Summary
Denne artikkelen beskriver en rekke teknikker i lys og elektronmikroskop å studere den interne og eksterne øye Anatomien av insekter. Disse inkluderer flere tradisjonelle teknikker optimalisert for maur øyne, detaljert feilsøking, og forslag til optimalisering for forskjellige prøver og områder av interesse.
Abstract
Denne artikkelen beskriver en rekke teknikker i * lys (LM) og elektronmikroskop (EM) som kan brukes til å studere den interne og eksterne øye Anatomien av insekter. Disse inkluderer tradisjonelle histologiske teknikker optimalisert for arbeid med maur øyne og tilpasset for å jobbe sammen med andre teknikker som overføring elektronmikroskop (TEM) og skanning elektronmikroskop (SEM). Disse teknikkene, kan men svært nyttig, være vanskelig for nybegynneren-microscopist så stor vekt er plassert i denne artikkelen og optimalisering for forskjellige prøver. Vi gir informasjon om Bildeteknikker for hele prøven (Foto-mikroskopi og SEM) og diskutere sine fordeler og ulemper. Vi markere teknikken brukes å bestemme lens diameter for hele øyet og diskutere nye teknikker for forbedring. Til slutt, vi diskutere teknikker involvert i forbereder prøver LM og TEM, skjæring, flekker og imaging prøvene. Vi diskutere hurdles som man kan komme over når forbereder prøver og hvordan best å navigere rundt dem.
Introduction
Visjon er en viktig sensoriske modaliteten for de fleste dyr. Visjon er spesielt viktig i sammenheng med navigasjon for pinpointing mål, etablere følge ruter og skaffe kompass informasjon1,2. Insekter oppdage visuell informasjon med en øyne og, i noen tilfeller en til tre ytterst plasserte enkle øyne kalles ocelli3,4,5.
Øynene av maur er av spesiell interesse fordi, mens maur er fantastisk mangfoldig, de spare noen viktige egenskaper over arter. Til tross for dramatiske variasjon i anatomi, størrelse og økologi, det store flertallet av arter eusocial og bor i koloniene; som et resultat, møte ulike arter liknende visuelle utfordringer i form av navigere frem og tilbake mellom sentralt og ressurser. Over maur kan den samme grunnleggende øye bauplan observeres i dyr fra 0,5-26 mm i kroppens lengde, fra utelukkende dagaktive strengt nattlige arter og fra langsom gange underjordiske hoppe visuelle rovdyr6,7, 8,9,10. Alle disse svimlende forskjellene i økologi og atferd gir opphav til utallige permutasjoner av samme grunnleggende øye strukturer for ulike miljøer, livsstil og kropp-størrelser11,12. Som en konsekvens, gir studere visuelle økologi av maur en veritabel skattekiste av mulighetene til bestemt etterforskeren.
Forstå det visuelle systemet av insekter er avgjørende i å få et innblikk i deres opptreden evner. Dette er tydelig fra integrerende studier som pent kombinerer anatomi med økologi og atferd til en stor suksess i noen insekt-grupper (f.eksreferanser13,14,15,16, 17). om maur navigasjon og maur atferd generelt har vært ganske vellykket, svært liten vekt er lagt på maur visjon utenfor noen utvalgte arter. Her vil vi utdype teknikkene involvert i gransker øye design av maur. Mens vi vil fokusere på maur, kan disse teknikkene brukes med små endringer, andre insekter, også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. prøven forberedelse
Merk: Det er nødvendig å først forstå den relative plasseringen av det sammensatte øyet og ocelli til hverandre og på hodet. Dette kan oppnås ved å kjøpe bilder av dorsal visningen av hodet. For dette anbefaler vi behandling prøver for photomicrography eller bruke SEM teknikker. Nedenfor er fremgangsmåten involvert i begge prosessene.
-
Prøvetaking
- Samle og lagre prøver direkte til 70% etanol. Samle ulike kastene mulig.
- Etiketten prøver med tid, dato og sted og eventuelle andre relevante observasjoner (f.ekssamlet mens beite, mating aggregering, neste inne en kvist, etc.)
- Samle nok prøver å ha flere replikeres i hver behandling.
-
Photomicrography og Z-stabling
- Luften tørr prøver og montere dem på trekantet kortene, ved hjelp av vannløselige lim, og deretter på et insekt pin. For detaljer, se referanse18.
- Bildet med en høyere stereomicroscope med en Z-stepper motor og en fargekamera.
- Bruke en diffuser for å få jevn belysning for prøver.
- Ta bilder på forskjellige fokal fly og lagre bilder i en tapsfri filformat (for eksempel tiff) og fokus stabel av kommersielt tilgjengelig programvare.
-
Scanning elektron micrographs
Merk: Rengjør alle verktøy og arbeider overflater med etanol å unngå forurensning av prøven med støv og andre partikler.- Tørke eksemplarer i etanol over natten og lufttørke i en Petriskål.
- Bruk en skarp razor blad for å skille hodet fra resten av kroppen.
- Montere hodet på nødvendige visningsvinkelen (f.eksdorsal vender) på aluminium stubber ledende karbon bånd eller kategorier. Klippe karbon båndet i tynne strimler og brett den å støtte hodet kapselen.
- Bruk en frese coater for å bruke gull på overflaten av prøven i 2 min 20 mA med en roterende scene. Tid og gjeldende må justeres avhengig av instrumentet.
- Overføre prøver til aluminium stokken med fersk karbon bånd eller kategorier.
Merk: Ubestrøket karbon gir en svart bakgrunn, men overføre prøver kan skade gull belegg. - Kontroller at Prøveretningen er fremdeles riktig bruker dissecting mikroskop og justere etter behov med et par fine tang eller lignende verktøy. Ta vare ikke å lage riper i gull belegg; håndtak som mulig.
- Last prøver på SEM stub innehaveren, gjør oppmerksom på plasseringen av andre og prøver i forhold til hverandre.
Merk: Noen SEM er utstyrt med en scene kamera, men mange er ikke og det kan være vanskelig å finne små prøver på forstørring. - Bilde av prøvene. Bruke en akselererende avgrensende for å unngå lading og liten blenderåpning for god dybdeskarphet.
Merk: Innstillingene er best optimalisert i samråd med en tekniker i spesielle instrument som brukes.
2. kvantifisering fasett tall og diameter
-
Hornhinnen replikaer
- Bruk maur bevart i etanol eller montert på en PIN-kode for dette formålet (trinn 1.1.1).
- Montere dyret på et insekt pin eller plasticine. Hvis hodet er relativt stort, kan gjenværende kroppsdeler fjernes.
- Bruk et insekt pin eller en fin tannpirker å plukke opp en liten dråpe hurtigtørkende fargeløs neglelakk og raskt spre den over øyet. Kontroller pin ikke ripe øyet. På neglelakk bør dekke hele øyet og noen av omkringliggende hodet kapselen.
Merk: Det er viktig at på neglelakk være relativt ensartet tykkelse over øyet. - La neglelakk angi ved romtemperatur.
- Når det er fullstendig satt, bruke en fin insekt pin til løft kopi fra hodet kapselen rundt øyet.
- Bruk et fint par ren tang til å løfte replikaen, tak delen i replikaen som dekker hodet og ikke øyet.
- Sikre bevissthet om retningen for øyet: fremre, bakre, rygg og ventrale regionen.
- Plass replikasettet på et glass lysbilde. Bruk et barberblad trimme replikaen ved nøye fjerne materiale rundt øyet. Bruk en nål eller et par pinsett for å hindre replikaen flyttes.
- Hvis øyet er svært konvekse, kan du bruke et barberblad for å gjøre 3-4 fine delvis radial snitt rundt kanten å "flat" kopi. Hvis øyet er relativt "flat", er det ikke nødvendig å gjøre slike snitt.
- Plass en cover slip mildt på øyet replikaen, sikre at retningen i replikasettet er kjent. Gjelde ikke press som dette kan eliminere hornhinnen inntrykk på på neglelakk.
- Forsegle dekkglassvæske bruker lite neglelakk i fire hjørner. Hvis på neglelakk flyter mellom cover slip og glass lysbilder, vil det skade replikaen.
- Bilde lysbildet på en satt mikroskop.
Merk: Hvis bare noen fasetter er i fokus, så dette tyder øyet replikaen ikke slås nok. Forkaste og starte på nytt fra trinn 2.1.3. - Importere bildet til fritt tilgjengelige programmer som ImageJ/Fiji der antall ommatidia og størrelsen på hver ommatidia kan måles.
Merk: Denne metoden kan brukes til å klargjøre kopier av ocelli, også. Siden det er en enkelt linse, anbefaler vi å holde alle ocelli sammen i én replika.
3. analyse av strukturen i øyet
Merk: For å studere anatomi av øyet krever i de fleste tilfeller to utfyllende teknikker LM og TEM. Den innledende behandling stadier krever lignende teknikker for både LM og TEM. Forskjellen oppstår snitting scenen og utover. Prosessering prøver krever bruk av farlige kjemikalier som må håndteres med forsiktighet og forkastet ansvarlig. Bruk personlig verneutstyr, innarbeide avtrekksvifte, alltid lese sikkerhet data sheets(SDS), og gjennomføre risikovurderinger før du starter.
- Disseksjon
- Anaesthetize eksemplarer av kjøling eller eksponering for gass CO2.
- CO2 anestesi er veldig rask (vanligvis under 1 min) og bekymre burde være tatt å unngå overeksponering som dette kan resultere i døden av prøven. Hvis bruker tørris pellets (solid CO2) unngå direkte kontakt med prøver som dette kan forårsake kaldt brannskader.
- Kalde anestesi er tregere; 4 ° C er tilstrekkelig kaldere temperaturer er ikke anbefalt. Opprette en passende kjøling tid for arten. Store eller kalde motstandsdyktig maur som bull maur kan kreve > 10 min å bli fullt immobilisert, mens mindre arter må bare 1-2 min. overdreven kjøling vil drepe prøven (unngå direkte kontakt med is). Prøver bør helst være holdt i små, skum-korket, plast beholdere og plassert i en Isskap der de kan observeres i stedet for i en elektrisk kjøleskap eller fryser.
- Plasser prøven på en Petriskål, og for visning under dissecting mikroskop. Arbeider raskt er viktig å bevare anestesi og unngå degenerasjon av vev når Snittene lages (dette kan skje innenfor sekunder).
- Fjerne antenner med tang. Hvis arbeider med en stikkende insekter, er det tilrådelig å amputere og første å unngå å bli stukket.
- Fjerne munnen delene med en skarp barberblad; Tang kan brukes til å holde prøven. Skjære gjennom den fremre delen av øyet (store prakteksemplarer) eller så nær øynene som mulig (liten prøveeksemplarer) uten å slite på hjernen som dette kan rive ut netthinnen.
- Forberede å åpne hodet kapselen. Vinkel prøven slik at den første snittet peker Dette kan gjøres enten under dissecting mikroskopet mens du holder prøven i tang eller visuell kontroll mens du holder prøven mellom tommelen og forgrunnen fingeren.
- Gjøre en tverrgående snitt gjennom hodet fjerne ventrale delen av hodet; del av det ventrale øye kan fjernes i stor arter å forbedre fiksering og infiltrasjon. Hodet skal fortsatt være festet til kroppen på dette punktet.
- Bryte hodet kapselen fra kroppen ved å gjøre en koronale snitt bare bakenfor sammensatte øyet.
- Plasser dissekert hodet kapsel med den sammensatte øynene i isen kalde bindemiddel: 2,5% glutaraldehyde og 2% paraformaldehyde fosfat buffer (pH 7.2 7.5).
Forsiktig: Bindemiddel er korrosiv og giftig; Bruk passende beskyttelse og innarbeide avtrekksvifte.
Merk: Det er viktig å arbeide raskt for å arrestere nevrale vev degenerasjon. Dissection skal være fullført i 2 minutter eller mindre (effektiv disseksjon krever litt øvelse).
Merk: Hvis øyet må tilpasses lyse eller mørke forhold, så først utsette dyr til den nødvendige lysforhold i noen timer. Utføre disseksjoner i de respektive lysforholdene. Disseksjoner kan utføres under røde lysene å simulere mørke.
- Anaesthetize eksemplarer av kjøling eller eksponering for gass CO2.
- Prøven behandling
- Holde prakteksemplarer i bindemiddel ved romtemperatur med bevegelse på en orbital shaker, for 2 h. store prakteksemplarer krever lengre fiksering ganger.
- Fjerne bindemiddel og kast den riktig. Vask eksemplarer i romtemperatur fosfatbuffer (3 ganger, 5 min hver) på shaker.
Merk: Fosfat bufferen består av 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4og 0.244 g KH2PO4 i 1 L destillert H2O (pH 7.2). - Fjerne fosfat bufferen og legge til 2% OsO4. Plass prøven glasset på shaker i avtrekksvifte for 1-2 h. Dette er en post fiksering skritt å fikse fett og også gi kontrast for TEM.
Merk: Osmium fiksering ganger kan prøven størrelse; som en grov tommelfingerregel, beregne 1t av fiksering per 1 mm3. - Fjerne osmium løsningen og kast det riktig. Vask eksemplarer i romtemperatur buffer (3 ganger, 5 min hver) på shaker.
- Mister prøver å plassere dem i økende konsentrasjoner av etanol eller aceton; for eksempel 50, 70, 80, og 95% for 10 min og til slutt 100% (2 ganger, 15 min hver). Plass de på shaker mellom løsning endringer.
Merk: Om nødvendig, prøver kan lagres i 70% etanol over natten. - Avløp etanol og legge til 100% aceton. La den etter 20 min på shaker (hopp over dette trinnet hvis dehydrating det i aceton). Erstatte med fersk aceton og la den for en ekstra 20 minutter.
- Infiltrere vev med harpiks bruker følgende prosenter av aceton for å harpiks: 2:1 (3 h), 1:1 (overnatting), 1:2 (4 h) og ren harpiks (overnatting). La eksemplarer på shaker inne avtrekksvifte på hvert trinn, og cap beholderen for alle, men de to siste trinnene.
Merk: Harpiks er også tyktflytende dreneres så prøver må flyttes til en ny disponibel container på hvert trinn. - Forberede blokker montere prøvene. Blokker kan være tilpasset laget av kutte akryl glass i små rektangulære blokker (1,5 x 0.5 x 0,3 cm). Blokker kan også gjøres ved å helle epoxy harpiks (det finnes mange kommersielle kits tilgjengelig) i silisium mold og deretter cure den i ovnen i 12-14 h på 60 ° C.
Forsiktig: Uherdet (flytende) harpiks er kreftfremkallende og skal returneres til ovnen til fullt herdet. - Plass blokken loddrett i mold. Forsiktig ta prøver fra flytende harpiks, tillate overskytende resin renne og plasser prøven på blokken. En liten mengde ekstra harpiks kan brukes til å binde prøven til blokken.
- Etiketten blokken. Skrive ut papir etikettene og bygges inn i blokken eller knytte den til en blokk ansikt.
- Holde formen med de innebygde blokkene i ovnen i 12-14 h på 60 ° C.
- Lagre prøveblokken i en ren konvolutt. Dette kan lagres på denne måten over flere måneder til år.
- La de brukte containerne, skitne hansker og andre forurenset utstyr i avtrekksvifte tillate aceton å fordampe helt (minst 12 h).
- Cure harpiks i ovnen før forkaster disponibel utstyr eller skraping harpiks av andre elementer som tang.
- Snitting
- Observere blokken under dissecting mikroskopet slik at Prøveretningen er riktig for snitting flyet.
- Hvis retningen ikke er riktig, kan du bruke en gullsmed så å kutte ut prøven og re-orientere bruker fragmenter satt harpiks og fersk harpiks til nytt sete prøven. Hodet kan også deles i to halvdeler til delen de to øynene separat. Kurere harpiks igjen før du fortsetter.
- Montere blokken på flyttbare mikrotomen chuck. Fjern chuck og plasser på holderen.
- Trim harpiks blokken med et barberblad under dissecting mikroskop.
Forsiktig: Ikke gjør dette når chuck er montert på mikrotomen armen som det kan støte armen og skade lagrene. - Monter chuck på mikrotomen armen og vinkel prøven.
- Montere kniven på holderen i riktig vinkel (0° for glasskniver, se produsentens instruksjoner for diamantkniver).
Merk: Glasskniver kan gjøres billig med et glass knivmaker men må byttes regelmessig som de mister deres kanten. høy kvalitet diamantkniver kan kjøpes men er dyre, krever spesiell omtanke, og er ikke egnet for nybegynnere. - Fyll kniven båt med destillert vann med en syringe utstyrt med et filter (0,45 µm porestørrelse).
- Fylle båten til Vannstanden når kanten av kniven; meniscus kan være konveks i andre områder av båten.
- Drain båten før meniscus er veldig lett konkav men fortsatt når kanten av kniven. Nivået på vannet kan justeres når som helst, men alltid fra kanten på kniven.
- Forsiktig ta kniven til prøven og justere blokken til kniven. Dette er best gjort langsomt, regelmessig sjekke nærhet av kniven i okularet og fra siden.
Merk: Se instrument håndboken for spesifikke instruksjoner instrumenter variere. - Angi snittykkelsen mikrotomen. Velge korrekt vil være avhengig av prøven størrelse, området rundt og typen kniv brukes.
- Hvis bruker glass kniv velger en høyere innstilling (f.eks, 4 µm) hvis mye materiale må skjæres bort før området av interesse. Hvis en diamant kniv brukes, eller hvis prøven er svært liten, kan 1-2 µm være mer passende.
- Start på "cutting" (Spy mikrotomen hjulet) Når kniven er tett, men ennå ikke skjære i prøven å utføre den siste delen av tilnærming. Delene skal starte vises i noen rotasjoner; Hvis ikke, stopp og nøye bringe kniven litt nærmere.
- Justere delen samle tykkelse (1 µm for semi tynne snitt) når nærmer regionen rundt.
- Samle alle seksjoner med en øyenvippe verktøy.
Merk: Øyenvippe verktøy kan gjøres med en øyenvippe montert på en tynn pinne med neglelakk. - Hvis mye materiale må fjernes, tillate delene å samle og fjerne blasts fjerne kniven og skylle den ut med vann. Hvis bruker glass kniv, kan dette være en passende tid å endre til en ny del av kniven eller en ny kniv.
- Stedet en rekke små dråper destillert vann på et lysbilde med en Pasteur pipette, eller ideelt sett filteret utstyrt sprøyten.
- Nøye flyt delen samlet på øyenvippe på vann droplet.
- Samle deler som dette til å sjekk dybden på snitting.
Merk: Selv om det kan være kjedelig, det er alltid best å sjekke ofte. - Plass lysbildet på en kokeplate satt til 60 ° C. Tillat alle vannet til å fordampe og delen overholder lysbildet.
- Fargestoff seksjoner med toluidine blå for 10-60 s (flekker tid vil variere med snittykkelsen). Fargestoff dispensere sprøyte utstyrt med et filter (som over).
- Plasser en dråpe fargestoff i den ene enden av lysbildet og spre den bruker siden av nålen uten å berøre eller skraping delene. Plass lysbildet på varmeplaten for omtrent 10-20s.
- Skyll lysbildet ved å spraye den med destillert vann i en og plassere den på kokeplate å tørke den.
- Sjekk under satt mikroskop og image dem.
- Gjenta til områder av interesse er nådd.
- Ultra-tynne deler: Angi kutte tykkelse mellom 40-60-nm å samle TEM deler.
- Kutt om 3-5 deler og sjekk tykkelse ved hjelp av en forstyrrelse fargekart. Deler bør reflektere lys grå når de vises i en vinkel.
Merk: Kloroform røyk kan være pipetted over å slappe av noen bretter. Dette er mest relevant for erfarne brukere og nybegynnere trenger ikke bekymre deg. For mye kloroform utgitt for nær til delen kan skade deler. - Hente et Formvar-belagt, kobber, spor rutenett holdt med tang med Formvar side. Pass på at du ikke punktere Formvar belegget.
- Dukkert rutenettet i båten edgeways og fra delene, så ta rutenettet opp parallell til overflaten under avsnittene. Om nødvendig kan du bruke øyenvippe for å veilede delene over rutenettet.
- Nøye dab rundt spissen av Tang med filter papir å suge opp vannet fanget mellom armene. Hvis dette ikke gjøres, kan vannet spenning trekker rutenettet opp mellom armene eller lage det stikker til side. Dette kan føre til forurensning eller mekaniske skader.
- Nøye fjerne overflødig vann fra nettet selv ved står rutenettet edgeways på filter papir.
- Sted rutenettet i rutenett innehaver.
- Gjenta til nok delene har vært samlet.
- Semi tynne snitt kan avbildes direkte med noen satt mikroskop utstyrt med et kamera. Neddyppingsolje kan plasseres direkte på delene. Lysbildene skal lagres i et lysbilde for å hindre misfarging.
- Farging ultratynne delen TEM kontrast
Merk: Følgende trinn gjennomføres under tak som fargestoffer er lys og CO2 følsom. Videre EM fargestoffer bruke tungmetaller for å produsere kontrast og er derfor farlige stoffer. Hensiktsmessig hensyn må tas når du håndterer disse flekker.- Dekk noen store Petri retter med aluminiumsfolie blokkere lys. Arbeid under disse trinnene. Delvis avdekke dem for å tillate arbeidsplass men sette deksler på så snart som mulig.
- Skjær et stykke voks film og forsiktig plassere fem dråper av 6% mettet uranyl acetate på det med en Pasteur pipette.
- For å forberede løsningen, bland 2 g uranyl acetate med 100 mL 50% metanol i destillert vann og filtrerer løsningen før du bruker. Løsningen kan ikke lagres, og bør gjøres fersk hver gang19.
- Forsiktig plukke opp TEM rutenett med tang og balanse over fargestoff dråper med den del siden ned. La for 25 min.
- Skyll rutenett individuelt ved raskt dyppe dem av destillert vann; fremgang gjennom fire forskjellige flasker destillert vann.
- Plassere fem dråper av bly citrate på et nytt stykke film. Ordne noen NaOH pellets rundt fargestoff dråper (dette absorberer atmosfærisk CO2 for å hindre utfelling av bly karbonat).
- Hvis du vil ledelsen citrate løsningen, forberede bi-destillert vann av kokende destillert vann 0,5 h. Tillat vann til kule og i en sealable beholder, legge 0,3 g bly citrate til 100 mL bi-destillert vann. Legge 1 mL 10 M NaOH, sel beholderen tett, og rist til oppløst19.
- Plass rutenettet på fargestoff dråpene som beskrevet i 4.3 og dekk. Flekk i 5 min.
- Skyll i destillert vann som før av dipping rutenett av destillert vann 20 ganger. Fremgang gjennom tre fartøyer destillert vann.
- Nyt overflødig vann med filter papir og tillate rutenettene tørke i en rutenett.
- Bildet i en TEM på lav akselererende spenning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodene som er beskrevet her aktivere detaljert studie av enkle og sammensatte øynene av maur. Imaging dorsal utsikten over hodet med Z stabel photomicrography teknikker gjør det mulig å få en oversikt over utformingen av det visuelle systemet (figur 1). Dette er god forberedelse for disseksjoner og bestemme nødvendige snitting vinkelen. Denne teknikken er også nyttig for å ta målinger som hode bredde, øye lengde og ocellar lens diameter. SEM imaging gir også detaljert oversikt bilder, men i tillegg gir oppkjøpet av forstørring og bilder med høy oppløsning. Bestemte områder av interesse i øyet kan bli undersøkt i detalj og variasjoner i linsen form kan identifiseres (figur 2). SEM bilder er spesielt nyttig for å løse maur med små øyne og ocelli. Hornhinnen Kopier gir informasjon om form, størrelse og antall objektiver i hvert øye (Figur 3). Semi tynne snitt fotografert bruke LM teknikker tillater undersøkelse av brutto interne anatomi av øyet (Figur 4 og figur 5); Dette inkluderer tykkelsen på linsen, diameter av krystallinsk membran, tilstedeværelsen av en krystallinsk kjegle tarmkanalen, form, bredden og lengden på rhabdom, kartlegging dorsal rim området, og plasseringen av primære og sekundære pigment cellene. Denne teknikken kan bli pent supplert med ultra tynne snitt fotografert med TEM, som tillater å bestemme ultrastructure spesielt microvillar retningen (Figur 4) og den kvantifisere mindre strukturer (f.eks bredden på den trange krystallinske kjegle tarmkanalen, figur 5).
Figur 1: Z stabel photomicrographs av de tre kastene av australske sukker maur, Camponotus consobrinus. Dette gir en oversikt over utformingen av det visuelle systemet i alle tre kaster. Tilpasset fra referanse20. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Scanning elektron micrographs av maur visuelle systemet demonstrere tenkelig egenskapene til denne teknikken. Øverste rad viser ulike øye posisjoner og øye størrelser i: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; og (C) Amblyopone australis (Merk veldig små øyne, hvite pilen). Bilder kjøpt til forstørring viser: (D) tre enkle øyne arbeiderne i Myrmecia nigriceps, forskjellige størrelse sammensatte øyet i (E) Rhytidoponera metallica (Merk de ulike formet ommatidia i ulike regioner av sammensatte øyet i gult), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkiog (jeg) lever arter. Skalere barer = 1 mm (-vekselstrøm), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: hornhinnen kopier av maur øye og ocelli. (A) kopi av sammensatte øyet av en arbeider av Myrmecia nigriceps. Konveks replikaen var flat ved å lage snitt. Rammemargen angir bakre (p), anterior (), og dorsal (d), ventrale (v) akser. (B) kopi av ocelli av arbeidstaker Myrmecia tarsata. Skalere barer = 0,5 mm (A), 10 µm (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: LM og EM bilder av rhabdom tverrsnitt. (A) tverrsnitt av distale rhabdoms i Myrmecia nigriceps beiset i toluidine blå kan brukes til å skille rhabdoms runde eller rektangulære i form. Transmission elektron micrographs Vis: (B) flere orientering av microvilli i den sirkulære rhabdom og (C) microvilli orientert i to motsatte retninger i den rektangulære formet rhabdom. (D) bruke * lys, den lange aksen til rektangulær rhabdoms tilordnes for å vise en fan-lignende organisasjon i regionen dorsal i øyet i dronningen av Camponotus consobrinus; innfelt angir bakre (p), anterior (a) og lateral (l), mediale (m) akser. Panelet D tilpasset fra referanse20. Skalere barer = 10 µm (A), 1 µm (ABC), 100 µm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: LM og EM bilder av en ommatidium i en lys-tilpasset øyet av Myrmecia tarsata. (A) langsgående delen av en ommatidium viser hornhinnen (C), krystallinsk kjegle (CC), kjegle skrift (ct), rhabdom (Rh) og primære pigment cellene (PPC). (B) stiplet rektangulære boksen i panel A fra en annen inndeling vises under en TEM å kvantifisere smale bredden av membran skrift. Tilpasset fra referanse21. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: vanlige problemer med semi tynn og ultra-tynne deler (fiksering og infiltrasjon, skjæring og flekker). (A) dårlig fiksering av vev på grunn av utilstrekkelig penetrasjon (pil) i en semi tynn del av lever arter; (B) ripping under snitting i Iridomyrmex calvus (semi tynn); (C) perfekt flekker (venstre) og over flekker (høyre) med toluidine blå i Myrmecia croslandi; (D) pigment (sirkel) og vev ripping under snitting (piler) på grunn av dårlig matching av harpiks og vev tetthet (harpiks for myk). Folding av delen (stjerner), kan skje når delene fra kniv båten; (E) dårlig kontrast på grunn av utilstrekkelig flekker (sammenlignet med innfelt), bly citrate krystaller (hvite piler) fra eksponering for CO2, og loddrette kniv merke (svart piler); (F) hull i vev (hvite piler) forårsaket av dårlig fiksering i en Melophorus hirsutus sammensatte øyet; (G) harpiks for myk, fører til chitter ved snitting som vertikale krusninger i delen. (H) delen for tykk (~ 100 nm) resulterte i mørkt bilde med dårlig kontrast, forurenset destillert vann føre til bakterier og svevestøv spredt over hele delen (hvite piler) i lever arter. Skala bar = 25 µm (AB), 10 µm (C-H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suiten av metodene beskrevet ovenfor gir en effektiv etterforskning optiske systemet av maur og andre insekter. Disse teknikkene informere vår forståelse av prøvetaking oppløsning, optisk følsomhet og potensielle polarisering følsomheten til øyet blir studert. Denne kunnskapen gir en viktig fundament for fysiologiske og behavioral etterforskning sine visuelle evner. Videre mens metodene finnesher har fokusert på maur synlig systemer, kan disse teknikkene brukes på andre insekter, men med små endringer i protokollen (f.eksøke fiksering og infiltrasjon tykkere vev) . Litt modifisert protokoller har blitt brukt som karakteriserer visuelle systemer av en rekke insekter som sikader22, fluer14, bier23, veps24, sommerfugler25og møll26. Selv om de fleste teknikkene skissert her har vært i bruk i noen tid, denne artikkelen tar muligheten til å samle dem i sammenheng med studere maur optisk system og sammenligne alternative teknikker og beskriver vanlige fallgruvene.
Det er mange imaging teknikker tilgjengelig som har overlappende programmer kan det være vanskelig å vurdere hvilke teknikken er egnet for oppgaven. Et aktuelle eksempel her er å velge en teknikk for oversikt bildebehandling. Eksterne morfologi av hodet og øye og relativ plassering av optisk system på hodet kan gjøres ved hjelp av SEM eller photomicrography. Styrker og svakheter av disse teknikkene har vært vurdert27, men det er spesielle hensyn når imaging øyne. Når imaging relativ plassering og størrelse på øynene, har begge teknikkene sine fordeler og ulemper. SEM bilder mangler fargeinformasjon og dermed hvor pigmentering er relevante photomicrography er bedre. Men kan SEM bilder illustrere fine strukturer som Inter ommatidial hår og fasett grenser i større detalj og selv avsløre overflaten funksjoner ikke synlig under photomicrography teknikker (f.eks, ocellar linser, overflate oversiden sammensatte øyet linser). SEM er en allsidig teknikk når det gjelder utforskende imaging og identifisere funksjoner av interesse fordi den kan operere på en rekke prøvestørrelser stund fremdeles retaining svært høy oppløsning over hele dette området. Men det er ikke så allment tilgjengelig som disseksjon mikroskop og krever et høyere nivå av kompetanse. Det er ofte ingen enkel måte å skaffe informasjonen krever. I et slikt scenario er det nyttig å vurdere hva som er tilgjengelig og hvor det er viktigst å investere ressurser.
Neglelakk kopier av hornhinnen har vist seg for å være mest nyttig i å få mest nøyaktige mål fasett tall og fasett diameter. Dette har nå blitt brukt i en rekke insekter11,22,28,29. Kvaliteten på bildene fra en SEM er langt overlegen, hindrer kurvatur av øyet nøyaktige målinger av hele fasett matrisen. Tilordne fasett størrelse og fasett distribusjon bør også være mulig fra skanner fra mikro-beregnet tomografi5.
I både LM og TEM teknikker er det ofte vanskelig å vite om prøven er utarbeidet og behandlet godt til sluttfasen av tenkelig. For å unngå komplikasjoner, er det viktig å etablere god praksis for eksempel opprettholde feilfri arbeider mellomrom og verktøy, forbereder frisk løsninger regelmessig, og grundig filtrering vann. Forurensninger som er usynlig for det blotte øye kan ødelegge EM prøver. Derfor kan det være nyttig å tørke ned overflater og instrumenter med et løsemiddel, som etanol eller aceton, og en ikke-lint produsere tørke. Dette er mest relevant når snitting flekker EM seksjoner, og forbereder SEM prøver. Tilsvarende destillert vannkilder kan presentere problemer og introdusere miljøgifter så det er alltid best å sjekke filtre, endre dem regelmessig, og bruk alltid fersk filtrert vann (lagrer ikke). De fleste fiksativene, flekker og innebygging materialer kan ikke lagres på ubestemt tid, og det er viktig å merke alle løsninger med tidspunktet for. Det er viktig å ta en systematisk tilnærming og sette av nok tid til å utføre uten avbrudd.
Tilpasse teknikker til ulike arter er alltid et spørsmål om prøving og feiling. Når du arbeider i Formicidae, ligger hovedforskjellene i størrelsen på dyret og muskelmasse i hodet. Maur med mer muskulaturen i hodet vil vanligvis ta lengre tid å fikse. Med svært store maur er det best å fjerne mandibular muskler, trachea og mandibular kjertler, samtidig minst interferens med nevrale vevet. I små maur og de med noen mandibular muskler er det mulig å oppnå tilstrekkelig fiksering av bare fjerne Accolade og utsette regionen clypeal. I disse tilfellene kan små hull med bagateller pinner gjøres på hodet å forbedre fiksering.
Det er viktig å merke seg at miljøforhold kan også påvirke forberedelser. Varmt og fuktig miljøer (spesielt feltet stasjon i tropene) kan vise seg for å være en utfordring under infiltrasjon scenen. Varme forhold kan føre harpiks til danner delvis tidlig som resulterer i ubrukte harpiks blir stadig mer tyktflytende. I dette tilfellet er det beste alternativet å lagre harpiks i liten, enkel bruk, beholdere i kjøleskap eller fryser. Kjøling fiksativene kan være nyttig å counter raskere vev forfall i varme forhold. Imidlertid spre avkjølt løsninger saktere som betyr at behandlingstider bør utvides for å sikre riktig penetrasjon.
Med disse advarsler i tankene kan etterforskning optiske systemet av maur og andre insekter være svært givende. Studere det visuelle systemet tillater oss å beregne størrelsen på visuelle felt, interommatidial vinkler, optisk følsomhet og prøvetaking oppløsninger. Forstå anatomien i øyet informerer vår forståelse og tolkning av dyr oppførsel. For eksempel anatomi tillater oss å spå på de visuelle funksjonene dyr som om de er dagaktive eller nattdyr, som kanskje ikke tidligere dokumentert. Gitt dagens kunnskap om visuelle system av håndfull av maur, håper vi våre metoder vil inspirere biologer og myrmecologists å undersøke sammensatte øyet og ocelli i maur å fremme vår forståelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Jochen Zeil, Paul Cooper og Birgit Greiner for deler sine kunnskaper i insekt anatomi og for å vise flere av teknikkene vi har beskrevet her. Vi er takknemlige for talentfulle og støttende personalet ved Centre for Advanced mikroskopi på ANU og The mikroskopi Unit på MQU. Dette arbeidet ble støttet av en utdannet stipend til FRE og tilskudd fra den australske forskningsråd (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
