Summary
Este artigo descreve um conjunto de técnicas de luz e microscopia eletrônica de varredura para estudar a anatomia interna e externa do olho de insetos. Estes incluem várias técnicas tradicionais otimizadas para trabalhar em olhos de formiga, detalhados de solução de problemas e sugestões para otimização de espécimes diferentes e regiões de interesse.
Abstract
Este artigo descreve um conjunto de técnicas em microscopia de luz (LM) e microscopia de elétron (EM) que pode ser usada para estudar a anatomia interna e externa do olho de insetos. Estes incluem técnicas histológicas tradicionais otimizado para trabalhar em olhos de formiga e adaptado para trabalhar em conjunto com outras técnicas, como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Essas técnicas, embora muito útil, podem ser difícil para a microscopista iniciante, então grande ênfase foi colocada neste artigo sobre solução de problemas e otimização para espécimes diferentes. Podemos fornecer informações sobre técnicas de imagem para o espécime inteiro (foto-microscopia e SEM) e discutir as suas vantagens e desvantagens. Destaca-se a técnica utilizada na determinação de diâmetros de lente para o olho inteiro e discutir novas técnicas para melhoria. Por fim, discutimos as técnicas envolvidas na preparação de amostras para LM e TEM, corte, coloração e estas amostras de imagem. Vamos discutir os obstáculos que um pode vir do outro lado quando preparar amostras e melhor forma de navegar ao redor deles.
Introduction
Visão é uma modalidade sensorial importante para a maioria dos animais. Visão é especialmente crucial no contexto de navegação para identificar objetivos, estabelecendo e aderindo às rotas e obter informações bússola1,2. Insetos detectam informação visual usando um par de olhos compostos e, em alguns casos, uma a três colocados dorsalmente simples olhos chamados ocelos3,4,5.
Os olhos das formigas são de particular interesse porque, enquanto as formigas são maravilhosamente diversificadas, eles conservar algumas características chaves em toda a espécie. Apesar da dramática variação no tamanho, anatomia e ecologia, a grande maioria das espécies é eussociais e vive em colônias; Como resultado, diferentes espécies enfrentam desafios visuais similares em termos de navegação e para trás entre um lugar central e recursos. Através de formigas a mesma bauplan olho básico pode ser observado nos animais que variam de 0,5-26 mm de comprimento, de exclusivamente diurnos a espécie estritamente noturno e de lento andar subterrâneo para saltar predadores visual6,7, 8,9,10. Todas estas diferenças de escalonamento em ecologia e comportamento dão origem a inúmeras permutações das estruturas básicas de olho mesmo para se adequar a diferentes ambientes, estilos de vida e corpo-tamanhos11,12. Como consequência, estudar a ecologia visual de formigas fornece um verdadeiro tesouro de possibilidades para o investigador determinado.
Compreender o sistema visual de insetos é essencial na obtenção de uma visão sobre suas capacidades comportamentais. Isto é evidente de estudos integrativo que combinam muito bem a anatomia com a ecologia e comportamento de um grande sucesso em alguns grupos de insetos (por exemplo, referências13,14,15,16, 17). embora o campo da formiga navegação e comportamento de formigas em geral tem sido muito bem sucedido, muito pouca ênfase foi colocada na visão de formiga fora algumas espécies selecionadas. Aqui, nós irá elaborar sobre as técnicas envolvidas no projeto de olho de formigas a investigar. Enquanto vamos nos concentrar em formigas, estas técnicas podem ser aplicadas, com pequenas modificações, para outros insetos, também.
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Protocol
1. preparação das amostras
Nota: É necessário primeiro compreender o local relativo o olho composto e ocelos uns aos outros e para a cabeça. Isto pode ser conseguido através da aquisição de imagens da vista dorsal da cabeça. Por isso, recomendamos o processamento de amostras para Fotomicrografia ou usando técnicas SEM. Abaixo estão as etapas envolvidas em ambos os processos.
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Coleta de amostras
- Coletar e armazenar amostras diretamente em etanol a 70%. Recolha as castas diferentes, sempre que possível.
- Rotular espécimes com hora, data e local, bem como quaisquer outras observações relevantes (por exemplo, coletados durante o forrageamento, acasalamento de agregação, ninho dentro de um galho, etc.)
- Colete as amostras suficiente para ter várias repetições em cada tratamento.
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Fotomicrografia e Z-empilhamento
- Ar secos espécimes e montá-los em cartões de ponto triangular, usando cola solúvel em água e, em seguida, um pino de insetos. Para obter detalhes, consulte referência18.
- Imagem usando um microscópio de alta magnificação com um motor de passo-Z e uma câmera de cor.
- Use um difusor para iluminação uniforme para espécimes.
- Capturar imagens em diferentes planos focais e salvar imagens em um formato de arquivo sem perdas (tais como tiff) e pilha de foco-los usando o software disponível comercialmente.
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Elétron-micrografias de digitalização
Nota: Limpe cuidadosamente todas as ferramentas e superfícies de trabalho com álcool etílico para evitar a contaminação da amostra com poeira e outras partículas.- Desidratar as amostras em etanol durante a noite e ar seco em um prato de Petri.
- Use uma lâmina afiada para separar a cabeça do resto do corpo.
- Montar a cabeça com o ângulo de visualização necessária (por exemplo, dorsal voltada para cima) na stubs de alumínio usando fita de carbono condutivo ou guias. Corte a fita de carbono em tiras finas e dobre-o para apoiar a cabeça da cápsula.
- Use um sputter coater para aplicar ouro na superfície da amostra por 2 min a 20 mA com um palco giratório. O tempo e a corrente podem precisar ser ajustada dependendo do instrumento.
- Transferi as amostras para um novo esboço de alumínio com fita de carbono fresco ou guias.
Nota: O carbono não revestido irá fornecer um fundo preto, mas transferir amostras pode danificar o revestimento de ouro. - Verifique se a orientação do espécime é ainda correta usando um microscópio de dissecação e ajustar, se necessário com um par de pinças bem ou ferramenta semelhante. Tome cuidado para não riscar o revestimento de ouro; Pega o mínimo possível.
- Carregar amostras no suporte SEM esboço, fazendo a anotação da posição de stubs e espécimes em relação uns aos outros.
Nota: Alguns SEMs estão equipados com uma câmera de palco, mas muitos não são e pode ser difícil localizar pequenos espécimes em alta ampliação. - Os espécimes da imagem. Use uma baixa tensão de aceleração para evitar o carregamento e uma pequena abertura para boa profundidade de campo.
Nota: As configurações são melhor otimizadas em consulta com um técnico especializado no instrumento específico a ser usado.
2. quantificação dos números de faceta e diâmetros
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Réplicas de córnea
- Use as formigas conservados em etanol ou montado em um pino para esta finalidade (etapa 1.1.1).
- Monte o animal em um pino de insetos ou em plasticina. Se a cabeça é relativamente grande, as restantes partes do corpo podem ser removidas.
- Use um inseto pino ou um palito de dente fino para pegar uma pequena gota de esmalte secagem rápida incolor e rapidamente, espalhe-o sobre o olho. Certifique-se que o pino não coçar o olho. O esmalte deve cobrir o olho inteiro e alguns da cabeça cápsula circundante.
Nota: É importante que o esmalte seja de espessura relativamente uniforme em todo o olho. - Deixe o unha polonês para definir a temperatura de quarto.
- Uma vez que é totalmente definido, use um alfinete inseto para levante suavemente a réplica da cápsula cabeça em torno do olho.
- Use um belo par de pinça limpa para levantar a réplica, segure a parte da réplica que cobre a cabeça e não para o olho.
- Certifique-se de consciência da orientação do olho: região anterior, posterior, dorsal e ventral.
- Coloque a réplica sobre uma lâmina de vidro. Use uma lâmina de barbear para a réplica, removendo cuidadosamente o material em excesso ao redor dos olhos. Use uma agulha ou um par de pinças para impedir que a réplica de mover.
- Se o olho é muito convexo, use uma lâmina de barbear para fazer 3-4 incisões parciais bem radiais em torno da borda para ajudar 'achatar' a réplica. Se o olho é relativamente 'plano', não há nenhuma necessidade de fazer tais incisões.
- Coloca uma lamínula suavemente na réplica de olho, garantindo que a orientação da réplica é conhecida. Não aplique pressão como isto pode eliminar a impressão da córnea sobre o esmalte.
- Sele a lamela usando muito pouco de esmalte nos quatro cantos. Se o esmalte dos fluxos entre a lamínula e lâminas de vidro, danificará a réplica.
- Imagem do slide em um microscópio composto.
Nota: se apenas algumas facetas estão em foco, então isto sugere que a réplica do olho não é achatada suficiente. Descartar e começar de novo da etapa 2.1.3. - Importe a imagem para programas livremente disponíveis como ImageJ/Fiji, onde o número de omatídeos e tamanho de cada omatídeos podem ser medidos.
Nota: Este método pode ser usado para preparar réplicas de ocelos, também. Uma vez que é uma lente única, recomendamos manter todos os ocelos juntos em uma réplica.
3. analisar a estrutura do olho
Nota: Para estudar a anatomia do olho requer na maioria dos casos duas complementares técnicas de LM e temperatura. Os estágios de processamento inicial exigem técnicas semelhantes para LM e temperatura. A diferença surge desde a fase de corte em diante. Processamento de amostras requer o uso de produtos químicos perigosos, que devem ser manuseadas com cuidado e descartados com responsabilidade. Usar equipamento de proteção pessoal, trabalho em uma coifa, sempre ler o sheets(SDS) de dados de segurança e realizar avaliações de risco antes de iniciar.
- Dissecação
- Anestesiar as amostras por refrigeração ou por exposição a gases de CO2.
- CO2 anestesia é muito rápido (geralmente menos de 1 min) e deve ter cuidado para evitar a superexposição, pois isto pode resultar na morte do espécime. Se utilizar pastilhas de gelo seco (sólido CO2) Evite o contato direto com as amostras pois pode causar queimaduras de frias.
- Anestesia fria é mais lenta; 4 ° C é suficiente, e temperaturas mais frias não são recomendadas. Estabelece um tempo de arrefecimento adequado para a espécie. Frias ou grandes formigas resistentes como formigas touro podem exigir > 10 min tornar-se totalmente imobilizado, enquanto espécies menores podem precisar de apenas 1-2 min. de resfriamento excessivo vai matar o espécime (Evite o contato direto com gelo). Espécimes de preferência devem ser realizadas em recipientes pequenos, rolhado de espuma, plásticos e colocados em uma geladeira, onde eles podem ser observados em vez de um refrigerador elétrico ou no congelador.
- Colocar a amostra em uma placa de Petri e ajustar para visualização sob um microscópio de dissecação. Trabalhando rapidamente é importante preservar a anestesia e evitar a degeneração do tecido, uma vez que são feitas incisões (este pode) acontecer em poucos segundos.
- Retire as antenas com fórceps. Se trabalhar com um inseto pica, é aconselhável amputar a Suíça primeiro para evitar ser picado.
- Retire as peças de boca usando uma lâmina de barbear afiada; fórceps pode ser usado para segurar o espécime. Corte a parte anterior do olho (grandes espécimes) ou tão perto dos olhos quanto possível (pequenas amostras) sem puxar sobre o cérebro como isto podem rasgar a retina.
- Prepare-se para abrir a cápsula de cabeça. O espécime do ângulo para que a primeira incisão é apontando para cima; Isso pode ser feito tanto ao microscópio de dissecação, mantendo a amostra no fórceps ou sob controle visual, mantendo a amostra entre o dedo polegar e primeiro plano.
- Faça uma incisão transversal na cabeça para remover a porção ventral da cabeça; parte do olho ventral pode ser removido em grandes espécies para melhorar a fixação e a infiltração. A cabeça ainda deve ser fixada ao corpo neste momento.
- Cortar a cabeça cápsula do corpo fazendo uma incisão coronal só posterior para o olho composto.
- Colocar a cápsula dissecada da cabeça com os olhos compostos em fixador frio gelo: 2,5% paraformaldeído glutaraldeído e 2% em tampão fosfato (pH 7,2-7,5).
Atenção: O fixador é corrosivo e tóxico; usar proteção adequada e em uma coifa.
Nota: É importante trabalhar rapidamente para prender a degeneração do tecido neural. A dissecação deve ser concluído em 2 min ou menos (dissecação eficiente pode exigir um pouco de prática).
Nota: Se o olho precisa ser adaptado às condições clara ou escuras, então primeiro expor os animais para a necessária condição de luz por algumas horas. Realize as dissecções em condições de luz respectivas. Dissecações podem efectuar-se sob luzes vermelhas para simular a escuridão.
- Anestesiar as amostras por refrigeração ou por exposição a gases de CO2.
- Espécime de processamento
- Mantenha as amostras no fixador em temperatura ambiente com movimento em um agitador orbital, para grandes espécimes de h. 2 podem exigir mais tempos de fixação.
- Retire o fixador e descartá-lo adequadamente. Lave as amostras em temperatura ambiente de tampão de fosfato (3 vezes, 5 min cada) no agitador.
Nota: O tampão fosfato é composto por 8 g NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na2HPO4e 0,244 g KH2PO4 em 1 litro de água destilada H2O (pH 7,2). - Retire o tampão fosfato e adicionar 2% OsO4. Coloque o frasco de amostra no agitador na coifa para 1-2 h. Este é um passo de pós-fixação para corrigir as gorduras e também fornecer contraste de temperatura.
Nota: Tempos de fixação de ósmio são sujeitas a tamanho da amostra; como uma regra de ouro bruto, calcule 1 h de fixação por 1 mm3. - Remover a solução de ósmio e descartá-lo adequadamente. Lave as amostras em temperatura ambiente buffer (3 vezes, 5 min cada) no agitador.
- Desidratar os espécimes, colocando-os em concentrações crescentes de etanol ou acetona; por exemplo, 50, 70, 80 e 95% por 10 min cada e finalmente 100% (2 vezes, 15 min cada). Coloca as amostras no agitador entre mudanças de solução.
Nota: Se necessário, as amostras podem ser armazenadas em etanol a 70% durante a noite. - Escorra o etanol e adicionar acetona 100%. Deixe por 20 min no agitador (pule esta etapa se desidrata-lo em acetona). Substituir com acetona fresca e deixá-lo por um adicional de 20 min.
- Infiltrar os tecidos com resina usando os seguintes rácios de acetona para resina: 2:1 (3 h), 1:1 (noite), 1:2 (4h) e resina pura (overnight). A cada passo deixar amostras no agitador dentro da coifa e tampar o recipiente para todos, mas as duas últimas etapas.
Nota: A resina é demasiado viscosa para ser drenado por espécimes devem ser movidas para um novo recipiente descartável em cada etapa. - Prepare blocos de montar as amostras. Blocos podem ser feito por vidro acrílico corte em pequenos blocos retangulares (1.5 x 0.5 x 0,3 cm). Blocos também podem ser feitos pelo derramamento resina epóxi (há muitos kits comerciais disponíveis) em um molde de silicone e depois curá-lo no forno por 12-14 h a 60 ° C.
Cuidado: Resina (líquida) não polimerizada é cancerígena e deve ser retornada ao forno até totalmente endurecido. - Coloque o bloco verticalmente no molde. Cuidadosamente pegue os espécimes da resina líquida, permitir que o excesso de resina drenar e coloque a amostra no topo do bloco. Uma pequena quantidade de resina adicional pode ser usada para vincular o espécime para o bloco.
- Rotule o bloco. Imprimir as etiquetas de papel e incorporá-lo no bloco ou anexá-lo para uma face do bloco.
- Manter o molde com os blocos incorporados no forno por 12-14 h a 60 ° C.
- Armazene o bloco de amostra em um envelope limpo. Isto pode ser armazenado desta maneira ao longo de vários meses a anos.
- Deixe os recipientes usados, luvas sujas e outros equipamentos contaminados na coifa para permitir que a acetona evaporar completamente (mínimo 12 h).
- Resina de cura no forno antes de descartar o equipamento descartável ou raspagem resina fora outros itens tais como fórceps.
- De corte
- Observe o bloco sob o microscópio dissecação para garantir que a orientação de amostra é adequada para o plano de corte.
- Se a orientação não é apropriada, use a serra de um joalheiro para cortar a amostra e re-orientar usando fragmentos de conjunto de resina e resina fresca para re-sede o espécime. A cabeça também pode ser dividida em duas metades a secção os dois olhos separadamente. Cura da resina novamente antes de prosseguir.
- Monte o bloco sobre o chuck micrótomo removível. Remover o mandril e coloque no suporte.
- Apare o bloco de resina usando uma lâmina de barbear sob o microscópio de dissecação.
Cuidado: Não faça isso quando o mandril é montado sobre o braço do micrótomo que pode abalar o braço e danificar os rolamentos. - Remontar o chuck sobre o braço do micrótomo e ângulo da amostra.
- Montar a faca sobre o titular no ângulo apropriado (0° para facas de vidro, consulte as instruções do fabricante para bisturis de diamante).
Nota: Facas de vidro podem ser feitas mais barato com um fabricante de faca de vidro mas devem ser substituídas periodicamente, como eles perdem sua borda; Bisturis de diamante de alta qualidade podem ser comprados, mas são caros, necessitam de cuidados especiais e não são adequados para iniciantes. - Encha o barco de faca com água destilada, usando uma seringa equipada com um filtro (tamanho de poro de 0,45 µm).
- O barco, encher até o nível da água atinge a borda da faca; o menisco pode ser convexo em outras áreas do barco.
- Drene o barco até o menisco é ligeiramente côncavo, mas ainda atinge a borda da faca. O nível da água pode ser ajustado a qualquer momento, mas sempre longe da borda da faca.
- Cuidadosamente, trago a faca em direção ao modelo e alinhar o bloco para a faca. Este é o melhor feito lentamente, periodicamente, verificando a proximidade da faca através da ocular e do lado.
Nota: Verifique o manual do instrumento para obter instruções específicas como instrumentos variam. - Defina a espessura de corte em micrótomo. Selecionar a espessura correta será dependente do tamanho da amostra, a região de interesse e o tipo de faca sendo usado.
- Se usando uma faca de vidro seleccionar um ajuste mais alto (por exemplo, 4 µm), se um monte de material deve ser cortado antes de atingir a área de interesse. Se uma faca de diamante está sendo usada ou se a amostra é muito pequena, 1-2 µm pode ser mais apropriado.
- Inicie o "corte" (girar a roda do micrótomo) quando a faca é estreita, mas ainda não corte da amostra para realizar a última parte da abordagem. Seções devem começam a aparecer dentro de algumas rotações; Se não, pare e cuidadosamente trazer a faca um pouco mais perto.
- Ajustar a seção coleta de espessura (1 µm para cortes semifinos) quando se aproxima a região de interesse.
- Colete quaisquer seções usando uma ferramenta de cílios.
Nota: Ferramentas de cílios podem ser feitas com um cílio montado em uma vara fina com as unhas pintadas. - Se um monte de material deve ser removido, permitem que as seções acumular e remover em massa , removendo a faca e expulsando-o com água. Se usando uma faca de vidro, isto pode ser a hora certa para mudar para uma nova seção da faca ou uma faca nova.
- Lugar uma série de pequenas gotas de água destilada em um slide usando uma pipeta Pasteur ou idealmente, o filtro equipado seringa.
- Cuidadosamente flutue a seção coletada sobre os cílios para a gota de água.
- Recolha seções como essa até que é apropriado verificar a profundidade de corte.
Nota: Embora pode ser entediante, é sempre melhor verificar frequentemente. - Coloque o slide em uma chapa de fogão conjunto para 60 ° C. Permitir que toda a água evapore e a seção de aderir ao slide.
- Tingir as seções com toluidina azul para 10-60 s (tempo de coloração varia com espessura de corte). Dispense a tinta com uma seringa, equipada com um filtro (como acima).
- Coloque uma gota do corante em uma extremidade do slide e espalhá-lo usando o lado da agulha sem tocar ou raspar as seções. Coloque o slide sobre a chapa por aproximadamente 10-20 anos.
- Enxágue o slide por pulverização com água destilada em um frasco de lavagem e coloque-o sobre a chapa para secá-la.
- Verifique sob o microscópio composto e a imagem deles.
- Repita até a região de interesse é alcançado.
- Para seções ultra-finas: definir a espessura de corte entre 40-60 nm para recolher seções TEM.
- Corte sobre o 3-5 seções e espessura de seleção usando uma cartela de cores de interferência. Seções devem refletir luz cinza quando visto em um ângulo.
Nota: Os vapores de clorofórmio podem ser pipetados sobre seções de relaxar qualquer vincos. Isso é mais relevante para usuários experientes e iniciantes não precisam se preocupar. Muito clorofórmio lançado perto demais para a seção pode danificar as seções. - Pega uma grade de slot Formvar revestido de cobre, com pinça com o lado de Formvar retida. Tenha cuidado para não perfurar o revestimento de Formvar.
- Mergulhe a grade do barco de soslaio e longe das seções, então trazer a grade acima paralelo à superfície sob as seções. Se necessário utilize o cílio para guiar as seções sobre a grelha.
- Com cuidado, pincele ao redor da ponta da pinça com filtro de papel para absorver a água preso entre os braços. Se isso não for feito, tensão de água pode puxar a grade entre os braços ou fazê-lo ficar de lado. Isso pode resultar em contaminação ou danos mecânicos.
- Remova cuidadosamente o excesso de água da grade do próprio pé grade soslaio no papel de filtro.
- Coloque a grade em um suporte de grade.
- Repita até bastante seções foram recolhidas.
- Cortes semifinos podem ser fotografadas diretamente com qualquer microscópio composto equipado com uma câmera. Óleo de imersão pode ser colocado diretamente sobre as seções. Slides devem ser armazenados em uma caixa de slides, para evitar a descoloração.
- Seção ultra fina para contraste TEM a coloração
Nota: As etapas a seguir devem efectuar sob a tampa como as tinturas são luz e CO2 sensível. Além disso, tinturas EM usam metais pesados para produzir contraste e, portanto, são substâncias perigosas. Apropriado deve ter cuidado ao manusear essas manchas.- Cobrir alguns grandes placas de Petri com papel de alumínio para bloquear a luz. Trabalhar sob estas para as etapas seguintes. Parcialmente descobri-los para permitir que o espaço de trabalho, mas coloque as tampas volta logo que possível.
- Corte um pedaço de filme de cera e cuidadosamente coloque cinco gotas de acetato de uranilo 6% saturada nele usando uma pipeta Pasteur.
- Para preparar a solução, misture 2 g de acetato de uranilo com 100 mL de metanol 50% em água destilada e filtrar a solução antes de usar. A solução não pode ser armazenada e deve ser feita fresco cada vez19.
- Cuidadosamente pegue as grades TEM com fórceps e equilíbrio em cima gotas de corante com o lado da seção abaixo. Deixe por 25 min.
- Enxágue grades individualmente, mergulhando-os rapidamente dentro e fora de água destilada; progresso através de quatro diferentes frascos de água destilada.
- Coloque cinco gotas de citrato de chumbo em um pedaço de filme de fresco. Organizar algumas pelotas de NaOH em torno das gotas de tintura (isto absorve atmosférica de CO2 para evitar a precipitação de carbonato de chumbo).
- Para fazer a solução de citrato de chumbo, preparar água bi-destilada por água destilada fervente para 0,5 h. permitir a água esfriar e em um recipiente selável, adicionar citrato de chumbo de 0,3 g para 100 mL de água bi-destilada. Adicione 1 mL 10 M NaOH, feche bem o recipiente e agitar até dissolvidos19.
- Coloque as grades sobre as gotas de corante conforme descrito em 4.3 e capa. Mancha por 5 min.
- Enxaguar em água destilada como antes, mergulhando as grades dentro e fora de água destilada a 20 vezes. Progresso através de três navios de água destilada.
- Absorver o excesso de água com papel de filtro e permitem que as grades secar em uma caixa de grade.
- Imagem em uma temperatura em baixa tensão de aceleração.
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Representative Results
Os métodos descritos aqui permitem o estudo detalhado da simples e olhos compostos das formigas. A vista dorsal da cabeça usando técnicas de fotomicrografia de Z-pilha de imagem permite obter uma visão geral do layout do sistema visual (Figura 1). Esta é uma boa preparação para as dissecções e para determinar o ângulo de corte desejado. Esta técnica também é útil para a tomada de medidas tais como a largura da cabeça, comprimento do olho e diâmetros de lente ocellar. Imagem SEM também dá visão detalhada de imagens, mas além disso permite a aquisição de imagens de alta resolução e alta ampliação. Determinadas regiões de interesse nos olhos podem ser examinadas em detalhes e variações em forma de lente podem ser identificado (Figura 2). SEM imagens são especialmente úteis para a resolução de formigas com pequenos olhos e ocelos. As réplicas de córnea fornecem informações sobre a forma, tamanho e número de lentes em cada olho (Figura 3). Seções finas semi fotografadas usando técnicas de LM permitem investigação da anatomia interna bruta do olho (Figura 4 e Figura 5); Isso inclui a espessura da lente, diâmetro do cone cristalino, presença de um trato de cone cristalino, forma, largura e comprimento do rhabdom, mapeando a área de borda dorsal e localização das células de pigmento primárias e secundárias. Esta técnica pode ser muito bem complementada por seções ultra-finas fotografadas usando TEM, que permite determinar a ultraestrutura, especialmente, a orientação microvillar (Figura 4) e a quantificação dos menores estruturas (por exemplo, largura de o cone cristalino constringido tracto, Figura 5).
Figura 1: Fotomicrografias de Z-pilha das três castas da formiga açúcar australiana, Camponotus consobrinus. Isto fornece uma visão geral do layout do sistema visual em todas as três castas. Adaptado da referência20. Barra de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Scanning electron micrografias do sistema visual formiga demonstrando os recursos de imagem desta técnica. Linha superior mostra o olho de diferentes posições e tamanhos de olho em: (A) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; e (C) Amblyopone australis (Observe a seta de olhos muito pequenos, branco). Imagens adquiridas em alta ampliação mostrando: (D) os três olhos simples em trabalhadores de Myrmecia nigriceps; diferentes tamanho olho composto em (E) Rhytidoponera metallica (nota a diferente forma de omatídeos em diferentes regiões do olho composto em amarelo), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkie (eu) Pheidole espécies. Barras de escala = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: réplicas de córnea do olho de formiga e ocelos. (A) réplica do olho composto de um trabalhador de Myrmecia nigriceps. A réplica convexa foi assolada por fazer incisões. O baixo-relevo indica posterior (p), anterior (a) e dorsal (d), eixos ventral (v). (B) réplica as ocelos de trabalhador do Myrmecia tarsata. Escala de barras = 0,5 mm (A), (B) de 10 µm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: LM e EM imagens de secções transversais rhabdom. Secção transversal (A) de rhabdoms distais em Myrmecia nigriceps manchado em toluidina azul pode ser usado para distinguir os rhabdoms que estão em forma retangular ou circular. Show de elétron-micrografias de transmissão: (B) várias orientações de microvilli na rhabdom circular e (C) microvilli orientada em duas direções opostas no rhabdom em forma retangular. (D) usando microscopia de luz, do eixo dos rhabdoms retangulares são mapeados para mostrar uma fã como organização na região dorsal do olho em uma rainha de Camponotus consobrinus; baixo-relevo indica posterior (p), anterior (a) e lateral (l), eixos medial (m). Painel D adaptado de referência20. Barras de escala = 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: LM e EM imagens de um ommatidium em um olho de luz-adaptado de Myrmecia tarsata. (A) seção Longitudinal de um omatídeo mostrando a córnea (C), cone cristalino (CC), trato de cone (ct), rhabdom (Rh) e primária (PPC) de células de pigmento. (B) tracejado retangular caixa no painel A partir de uma seção diferente visto sob uma temperatura de quantificar a largura estreita do tracto de cone. Adaptado da referência21. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: problemas comuns com seções semi finas e ultrafinos (fixação e infiltração, corte e coloração). (A) pobre fixação do tecido devido à penetração inadequada (seta) em uma seção de semi fina de Pheidole espécies; (B) rasgando durante o corte em Iridomyrmex calvus (semi fina); (C) perfeita coloração (à esquerda) e sobre a mancha (à direita) com toluidina azul em Myrmecia croslandi; (D) pigmento (círculo) e o tecido rasgar durante o corte (setas) devido à pobre correspondentes da densidade do tecido e resina (resina muito mole). Dobradura da seção (asteriscos), pode acontecer quando recolher seções de barco a faca; (E) pobres contrastam devido à coloração insuficiente (compare a margem interna), cristais de citrato de chumbo (setas brancas) da exposição ao CO2e faca vertical marcam (setas pretas); (F) furos no tecido (setas brancas) causada pela fixação pobre em um olho composto de Melophorus hirsutus ; (G) resina muito mole, leva a chitter quando corte visto como ondulações verticais na seção; Secção (H) muito espessa (~ 100 nm) resultou na imagem escura com contraste pobre, água destilada contaminada chumbo para bactérias e partículas espalhados a seção (setas brancas) em Pheidole espécies. Barra de escala = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O conjunto de métodos indicados acima permitem uma investigação eficaz sobre o sistema óptico de formigas e outros insetos. Estas técnicas informam nossa compreensão da resolução de amostragem, sensibilidade óptica e potencial sensibilidade de polarização do olho a ser estudado. Esse conhecimento fornece uma base importante para a investigação fisiológica e comportamental em suas capacidades visuais. Além disso, enquanto os métodos detalhados aqui concentraram-se em sistemas visuais de formiga, estas técnicas podem ser usadas em outros insetos, embora com pequenas modificações no protocolo (por exemplo, aumentando a duração da fixação e infiltração nos tecidos mais grossos) . Ligeiramente modificados protocolos têm sido utilizados para caracterizar os sistemas visuais de uma variedade de insetos, incluindo cigarras22, moscas14, abelhas23, vespas24, borboletas25e traça26. Embora a maioria das técnicas descritas aqui estiveram no uso por algum tempo, este artigo aproveita a oportunidade para uni-los no contexto do sistema óptico da formiga a estudar e comparar técnicas alternativas e descrever as armadilhas comuns.
Existem muitas técnicas de imagem atualmente disponíveis que possuem sobreposição de aplicações e pode ser difícil avaliar qual técnica é adequada para a tarefa em mãos. Um exemplo relevante aqui é escolher uma técnica para a imagem latente de visão geral. A morfologia externa da cabeça e do olho e posicionamento relativo do sistema óptico na cabeça podem ser feitos usando SEM ou Fotomicrografia. Os pontos fortes e fracos destas técnicas foram analisados27, no entanto, existem algumas considerações especiais quando os olhos de imagem. Quando a imagem o posicionamento relativo e o tamanho dos olhos, ambas as técnicas têm suas vantagens e desvantagens. Imagens SEM faltam de informação de cor e, portanto, onde a pigmentação é relevante Fotomicrografia é melhor. No entanto, SEM imagens podem ilustrar belas estruturas como pelos incluem inter e limites de faceta em maior detalhe e até mesmo revelar características de superfície não visíveis sob técnicas fotomicrografia (por exemplo, lentes ocellar, superfície de escultura de lentes de olho composto). SEM é uma técnica versátil quando se trata de imagem exploratória e identificação de características de interesse porque ele pode operar em uma ampla gama de tamanhos de amostra, mantendo ainda uma resolução muito alta em toda esta gama. No entanto, isso não é tão amplamente acessível por meio de um microscópio de dissecação e exige um maior nível de especialização. Muitas vezes não há nenhuma maneira simples de obter as informações que necessita de um. Em tal cenário, é útil considerar o que está disponível e onde é mais importante investir recursos.
Esmaltes réplicas da córnea provaram para ser mais útil na obtenção da medida mais exata de números de faceta e diâmetros de faceta. Isto agora tem sido usado em uma variedade de insetos11,22,28,29. Enquanto a qualidade das imagens adquiridas de uma SEM é muito superior, a curvatura do olho impede que as medidas exatas da matriz toda faceta. Mapeando a faceta tamanho e distribuição de faceta também deve ser viável de scans adquiridas da micro tomografia computadorizada-5.
Em ambos os LM e TEM técnicas, muitas vezes é difícil saber se a amostra foi preparada e processada bem até a fase final da imagem. Para evitar complicações, é importante estabelecer boas práticas como manter limpa a trabalhar espaços e ferramentas, regularmente, a preparar soluções novas e completamente filtragem de água. Contaminantes que são invisíveis a olho nu podem arruinar as amostras EM. Por esta razão, pode ser útil limpar as superfícies e instrumentos usando um solvente, tais como etanol ou acetona e uma limpeza de produção não-lint. Isso é mais relevante quando seccionamento, coloração de seções do EM e quando preparar amostras SEM. Da mesma forma, fontes de água destilada podem apresentar problemas e introduzir contaminantes, por isso é sempre melhor verificar os filtros, mudá-los regularmente e sempre use água fresca filtrada (não guarde). A maioria dos fixadores, manchas e incorporação de materiais não podem ser armazenados indefinidamente, e é importante rotular todas as soluções com a data de preparação. É importante ter uma abordagem sistemática e Reserve tempo suficiente para realizar protocolos sem interrupções.
Adaptar técnicas de diferentes espécies é sempre uma questão de tentativa e erro. Ao trabalhar no Formicidae, as principais diferenças residem no tamanho do animal e a massa muscular dentro da cabeça. Formigas com mais musculatura em sua cabeça normalmente levará mais tempo para consertar. Com formigas muito grandes, é melhor remover os músculos mandibulares, traqueia e glândulas mandibulares, garantindo o mínimo de interferência com o tecido neural. Em pequenas formigas e aqueles com poucos músculos mandibulares, é possível alcançar a fixação adequada apenas removendo as mandíbulas e expor a região clípeo. Nestes casos, pequenos furos com pinos de minúcias podem ser feitos na cabeça para melhorar a fixação.
É importante observar que as condições ambientais também podem afetar os preparativos. Ambientes quentes e úmidos (especialmente estações de campo nos trópicos) podem provar para ser um desafio durante a fase de infiltração. Condições quentes podem levar resinas para polimerizar parcialmente prematuramente, resultando na resina não utilizada tornando-se cada vez mais viscoso. Neste caso, a melhor opção é armazenar a resina em pequeno de uso único, recipientes no frigorífico ou no congelador. Fixadores de resfriamento pode ser útil para mais rápida decomposição de tecido contador em condições quentes. No entanto, soluções de refrigeração irão dispersar mais lentamente o que significa que tempos de tratamento devem ser alargados para assegurar uma penetração adequada.
Com estas precauções na mente, investigação sobre o sistema óptico de formigas e outros insetos pode provar muito gratificante. Estudar o sistema visual permite estimar o tamanho dos campos visuais, interommatidial ângulos, sensibilidade óptica e resoluções de amostragem. Compreender a anatomia do olho informa nossa compreensão e interpretação do comportamento animal. Por exemplo, anatomia nos permite fazer previsões sobre os recursos visuais de animais como se eles são diurnas ou noturnas, que podem não ter sido anteriormente documentados. Tendo em conta o conhecimento atual sobre o sistema visual de punhado de formigas, esperamos que nossos métodos inspirará os biólogos e mirmecólogos para investigar o olho composto e ocelos nas formigas para aprofundar nossa compreensão.
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Disclosures
Os autores declaram não interesses concorrentes.
Acknowledgments
Estamos gratos a Jochen Zeil, Paul Cooper e Birgit Greiner por compartilhar seus conhecimentos em anatomia de insetos e para várias das técnicas demonstrando descrevemos aqui. Estamos gratos aos funcionários talentosos e apoio do centro de microscopia avançada no ANU e a unidade de microscopia em MQU. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-graduação para FRE e subsídios do Conselho australiano de pesquisa (DE120100019, FT140100221, DP150101172).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
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