Summary
この記事では、光と昆虫の内部および外部の目の解剖学を研究、電子顕微鏡の技術のスイートについて説明します。アリの目、詳細なトラブルシューティングと異なる標本や関心領域の最適化のための提案の仕事のために最適化されたいくつかの伝統的なテクニックが含まれます。
Abstract
この記事は光学顕微鏡 (LM) における技術のスイートについて説明と電子顕微鏡検査 (EM) 昆虫の内部および外部の目の解剖学を研究するために使用できます。アリの目に仕事用に最適化され、透過型電子顕微鏡 (TEM)、走査型電子顕微鏡 (SEM) など他の技術と連携して動作させる従来の組織学的技術が含まれます。これらの技術は、非常に役に立つ、困難な場合が初心者顕微鏡の重視は、トラブルシューティングと異なる標本の最適化に関するこの記事に配置されているので。全体の標本 (写真顕微鏡・ SEM) のイメージングに関する情報を提供し、それぞれの長所と短所を話し合います。我々 は全体の目のレンズの直径を決定する際に使用される技術を強調表示し、改善のための新しい手法を説明します。最後に、LM と TEM の試料を準備にかかわっている技術について述べる断面、染色、およびこれらのサンプル画像します。我々 はサンプルを準備するときに、彼らの周りを移動する最善の方法を来るかもしれない 1 つのハードルをについて説明します。
Introduction
ビジョンは、ほとんどの動物のための重要な感覚モダリティです。ビジョンは、正確に示す目標の確立し、ルートに従うこととコンパス情報1,2を取得ためのナビゲーションのコンテキストで特に重要です。昆虫は複眼のペアを使用して視覚情報を検出し、いくつかのケースで 1 ~ 3 背側に配置されたシンプルな目は単眼3,4,5と呼ばれます。
アリの目は、ので、種を渡っていくつかのキーの特性を保全するアリは驚くほど多様なのですが、特に興味深いのです。解剖学、サイズ、および生態系の劇的な変化にもかかわらず種の大半社会性、コロニーに住んでいます。結果として、異なる種中心的な場所とリソース間の前後移動の面で同様の視覚課題に直面します。体長、厳密に夜行性の種に専ら昼間および視覚捕食者6,7、跳躍する地下歩行が遅いから 0.5 〜 26 ミリメートルに至る動物の蟻の間で同じ基本的な目 bauplan を観察できます。 8,9,10。すべての生態および行動のこれらの驚異的な違いは本体サイズ11,12ライフ スタイル、さまざまな環境に合わせて同じ基本的な眼の構造の無数の順列に上昇を与えます。結果として、アリのビジュアルの生態を勉強断固とした探偵に可能性の宝庫を提供します。
昆虫の視覚系を理解することは、行動能力に洞察力を得ることに不可欠です。これは、素敵な生態と、いくつかの昆虫のグループ (例えば、参照13,14,15,16,で大成功を動作解剖学を組み合わせた統合的な研究から明らかです。17). ant ナビゲーションと蟻の行動のフィールドは、一般的にかなり成功している、しかし非常に少し重点を ant ビジョン、いくつか選択した種の外に配置されています。ここでは、私たちは、アリの目のデザインを調査する技術について詳しく説明します。我々 は、アリに集中しながらこれらの技術適用できます、他の昆虫のわずかな変更でも。
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Protocol
1. 試料の準備
注: それは複眼と単眼と頭の上の相対的な位置をまず理解する必要です。これは、頭の背面の画像を取得によって達成することができます。このため、処理サンプルただしまたは SEM のテクニックを使用してお勧めします。以下の手順は両方のプロセスに関与しているのです。
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検体採取
- 収集し、70% エタノールに直接標本を保存します。可能な限り別のカーストを収集します。
- 時間、日付、試験片をラベルし、(例えば、採餌しながら収集小枝等の内部ネスト集計を交配) 他の関連した観察だけでなく、
- それぞれの治療に複数の複製を持っている十分な標本を収集します。
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ただし、Z スタッキング
- 空気の乾燥標本と昆虫ピンの三角形のポイント カード、水溶性の接着剤を使用し、それらをマウントします。詳細については、参照18を参照してください。
- Z ステッピングモータとカラー カメラ高倍率顕微鏡を使用してイメージ。
- ディフューザーを使用して、試料の均一な照明。
- 異なる焦点面で画像をキャプチャし、可逆ファイルの形式 (tiff) などとフォーカス スタックで画像を保存市販のソフトウェアを使用しています。
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走査電子顕微鏡像
メモ: は、すべてのツールとほこりやその他の粒子をもつ試料の汚染を避けるためにエタノールと作業面を徹底的に清掃します。- エタノール標本を一晩脱水して空気ペトリ皿で乾かします。
- 鋭いかみそりの刃を使用して、体の残りの部分から頭を区切ります。
- 必要な表示角度を (例えば、上向き背側) で頭をマウントに導電性カーボン テープまたはタブを使用してアルミニウム スタブ。カーボン テープを千切り、頭部のカプセルをサポートする折る。
- スパッタ コーターを使用して金を 20 で 2 分間試験片の表面に適用する回転ステージと mA。時間と電流計測器によって調整する必要があります。
- 新鮮なカーボン テープまたはタブの新しいアルミニウム スタブに標本を転送します。
注: ノンコートの炭素は、黒の背景を提供するが、ゴールド コーティングを傷つけることができる標本を転送します。 - 試料オリエンテーションがまだ解剖顕微鏡を使用して正しいことを確認し、微細鉗子または同様のツールのペアを必要に応じて調整します。ゴールド コーティング; をスクラッチしないように注意します。可能な限り少しのハンドル。
- スタブと互いに相対的な標本の位置のノートを作って、SEM スタブ ホルダーに試料をロードします。
メモ: いくつかの SEMs はステージのカメラが装備されてが、多くは、それは高倍率で小型試験片を見つけるが困難にすることができます。 - 標本をイメージします。低加速電圧を充電とフィールドの適切な深さの小さい絞り値を避けるために使用します。
注: 設定が最高の技術者と協議の上で最適化されて使用されている特定の楽器に特化しました。
2. 定量化のファセット数と直径
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角膜のレプリカ
- アリ エタノール漬けまたは (ステップ 1.1.1) この目的のためのピンにマウントを使用します。
- 昆虫ピンまたは粘土で動物をマウントします。頭が比較的大きい場合は、体の残りの部分を削除できます。
- 速乾性無色透明マニキュアの小さなドロップをピックアップしてすぐに目にそれを広げた昆虫ピンや罰金のつまようじを使用します。目を傷つけるしていませんが、pin を確認します。マニキュアは、全体の目と周囲のヘッド カプセルのいくつかをカバーするべき。
注: マニキュアが目全体で比較的均一な厚みのあることが重要です。 - 室温を設定するマニキュアを残します。
- 一度それが完全に設定されて、目を囲むヘッド カプセルからフワリとレプリカに細い昆虫ピンを使用します。
- レプリカを持ち上げて、頭と目ではなくカバーするレプリカの一部を把握するきれいな鉗子の罰金ペアを使用します。
- 目の向きの認識を確保: 前部、後部、背側、腹側の領域。
- スライド ガラスにレプリカを配置します。慎重に目の周りの余分な材料を除去することによってレプリカをトリミングするのにには、かみそりの刃を使用します。針やピンセットのペアを使用して、レプリカが移動するを防ぐために。
- 目が非常に凸の場合は、3-4 '' レプリカを平らにするために端のまわり細かい部分的な放射状の切開をするかみそりの刃を使用します。目が比較的 'フラット' の場合、このような切開を行う必要はありません。
- 目のレプリカは、レプリカの向きは知られていることを確保するのに優しくカバー スリップを配置します。これは爪のポーランド語の角膜の印象をなくすことができますとは、圧力は適用されません。
- 4 つのコーナーにほとんどのマニキュアを使用して coverslip をシールします。マニキュアは、カバーガラス、スライド ガラスの間流れ場合、それはレプリカを損傷します。
- 化合物の顕微鏡スライドをイメージします。
注: 一部のファセットは、フォーカスでは、場合にのみ、これを示唆している目のレプリカは十分な平坦化されません。2.1.3 の手順から再度開始して破棄します。 - ImageJ/フィジーの各シャコ シャコの数とサイズを測定できるなど自由に利用できるプログラムにイメージをインポートします。
注: も、単眼のレプリカを準備するこのメソッドを使用できます。それは単一のレンズなので、1 つのレプリカすべての単眼を一緒に保つことをお勧めします。
3. 目の構造の解析
注: 眼の解剖学を研究、LM と TEM のほとんどの場合 2 つ補完技術の必要です。初期処理段階では、LM の TEM 同様の技術を必要とします。違いは、断面の段階以降から発生します。処理のサンプル取り扱い、責任を持って破棄する必要があります危険な化学物質の使用が必要です。個人用保護具を使用して、発煙のフードで、常に安全データ sheets(SDS) を読む、開始する前にリスク アセスメントを実施します。
- 郭清
- 冷却、気体 CO2の露出では、標本を anaesthetize します。
- CO2麻酔が非常に高速 (おおむね 1 分) 供試体の死でありますので露出オーバーを避けるために注意が必要があります。ドライアイス ペレット (固体 CO2) を使用している場合は、これは冷たい火傷を引き起こす可能性がある標本と直接接触を避けます。
- 冷たい麻酔は遅くなります。4 ° C で十分で、寒い気温はお勧めしません。種のための適切な冷却時間を確立します。雄牛アリなどの大規模なまたは冷たい抵抗力がある蟻があります > 小さい種が 1-2 分過剰冷却を必要がありますのみを完全に固定化目指して 10 分は試料を殺す (氷との直接接触を避けるため)。標本は好ましく小さな泡栓、プラスチック容器で開催し、電気冷蔵庫または冷凍庫ではなく、彼らが観測されたことができます冷蔵庫の配置する必要があります。
- 、シャーレに試験片を置き、解剖顕微鏡の下で見るのために調整します。迅速に作業は、麻酔を維持するために (秒以内に発生することこの) 切開したら、組織の変性を避けるために重要です。
- 鉗子でアンテナを取り外します。刺すような昆虫を扱う場合、刺されないように最初ガスターを切断することをお勧めします。
- 鋭いかみそりの刃; を使用して口の部分を削除します。鉗子は、試料を押しに使用可能性があります。前方の部分の目 (大標本) に近いこれとして脳を揺さぶるなし (小標本) 可能な限り目が網膜を引き裂くをカットします。
- ヘッド カプセルを開く準備をします。最初の切開が上向き、角度に供試体これどちらも行われます解剖顕微鏡標本 thumb と手前の指の間を押しながら鉗子やビジュアル コントロールの下で試料を保持している間。
- 頭の腹側の部分を削除するために頭を横切開を作る固定・浸透を改善するために大型の種の腹側の目の部分を削除可能性があります。頭は、この時点でにまだ体に付すべき。
- 複眼にちょうど後部冠状切開することによって、体から頭のカプセルを断ちます。
- 氷冷固定液に混合目と切り裂かれたヘッド カプセルの場所: リン酸バッファー (pH 7.2 7.5) で 2.5%, グルタルアルデヒドおよび 2% パラホルムアルデヒド。
注意: 定着剤は腐食性および毒性適切な保護具を着用し、発煙のフードで働きます。
注: するすぐに神経組織の変性を阻止することが重要です。解剖は以内に 2 分で終了する必要があります (効率的な郭清は、いくつかの練習を必要があります)。
注: 目は、明るいまたは暗い状況に適応する必要がある場合、数時間必要な光条件に動物を公開しまず。それぞれの光の条件で解剖を行います。解剖は、闇をシミュレートするために赤色灯の下で実施されます。
- 冷却、気体 CO2の露出では、標本を anaesthetize します。
- 試験片加工
- 2 h. 大規模な標本があります固定時間が長くなるために、標本を軌道シェーカーの動きと室温で定着剤で維持します。
- 定着剤を削除し、それを適切に破棄します。シェーカーに室温リン酸バッファー (3 回、5 分ずつ) の標本を洗ってください。
注: リン酸バッファーは、8 g 食塩 0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4、0.244 g KH2PO4 1 l 蒸留水 H2O (pH 7.2) の装備されています。 - リン酸バッファーを削除し、2% を追加オソ4.発煙のフードに 1-2 時間のシェーカーで、標本瓶を置きます。これは脂肪を修正し、また、TEM のコントラストを提供するポスト固定ステップです。
注: 試験片寸法; 予告オスミウム固定回親指の大まかなルールとしては、1 mm3あたり固定の 1 h を計算します。 - オスミウムのソリューションを削除し、それを適切に破棄します。シェーカーに室温バッファー (3 回、5 分ずつ) の標本を洗ってください。
- エタノールまたはアセトンの濃度の増加でそれらを配置することによって試料を脱水します。たとえば、50、70、80、10 分 95% と最終的に 100% (2 回、15 分ずつ)。ソリューションの変更間のシェーカーに試料を置きます。
注: 場合は、必要に応じて標本格納できます 70% エタノールで一晩。 - エタノールをドレインし、100% アセトンを追加します。シェーカー (この手順場合はアセトンの脱水をスキップ) 20 分間それを残します。新鮮なアセトンに置き換えるし、さらに 20 分間それを残します。
- 樹脂樹脂にアセトンの次の比率を使用して組織に潜入: 純粋なガレージ (夜間) (4 h) を 1:2、1:1 (一晩) 2:1 (3 h)。各ステップでヒューム フード内側シェーカーで標本を残して、最後の 2 つの手順がすべての容器のふた。
注: 樹脂、各ステップで新しい使い捨て容器に試験片を移動しなければならないので排水するも粘性です。 - サンプルをマウントするブロックを準備します。ブロックは、小さな長方形のブロック (1.5 x 0.5 x 0.3 cm) にカット アクリル ガラス製カスタムすることができます。ブロックはシリコン型に注いでエポキシ樹脂 (があります多くの市販キット) によっても行うことし、60 ° C で 12-14 時間オーブンでそれを治す
注意: 未硬化樹脂 (液) が発癌性、完全に固まるまでオーブンに返される必要があります。 - 金型でブロックを垂直方向に配置します。慎重に液状の樹脂からの検体採取、ドレイン、余分なレジンを許可、ブロックの上に試料を置き。少量追加樹脂のブロックに試料をバインドする使用できます。
- ブロックにラベルを付けます。紙ラベルを印刷してブロックに埋め込むまたはブロック面に添付します。
- 60 ° C で 12-14 時間のオーブンで埋め込まれたブロックで金型を維持します。
- きれいな封筒で試料ブロックを格納します。これは、年に数ヶ月間この方法で格納できます。
- 完全に蒸発するアセトンを許可する発煙のフード コンテナー、汚れた手袋、その他の汚染された機器を残す (最低 12 h)。
- 使い捨て機器を破棄または鉗子など他の項目から樹脂をこする前にオーブンで硬化樹脂です。
- 断面
- 試料オリエンテーションが断面平面のために適切であることを確認する解剖顕微鏡の下でブロックを確認します。
- 向きが適切でない場合は、試料を切り取って再標本を座席にセット樹脂と新鮮な樹脂の断片を使用して向きを変更する宝石商の鋸を使用します。頭は、別々 に 2 つ目のセクションに 2 つの半分に分割される可能性があります。先に進む前にもう一度樹脂を治します。
- 取り外し可能なミクロトーム チャックのブロックをマウントします。チャックを取り外し、ホルダーに入れます。
- 解剖顕微鏡の下でかみそりの刃を使用して樹脂ブロックをトリムします。
注意: これを実行しない腕を衝撃し、ベアリングを損傷するとチャックがミクロトームの腕にマウントされます。 - ミクロトームの腕をチャックを再マウントし、供試体の角度。
- 適切な角度でホルダーにナイフをマウント (ガラスのナイフ、0 ° ダイヤモンド ナイフの製造元の指示を参照してください)。
注: ガラス ナイフ ガラスのナイフ メーカーに安く作ることができるが、彼ら失う彼らのエッジとして定期的に交換する必要があります。高品質ダイヤモンド ナイフ購入ことができますが、高価な特別なケアを必要とする、初心者には適していません。 - フィルター (0.45 μ m 孔サイズ) 搭載シリンジを使用して蒸留水でナイフ ボートを満たしなさい。
- 水のレベル、ナイフのエッジに達するまで、ボートを埋める半月板は、ボートの他の領域で凸で可能性があります。
- 半月板は非常にわずかに凹面が、まだナイフの端に達するまで、ボートをドレインします。任意の時点では、常にナイフの端から離して、水のレベルを調整できます。
- 慎重に試料に向かってナイフを持って、ナイフ ブロックを合わせます。ゆっくりと、定期的にナイフ覗きから、側からの近さをチェックこれは最高です。
メモ: は、楽器の異なる具体的な指示器ハンドブックを確認します。 - ミクロトームの切片厚を設定します。試験片の大きさ、関心領域、使用されているナイフの種類に依存する適切な厚さを選択します。
- 場合は、ガラスのナイフを使用して関心のある領域に到達する前に多くの材料を切り取る場合 (例えば、4 μ m) より高い設定を選択します。ダイヤモンド ナイフを使用している場合、または標本が非常に小さい場合は、1-2 μ m がより適切かもしれないです。
- ナイフは近いが、まだアプローチの最後の部分を実行する試験片に切断 (クランキング ミクロトーム ホイール)「切り絵」を開始。セクションは、いくつかの回転に現れる始めるべきであります。そうでない場合は、停止し、非常に慎重にナイフを持って少し近い。
- ときの厚み (半薄いセクションの 1 μ m) を収集セクションを調整する関心の領域に近づいています。
- まつげツールを使用して、セクションを収集します。
注: マニキュアと細い上にマウントされているまつげとまつげツールが可能です。 - 材料の多くを削除する必要がある場合に、蓄積し、ナイフを取り外し、水を吐き出す一斉削除セクションを許可します。ガラスのナイフを使用して、これはナイフ部が新鮮な新しいナイフを変更する適切な時期にあります。
- 場所蒸留水パスツール ピペットまたは理想的には、フィルターを使用してスライド上の小さな液滴のシリーズは、注射器を備えています。
- 収集した水滴にまつげについて慎重に浮く
- 断面の深さを確認するまでは、このようなセクションを収集します。
注: 退屈することが、頻繁にチェックするが最善です常に。 - 60 ° C に設定ホット プレートにスライドを配置します。すべての水を蒸発とスライドに準拠するセクションを許可します。
- トルイジンのセクションを 10-60 s の青染料 (セクション厚さと異なる時間を染色)。注射器 (上) としてフィルター搭載で染料を済ます。
- スライドの 1 つの端に染料のドロップを配置し、セクションをこするに触れたりせず、針の側面を使用してそれを広めます。約 10-20 代のホット プレートにスライドを配置します。
- 洗浄ボトルに蒸留水を噴霧してスライドをすすぎ、それを乾燥するホット プレートの上に置きます。
- 化合物顕微鏡下で確認し、それらをイメージします。
- 目的の領域に到達するまでを繰り返します。
- 超薄切片の: TEM セクションを収集するために 40-60 nm の間切断厚を設定します。
- カットについて 3-5 セクションと干渉のカラーチャートを使用してチェック厚さ。セクションは、角度で見るとライトグレーを反映すべき。
注: クロロホルムのガスは、すべての折り目をリラックスのセクションの上戻ことができます。これは、経験豊富なユーザーに最も関連性の高い、初心者は心配ないです。あまりのクロロホルムのセクションを余りに近くリリースはセクションに損傷を与えます。 - ホルムバール側と鉗子で持ちこたえてホルムバールめっき、銅、スロット グリッドを拾います。ホルムバール コーティングを穿刺しないように注意します。
- ボートをはさむこともろくにグリッドをディップし、セクションからセクションの下で、表面と平行にグリッドをもたらします。必要に応じて、グリッドの上のセクションをガイドするのにまつげを使用します。
- 腕の間に閉じ込められた水を浸すろ紙を鉗子の先端の周り慎重に塗りつけます。これを行わないと、水分張力は腕の間にグリッドを引き上げてしたり、1 つの側面に固執することができます。汚染や機械的損傷のおそれがあります。
- 立ってろ紙に割り込むグリッド グリッド自体から余分な水を慎重に取り外します。
- グリッド ホルダーにグリッドを配置します。
- 収集された十分なセクションまでを繰り返します。
- 厚切切片カメラを搭載した任意の化合物顕微鏡で直接イメージを作成することができます。イマージョン オイルは、セクションの上に直接配置できます。スライドは、変色を防ぐためにスライドのボックスに格納する必要があります。
- TEM コントラストの超薄切片を染色
注: 次の手順行われるべきカバーの下で染料が光と CO2敏感です。さらに、EM 染料は、重金属を使用してコントラストを生成して、有害物質であるため。これらの汚れを処理するときに、適切な注意が必要です。- 光を遮断するアルミ箔でいくつかの大規模なペトリ皿をカバーします。次の手順のためにこれらの下で働きます。部分的に作業スペースを許可するが、背面カバーをできるだけ早く配置するそれらの覆いを取る。
- ワックス膜の部分をカットし、慎重にパスツール ピペットを使用してそれを 6% 飽和 005. 5 滴を配置します。
- ソリューションを準備するには、蒸留水で 100 mL 50% メタノールと酢酸ウラン 2 g を混ぜるし、ソリューションを使用する前にフィルター処理します。ソリューションは格納できないため、各時間19新鮮行わする必要があります。
- 慎重にセクション側を下と色素液滴の上にバランスと鉗子 TEM グリッドを拾います。25 分放置。
- 急速に蒸留水; の内外でそれらを浸すことによってグリッドを個別に洗浄します。蒸留水の 4 つの異なるバイアルを進めます。
- 映画の新鮮な作品に鉛クエン酸 5 滴を配置します。色素液滴の周りいくつかの NaOH のペレットを手配 (これは炭酸鉛の沈殿物を防ぐために大気中の CO2を吸収する)。
- 鉛の混合水溶液をするためには、0.5 h. 許可冷却して密閉式コンテナーに bi 蒸留水 100 mL に 0.3 g 鉛クエン酸を追加水の蒸留水を沸騰によって bi 蒸留水を準備します。1 mL 10 M 追加 NaOH、容器を密栓し、溶存19まで振る。
- 4.3 とカバーに記載した色素低下でグリッドを配置します。5 分間染色します。
- 20 回蒸留水の内外でグリッドを浸すことによって蒸留水ですすいでください。蒸留水の 3 隻を進めます。
- フィルター ペーパーで余分な水分を吸収でき、グリッド グリッド ボックス内を乾燥させる。
- 低加速電圧での電子顕微鏡のイメージ。
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Representative Results
ここで説明する方法では、単純なものの詳細な研究とアリの複眼を有効にします。Z ただし技術を使用して頭の背表示画像の視覚システム (図 1) レイアウトの概要を取得することができます。これは良い準備解剖、必要な断面の角度を決定します。この手法、また頭の幅、目の長さ、単眼レンズの直径などの測定に役立ちます。SEM イメージングはまた詳細な概要イメージを与えるが、さらに高倍率・高解像度画像の取得ができます。目に関心の特定の領域の詳細に調べることができ、レンズ形状の変化をすることができます (図 2) を確認します。SEM 画像は、小さな目と単眼アリを解決するため便利です。角膜のレプリカは、図形、サイズ、およびそれぞれの目 (図 3) でレンズの数に関する情報を提供します。LM のテクニックを使ってイメージ化半薄いセクション (図 4および図 5) 目の総内部解剖学の調査を許可します。これは、結晶の円錐形の直径、結晶円錐管、形状、幅、および背側縁領域、およびプライマリとセカンダリの色素細胞の場所のマッピング、rhabdom の長さの存在、レンズの厚さが含まれています。この手法は素敵な超薄切片も方向 (図 4) 特に、微細構造を決定することができます TEM を使用してイメージを作成によって補完することができ、(例えば幅の小さい構造の定量化、収縮した結晶性円錐管は図 5)。
オーストラリアの砂糖アリ、クロオオアリの consobrinusの 3 つのカーストの図 1: z 顕微鏡写真。これはすべての 3 つのカーストの視覚システムのレイアウトの概要を説明します。参照20から適応。スケール バー = 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: この手法のイメージング機能を示す ant 視覚系の電子顕微鏡写真をスキャンします。別の目の位置と目のサイズに一番上の行を示しています: (A)キバハリアリ nigriceps;(B) Opisthopsis pictus;そして (C)ノコギリハリアリ南天(非常に小さい目、白い矢印に注意)。高倍率表示で画像:キバハリアリ nigriceps;別の労働者の 3 つ (D) 単純な目サイズ (E) Rhytidoponera メタリカ(注別にシャコを形の複眼黄色で複眼の異なる地域)、ノコギリハリアリ南天(F)、(G)キバハリアリ生化学(H) Orectognathus 学、および (私) Pheidole種。スケール バー = 1 mm (A ~ C)、100 μ m (D ・ H), (I) 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ant の目と単眼の角膜レプリカ。キバハリアリ nigricepsの労働者の複眼の (A) のレプリカ。凸のレプリカは、切開することによって平坦化されました。 挿入図は、後方 (p)、前方 () と背側の (d)、腹 (v) 軸を示します。キバハリアリ tarsataの労働者の単眼の (B) のレプリカ。スケール バー = 0.5 mm (A)、(B) 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: LM と EM rhabdom 断面の画像。キバハリアリ nigricepsトルイジンの青いステンド グラスの遠位 rhabdoms (A) 断面が円形または長方形である rhabdoms を区別するために使用できます。透過電子顕微鏡写真ショー: 長方形の形をした rhabdom の 2 つの反対の方向で (B) の円形 rhabdom の微絨毛と微絨毛 (C) 複数の向き指向します。(D) 使用光顕、長方形の rhabdoms の長い軸がクロオオアリ consobrinus; の女王の目の背側の地域のファンのような組織を示すマップインセットは、後方 (p)、前方 (a)、横方向 (l) (m) の内側軸を示します。パネル D 参照20から適応。スケール バー = 10 μ m (A)、1 μ m (B ・ C)、(D) 100 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:キバハリアリ tarsataの光順応眼の ommatidium の LM と EM の画像。角膜 (C)、結晶コーン (CC)、円錐管 (ct)、rhabdom (Rh) およびプライマリを示す、ommatidium の (A) 縦断面図色素細胞 (PPC)。(B) 点線の長方形はパネル幅の狭円錐管を定量化する TEM 表示別のセクションからのボックスです。参照21から適応。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 半薄いと超薄いセクション (固定・浸透、切断および汚損) の一般的な問題です。(A) 貧しい固定Pheidole種の半薄いセクションで不十分な浸透 (矢印) のための組織・ ドライ アンドラ calvus (半薄い) の中に (B) をリッピング(C) (左) 染色を完璧し、トルイジン (右) 染色で青のキバハリアリ croslandi;(D) 顔料 (円) と樹脂や組織の密度 (あまりにも柔らかい樹脂) のマッチングが悪いため (矢印) を断面中にリッピング組織。ナイフのボートからのセクションを収集する場合に発生することが (アスタリスク) セクションの折りたたみ(E) 貧しいコントラスト不足染色 (嵌め込む式に比較) のため、CO2、および垂直ナイフへの暴露から鉛クエン酸結晶 (白い矢印) マーク (黒矢印)。(F) 穴Melophorus hirsutus複眼; 貧しい固定によって引き起こされる組織 (白い矢印)(G) 樹脂が柔らかすぎるときに断面をグースにつながる; セクションの垂直方向の波紋と見られて(H) 断面厚すぎる (~ 100 nm)、コントラストが低いと暗いイメージで起因したバクテリアと粒子状物質に汚染された蒸留水鉛散在セクション (白い矢印) Pheidole種。スケール バー = (A B) 25 μ m、10 μ m (C H)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
上記の方法のスイート アリなどの昆虫の光学系に効果的な調査を可能にします。これらのテクニックは、サンプリングの解像度、光感度で、検討されている目の潜在的な偏波依存性の私達の理解をお知らせ。この知識は、視覚能力に生理・行動の調査のための重要な基礎を提供します。さらに、ここでの方法は、ant の視覚系に焦点を当てている、これらのテクニック使用できます他の昆虫 (例えば固定と厚い組織内浸潤の期間を増やす) プロトコルに若干の修正はあるものの、.わずかに変更されたプロトコルは、昆虫のセミ22、ハエ14、蜂23、ハチ24、蝶25、蛾26などの様々 な視覚系の特性評価に使用されています。技術のほとんどが記載されているここでしばらくの間使用されているが、この記事は、ant の光学系を勉強してのコンテキストにまとめること、代替技術を比較し、共通の落とし穴を説明する機会を取る。
多くイメージングの技術現在利用可能なアプリケーションを重複していると、それは手で、タスクの適切なテクニックを評価することは困難することができます。ここで関連する例は概要イメージングの手法を選択します。頭と目の外部形態と光学系、頭の上の相対位置決めを行うことができます SEM またはただしを使用します。長所とこれらの技術の弱点は27レビューをされている、目をイメージングするとき、そして、ただし、いくつかの特別な考慮事項があります。相対位置と目の大きさをイメージングするとき、その長所と短所両方の技術があります。SEM 画像はカラー情報を欠いているし、それ故に色素沈着が関連するただしは優れています。ただし、しかし、SEM 画像を間個毛などより詳細にファセット境界微細構造を説明でき、テクニック (例えば、単眼レンズ、彫刻の表面の下で目に見えない表面の特徴を明らかにするも複眼レンズ)。SEM では、探索的イメージングとそれはまだこの範囲全体で非常に高い解像度を維持しながら供試体サイズの大きな範囲を操作できるため、興味の機能を識別するのになる汎用性の高いテクニックです。しかし、それは解剖顕微鏡として、広くアクセス可能ではない、専門知識の高いレベルが必要です。多くの場合、1 つに必要な情報を得る唯一の方法はありません。このようなシナリオでは、利用可能なものと最も重要な資源を投入し、考慮することをお勧めします。
角膜のマニキュア レプリカ番号ファセットとファセットの直径の最も正確な測定を得ることに最も有用であると証明しました。これは、さまざまな昆虫11,22,28,29で今使用されています。SEM から得られる画像の品質ははるかに優れたが、目の曲率は全体のファセット配列の正確な測定を防ぎます。ファセットのサイズおよびファセットの分布のマッピングもマイクロ コンピューター断層撮影5から取得したスキャンから実現可能なはずです。
LM と TEM の両方の技術のそれは頻繁サンプルを準備されており、画像の最終段階までうまく処理するかどうかを知ることは困難です。合併症を避けるためには、きれいな作業スペースとツール、定期的に新鮮なソリューションの準備および徹底的にフィルタ リングの水の管理など良いプラクティスを確立することが重要です。肉眼に目に見えない汚染物質 EM サンプルを台無しにすることができます。このため、表面と非 lint 生産ワイプやアセトン、エタノールなどの溶剤を使用して楽器を拭くことができます。断面、EM セクションを汚すと SEM 試料を準備する最も関連性の高いです。同様に、蒸溜された水の源を問題を提示でき、それは常に最高のフィルターをチェック、変更を定期的に、常に新鮮なろ過された水を使用するので、汚染物質を紹介 (保存されません)。ほとんどの定着剤、汚れ、および埋め込み材料は無期限に格納できないため、日付の準備とすべてのソリューションにラベルを付けることが重要です。中断することがなくプロトコルを実行する十分な時間を脇に体系的なアプローチを取ることが重要です。
異なった技術の適応は常に試行錯誤の問題であります。守内での作業、主な違いは動物や頭の筋肉のサイズであります。自分の頭でより多くの筋肉とアリが修正に時間がかかります。非常に大規模なアリと神経組織の最小干渉を確保しながら顎の筋肉、気管、および下顎腺を削除することをお勧めします。いくつかの顎の筋肉に小さなアリで、下顎骨を取り外して clypeal 地域を公開するだけで十分な固定を実現することが可能です。これらの場合、些細なピンを使用して小さな穴、固定を改善するために頭でできます。
環境条件もまた準備に影響を与えることができますに注意してくださいすることが重要です。高温多湿の環境 (特に熱帯地方でフィールド ・ ステーション) は、浸潤の段階で挑戦をあると証明できます。暖かい条件はますますより粘性になって未使用樹脂で、その結果途中で部分的に重合する樹脂につながることができます。この場合、最良の選択肢は、冷蔵庫や冷凍庫で容器の小さな、単一の使用で樹脂を貯えるためです。定着剤を冷却カウンター高速組織崩壊が暖かい条件の参考にすることができます。ただし、冷却ソリューションの適切な溶込みを確保するため治療時間を拡張する必要があることを意味するともっとゆっくりに分散されます。
念頭に置いてこれらの注意を要する、アリなどの昆虫の光学系の捜査は非常にやりがいのある証明できます。視覚系を勉強して視野、interommatidial 角度、光感度、サンプリングの解像度のサイズを見積もることができます。目の解剖学を理解する私たちの理解と動物の行動の解釈を通知します。例えば、解剖学は、昼行性か夜行性かどうかなど動物の視覚機能を予測する私たちをことがでくことがあります記載されていない以前。アリの一握りのビジュアル システムに関する現在の知識を与え、私たちの方法は、理解を深める複眼と単眼アリを調査する生物学者と myrmecologists を刺激すると思います。
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Disclosures
著者は競争の興味を宣言しません。
Acknowledgments
昆虫の解剖学の知識を共有するためヨッヘン ・ ツァイル、ポール ・ クーパーとビルギット グライナーに感謝しております、テクニックのいくつかを示すため、我々 はここで記述しました。オーストラリア国立大学で高度な顕微鏡と顕微鏡ユニット MQU でセンターで支持と有能なスタッフに感謝しております。この作品は、オーストラリアの研究評議会 (DE120100019、FT140100221、DP150101172) から周波数と補助金に大学院奨学金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
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