de compound van een werknemer van Buldogmier nigriceps. De convexe replica werd de grond gelijkgemaakt door het maken van insnijdingen. De inzet geeft posterior (p), anterior (a), en dorsale (d), ventrale (v) assen. (B) Replica van de ocelli van werknemer van Buldogmier tarsata. Schaal bars = 0.5 mm (A), 10 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: LM en EM beelden van rhabdom dwarsdoorsneden. (A) dwarsdoorsnede van de distale rhabdoms in Buldogmier nigriceps in toluïdine blauw gekleurd kan worden gebruikt om te onderscheiden rhabdoms die circulaire of rechthoekig van vorm. Transmission electron microfoto Toon: (B) meerdere oriëntaties van de microvilli in de circulaire rhabdom en (C) microvilli georiënteerde in twee tegengestelde richtingen in de rechthoekige gevormde rhabdom. (D) gebruiken de lichte microscopie, de lengteas van de rechthoekige rhabdoms worden toegewezen om aan te tonen van een fan-achtige organisatie in de dorsale regio van het oog in een koningin van Camponotus consobrinus; inzet toont u posterior (p), anterior (a) en laterale (l), mediaal (m) assen. Deelvenster aangepast van referentie20D. Schaal bars = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: LM en EM beelden van een ommatidium in een licht aangepaste oog van Buldogmier tarsata. (A) Langsdoorsnede van een ommatidium toont het hoornvlies (C), kristallijne kegel (CC), kegel tractus (ct), rhabdom (Rh) en primaire pigment cellen (PPC). (B) Dashed rechthoekig vak in deelvenster A uit een verschillende sectie bekeken onder een TEM te kwantificeren van de smalle breedte van de kegel tractus. Aangepast van referentie21. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: bekende problemen met semi-dun en ultra-dunne secties (fixatie en infiltratie, snijden en vlekken). (A) slechte fixatie van weefsel als gevolg van onvoldoende penetratie (pijl) in een semi-dunne sectie Pheidole soorten; (B) rippen tijdens het segmenteren in Iridomyrmex calvus (semi-dun); (C) perfect kleuring (links) en over de kleuring (rechts) met toluïdine blauw in Buldogmier croslandi; (D) pigment (cirkel) en weefsel rippen tijdens het segmenteren (pijlen) als gevolg van slechte afstemming van de hars en weefsel dichtheid (hars te zacht). Vouwen van de sectie (sterretjes), kan gebeuren bij het verzamelen van secties van de mes-boot; (E) armen contrast als gevolg van onvoldoende kleuring (in vergelijking met inzet), lood citraat kristallen (witte pijlen) van blootstelling aan CO2, en verticale mes markeren (zwarte pijlen); (F) gaten in het weefsel (witte pijlen) veroorzaakt door slechte fixatie in een Melophorus hirsutus compound eye; (G) hars te zacht, leidt tot chitter wanneer afdelen gezien als verticale rimpelingen in de sectie; (H) sectie te dik (~ 100 nm) resulteerde in donkere afbeelding met slechte contrast, verontreinigde gedestilleerd water tot bacteriën en zwevende deeltjes verspreid over de sectie (witte pijlen) in Pheidole soorten. Schaal bar = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De suite van bovengenoemde methoden, is voorzien van een daadwerkelijk onderzoek naar het optische systeem van mieren en andere insecten. Deze technieken informeren ons begrip van de sampling-resolutie, optische gevoeligheid en potentiële polarisatie gevoeligheid van het oog wordt onderzocht. Deze kennis is een belangrijke basis voor fysiologische en gedragsmatige onderzoek naar hun visuele mogelijkheden. Bovendien, terwijl de hier gedetailleerde methoden hebben gericht op mier visuele systemen, deze technieken kunnen worden gebruikt op andere insecten, zij het met kleine wijzigingen in het protocol (bijvoorbeeldverhoging van de duur van de fixatie en infiltratie in dikkere weefsels) . Enigszins gewijzigde protocollen zijn gebruikt om het karakteriseren van de visuele systemen van allerlei insecten met inbegrip van cicaden22, vliegen14bijen23, wespen24, vlinders25en vlinders en26. Hoewel de meeste van de technieken beschreven hier geweest in gebruik voor enige tijd, dit artikel neemt de gelegenheid te Breng ze samen in het kader van het bestuderen van de mier optische systeem en vergelijken van alternatieve technieken en beschrijven van de gemeenschappelijke valkuilen.
Er zijn vele beeldvormingstechnieken momenteel beschikbaar die overlappende toepassingen en kan het moeilijk in te schatten welke techniek is geschikt voor de taak bij de hand. Een relevant voorbeeld hier is het kiezen van een techniek voor de beeldvorming van het overzicht. De externe morfologie van het hoofd en ogen en relatieve positionering van het optische systeem op het hoofd kan worden gedaan met behulp van SEM of photomicrography. De sterke en zwakke punten van deze technieken zijn herziene27, er zijn echter enkele speciale overwegingen wanneer imaging ogen. Wanneer imaging de relatieve plaatsing en grootte van de ogen, hebben beide technieken hun voor- en nadelen. SEM beelden gebrek aan kleurinformatie en vandaar waar pigmentatie relevante is photomicrography is beter. Echter kunnen SEM afbeeldingen illustreren van fijne structuren zoals Inter ommatidial haren en facet grenzen in meer detail en zelfs oppervlaktekenmerken niet zichtbaar onder photomicrography technieken (bijvoorbeeld, ocellar lenzen, oppervlakte beeldhouwen van onthullen Compound eye lenzen). SEM is een veelzijdige techniek als het gaat om verkennend beeldvormings- en omlijning van belang, omdat het kan worden toegepast op een groot aantal specimen maten met behoud van zeer hoge resolutie in dit bereik. Echter, het is niet zo breed toegankelijk als een dissectie Microscoop en vereist een hoger niveau van deskundigheid. Er is vaak geen enkele manier van het verkrijgen van de informatie die men nodig heeft. In zulk een scenario is het nuttig om te overwegen wat er beschikbaar is en waar is het belangrijkste om te investeren.
Nagellak replica's van het hoornvlies hebben bewezen meest nuttig zijn bij het verkrijgen van de meest nauwkeurige meting van facet cijfers en facet diameters. Dit is nu gebruikt in een verscheidenheid van insecten11,22,28,29. Terwijl de kwaliteit van de beelden verkregen van een SEM superieur is, voorkomt de kromming van het oog dat nauwkeurige metingen van de hele facet-matrix. Mapping van de facet grootte en facet distributie moet ook haalbaar zijn uit scans van micro-berekend tomografie5verworven.
In zowel de TEM de LM technieken is het vaak moeilijk om te weten of het monster heeft opgesteld en goed tot de laatste fase van de beeldvorming verwerkt. Om complicaties te vermijden, is het belangrijk om goede praktijken zoals het onderhouden van ruimten en tools, voorbereiding van verse oplossingen regelmatig en grondig filteren water schoon te werken. Verontreinigingen die onzichtbaar voor het blote oog zijn kunnen ruïneren EM monsters. Om deze reden kan het nuttig zijn om te vegen oppervlakken en instrumenten met behulp van een oplosmiddel, zoals ethanol of aceton, en het wissen van een niet-lint produceren. Dit is het meest relevante wanneer afdelen, kleuring EM secties, en bij de voorbereiding van SEM monsters. Evenzo, gedestilleerd waterbronnen kunnen problemen opleveren en introduceren van verontreinigingen, zodat het is altijd het beste om te controleren van filters, veranderen ze regelmatig en gebruik altijd vers gefilterd water (niet opslaan). De meeste fixatives, vlekken en insluiten materialen kunnen niet worden opgeslagen voor onbepaalde tijd en het is belangrijk dat het etiket van alle oplossingen met de datum van opstelling. Het is belangrijk om een systematische aanpak en voldoende tijd gereserveerd voor het verrichten van protocollen zonder onderbrekingen.
Technieken om verschillende soorten aan te passen is altijd een kwestie van trial and error. Bij het werken binnen de Formicidae, liggen de belangrijkste verschillen in de grootte van het dier en de spiermassa in het hoofd. Mieren met meer spiermassa in hun hoofd zal meestal langer duren om te herstellen. Met zeer grote mieren is het beste te verwijderen van de mandibulaire spieren, de luchtpijp en de mandibulaire klieren, waarbij minimale interferentie met het zenuwweefsel. In kleine mieren en mensen met een paar mandibulaire spieren is het mogelijk om voldoende fixatie door gewoon verwijderen van de kaken en bloot de clypeal regio. In deze gevallen kunnen kleine gaatjes met kleinigheden pinnen ter verbetering van de fixatie op het hoofd worden gemaakt.
Het is belangrijk op te merken dat omgevingsfactoren ook preparaten kunnen beïnvloeden. Warme en vochtige omgevingen (met name veld stations in de tropen) kunnen blijken te zijn een uitdaging in de fase van de infiltratie. Warme omstandigheden kunnen harsen te polymeriseren gedeeltelijk voortijdig resulterend in de niet-gebruikte hars steeds steeds meer viskeuze leiden. In dit geval is de beste optie voor het opslaan van de hars in kleine, één gebruik, verpakkingen in de koelkast of diepvriezer. Koeling fixatives kunnen nuttig zijn om de teller sneller weefsel verval in warme omstandigheden. Echter, gekoelde oplossingen zal langzamer verspreiden wat betekent dat de behandeling tijden moeten worden uitgebreid om te zorgen voor een goede penetratie.
Met deze waarschuwing in het achterhoofd, kan onderzoek naar het optische systeem van mieren en andere insecten bewijzen zeer de moeite waard. Bestuderen van het visuele systeem stelt ons in staat om te schatten van de omvang van visual velden, interommatidial hoeken, optische gevoeligheid en bemonstering resoluties. Inzicht in de anatomie van het oog informeert ons begrip en onze interpretatie van dierlijk gedrag. Bijvoorbeeld, anatomie stelt ons in staat om voorspellingen te maken op de visuele mogelijkheden van dieren zoals of ze dagactieve of nachtelijke zijn, die mogelijk niet zijn eerder gedocumenteerd. Gezien de huidige kennis over het visuele systeem van handvol mieren, we hopen dat onze methoden zal inspireren biologen en myrmecologists om de compound eye en ocelli in mieren te onderzoeken om ons begrip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar Jochen Zeil, Paul Cooper en Birgit Greiner voor het delen van hun kennis in de anatomie van insecten en voor het aantonen van enkele van de technieken die wij hier hebben beschreven. We zijn dankbaar om het getalenteerde en ondersteunend personeel van het centrum voor geavanceerde microscopie op ANU en The microscopie Unit op MQU. Dit werk werd gesteund door een gediplomeerde beurs FRE en subsidies van de Australian Research Council (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
