Summary
Bu makalede a maiyet-in ışık ve elektron mikroskobu böceklerin iç ve dış göz anatomisi çalışma teknikleri özetlenmektedir. Bunlar karınca gözler, ayrıntılı sorun giderme ve optimizasyon farklı örnekler ve bölgelerinin ilgi için öneriler çalışmaları için en iyi duruma getirilmiş çeşitli geleneksel teknikler içerir.
Abstract
Bu makalede a maiyet-in ışık mikroskobu (LM) teknikleri özetliyor ve elektron mikroskobu (EM) böceklerin iç ve dış göz anatomisi çalışma için kullanılabilir. Bunlar karınca gözleri üzerinde çalışmak için optimize edilmiş ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve tarama elektron mikroskobu (SEM) gibi diğer teknikleri ile konserde çalışmaya adapte geleneksel histolojik teknikler içerir. Bu makaledeki sorun giderme ve optimizasyonu farklı numuneler için büyük önem yerleştirildi bu teknikleri, büyük ölçüde yararlı olsa da, acemi microscopist için zor olabilir. Biz bilgi görüntüleme teknikleri tüm numune için (fotoğraf-mikroskobu ve SEM) ve avantaj ve dezavantajları tartışıyorlar. Biz tüm göz için objektif çapı belirlemede kullanılan teknik vurgulayın ve yeni teknikler geliştirilmesi için tartışmak. Son olarak, LM ve TEM, örnekleri hazırlanmasında tekniklerin tartışmak kesit, boyama ve bu örnekler görüntüleme. Biz bir otelde hazırlama örnekleri arasında ve en iyi nasıl etrafında gezinmek gelebilir Engelli tartışıyorlar.
Introduction
En hayvanlar için önemli bir duyu modalite vizyonudur. Vizyon çok saptayarak hedefleri oluşturma ve yolları kalarak ve pusula bilgi1,2elde etmek için navigasyon bağlamda özellikle önemlidir. Böcekler bileşik gözler bir çift kullanarak görsel bilgileri algılayabilir ve bazı durumlarda, bir ila üç dorsally yerleştirilen basit gözleri ocelli3,4,5denir.
Karıncalar harika farklı olmakla birlikte, türler arasında bazı anahtar özellikleri korumak çünkü karıncalar gözünde özel ilgi vardır. Dramatik değişim anatomi, boyutu ve ekoloji rağmen türlerin büyük çoğunluğu eusocial olan ve koloniler halinde yaşıyorlar; Sonuç olarak, farklı türler açısından ileri geri merkezi bir yer ve kaynakları arasında gezinme benzer görsel sorunlarla karşı karşıya. Karıncalar arasında aynı temel göz bauplan vücut uzunluğu, kesinlikle gece türler için sadece gündüz ve yavaş görsel yırtıcı6,7sıçramak için yeraltı yürüyüş 0,5-26 mm arasında değişen hayvanlarda görülebilir, 8,9,10. Tüm bu şaşırtıcı farklılıkların ekoloji ve davranış farklı ortamlar, yaşam tarzı ve vücut-boyutları11,12uygun olarak aynı temel göz yapıları sayısız permütasyon neden olmaktadır. Sonuç olarak, görsel ekoloji karıncalar eğitim olanakları kararlı araştırmacı için gerçek bir hazine sağlar.
Böceklerin görsel sistemini anlama davranış yeteneklerini içine bir anlayış kazanıyor esastır. Bu güzel ekoloji ve davranış için birkaç böcek grupları (örneğin, başvurular13,14,15,16, büyük bir başarı ile anatomi birleştirmek bütünleştirici çalışmalar belirgindir 17). ant gezinti ve karınca davranış alanında genel olarak oldukça başarılı olmuştur rağmen çok az vurgu karınca vizyon birkaç seçili türler dışında üzerine yerleştirildi. Burada, biz göz tasarım karıncalar soruşturma tekniklerin üzerinde ayrıntılı. Biz karıncalar üzerinde durulacak iken, bu teknikler, diğer böcekler için hafif değişiklikler ile de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. numune hazırlama
Not: İlk bileşik göz ve ocelli birbirlerine ve kafasına göre konumunu anlamak gereklidir. Bu görüntüleri baş dorsal görünümünün elde etme tarafından sağlanabilir. Bu için işleme örnekleri için photomicrography veya SEM teknikleri kullanarak önerilir. Aşağıda adımları her iki süreç söz konusu.
-
Numune toplama
- Toplar ve örnekler doğrudan % 70 etanol saklarız. Farklı castes mümkün olduğunca toplamak.
- Saat, Tarih, ile numune etiket ve herhangi bir diğer ilgili gözlemler (yiyecek arama sırasında toplananörneğin, toplama, çiftleşme yuva içinde bir dal, vs) yanı sıra yer
- Birden çok çoğaltır her tedavi için yeterli örnekler toplamak.
-
Photomicrography ve Z-istifleme
- Hava Kuru numuneler ve üçgen noktası kartları, suda eriyen yapıştırıcı, kullanma ve daha sonra böcek bir PIN mount. Ayrıntılı bilgi için başvuru18' e bakın.
- Bir Z-step motor ve bir renk kamera ile yüksek büyütme stereomicroscope kullanarak görüntü.
- Numuneler için tek tip aydınlatma için bir difüzör kullanın.
- Farklı odak uçaklar görüntüleri yakalamak ve görüntüleri kaydetmek bir kayıpsız dosya biçimi (TIFF gibi) ve odak yığın onları piyasada bulunan yazılım kullanarak.
-
Tarama elektron Filmler
Not: Tüm araçlar ve numune ile toz ve diğer parçacıklar kirlenmesini önlemek için etanol ile çalışan yüzeyler iyice temizleyin.- Numuneler etanol içinde gecede kurutmak ve bir kabında kuru hava.
- Keskin bir ustura vücudun kalanı kafasına ayırmak için kullanın.
- Gerekli izleme açısı (örneğin, yukarı dönük olacak şekilde dorsal) başında mount iletken karbon teyp veya sekmeleri kullanarak alüminyum taslakları üzerinde. Karbon teyp ince şeritler halinde kesin ve baş kapsül destekleyecek şekilde katlayın.
- Altın 20 2 min için numune yüzeyinin uygulamak için bir sputter coater kullanın mA döner bir sahne ile. Zaman ve geçerli araç bağlı olarak ayarlanması gerekebilir.
- Numuneler taze karbon teyp veya sekmeler ile yeni bir alüminyum saplama aktarın.
Not: Kaplamasız karbon siyah bir arka plan sağlar ancak numune aktarma altın kaplama zarar verebilir. - Numune yönlendirme diseksiyon mikroskop kullanarak hala doğru olup olmadığını denetleyin ve iyi forseps veya benzer bir araç bir çift ile gerektiği gibi ayarlayın. Altın kaplama çizmemeye değil dikkat çekmek; tanıtıcı mümkün olduğu kadar az.
- Numuneler taslakları ve numuneler birbirlerine konumunu notu oluşturma SEM saplama tutucu üzerine yükleyin.
Not: Bazı SEM'ler aşamalı kamera ile donatılmıştır ama çok değildir ve yüksek büyütme oranında küçük örnekler bulmak zor olabilir. - Örnek resim. Alçak hızlanan gerilim şarj ve iyi alan derinliği için küçük bir diyafram önlemek için kullanın.
Not: Ayarları en iyi bir teknisyen danışarak getirilmiş kullanılan belirli araç uzmanlaşmıştır.
2. sayısal model numaraları ve çapları
-
Kornea yinelemeler
- Etanol içinde korunmuş veya bu amaçla (Adım 1.1.1) bir pin üzerinde monte karıncalar kullanın.
- Hayvan böcek bir PIN veya hamuru monte. Baş nispeten büyük ise, kalan vücut parçaları-ebilmek var olmak çıkarmak.
- Hızlı kuruyan renksiz oje küçük bir damla kadar almak ve hızlı bir şekilde göz üzerinde yayılmış bir böcek PIN veya iyi bir kürdan kullanın. PIN gözü kaşı değil emin olun. Tırnak cilası tüm göz ve bazı çevre baş kapsül kapsamalıdır.
Not: Tırnak cilası göz arasında nispeten Tekdüzen kalınlığı olması önemlidir. - Oje oda sıcaklığında ayarlamak için bırakın.
- Tam olarak ayarlandıktan sonra iyi bir böcek PIN hafifçe göz çevresindeki baş kapsül çoğaltma kaldırmak için kullanın.
- Temiz forseps güzel bir ikili yinelemeyi Kaldır, kafa ve göz kapakları yineleme parçası kavramak için kullanın.
- Göz yönünü bilincini olun: ön, arka, dorsal ve ventral bölge.
- Yineleme bir cam slayt üzerinde yerleştirin. Dikkatle göz çevresinde kalan fazladan malzemeleri kaldırarak yineleme kırpmaya jilet kullanın. Bir iğne veya forseps çifti çoğaltma hareket etmesini engellemek için kullanın.
- Göz çok dışbükey ise 3-4 iyi kısmi Radyal insizyon kenarına 'yineleme Düzleştir' yardımcı olmak için etrafında olmak için bir jilet kullanın. Göz görece 'düz' ise, böyle insizyon yapmaya gerek yoktur.
- Bir kapak notu yavaşça göz yineleme yineleme yönünü bilinir sağlanması üzerinde yerleştirin. Bu tırnak cilası olarak kornea izlenimini ortadan kaldırabilir gibi basınç uygulamayın.
- Çok az oje dört köşelerinde kullanarak coverslip kapatın. Eğer kapak notu ve cam slaytlar arasında tırnak cilası akar, yineleme zarar verir.
- Bileşik mikroskop slaytta görüntü.
Not: Eğer sadece odakta bazı yönü vardır, o zaman bu göz yineleme yeterli düzleştirilir değil göstermektedir. Atın ve tekrar başlamak--dan adım 2.1.3. - Görüntü ImageJ/Fiji nerede ommatidia sayısını ve boyutunu her ommatidia ölçülebilir gibi serbestçe kullanılabilir programlar alın.
Not: Bu yöntem çok ocelli, kopyaları hazırlamak için kullanılabilir. Ondan beri onun tek bir lens, tüm ocelli birlikte bir yinelemede tutmanız önerilir.
3. göz yapısı analiz
Not: çoğu durumlarda iki tamamlayıcı teknik LM ve TEM göz anatomisi çalışma gerektirir. İlk işlem aşamaları LM ve TEM için benzer teknikler gerektirir. Fark parça Sahne Alanı'ndan itibaren ortaya çıkar. İşleme örnekleri dikkatli ve sorumlu kişiler tarafından atılan tehlikeli kimyasalların kullanımı gerektirir. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı, bir duman mahallede çalışmak, her zaman Emanet veri sheets(SDS) okumak ve risk değerlendirmeleri başlamadan önce taşırlar.
- Diseksiyon
- Numuneler soğutma veya gaz halinde olan yakıtlar CO2maruz uyuşturan.
- CO2 anestezi çok (genellikle küçük 1dk) hızlı ve bu örnek ölümle sonuçlanabilir dozun önlemek için dikkat edilmelidir kaldı. Bu soğuk burns neden olabilir gibi kuru buz parçacıkları (solid CO2) kullanarak numuneler ile doğrudan temas kaçının.
- Soğuk anestezi yavaştır; 4 ° C yeterli ve daha soğuk sıcaklıklarda tavsiye edilmez. Bu tür için uygun bir soğutma zaman kurmak. Boğa karıncalar gibi büyük veya soğuk dayanıklı karıncalar gerektirebilir > küçük tür sadece 1-2 dk. aşırı ısınma gerekebilir iken tam immobilize olmak için 10 dk numune öldürecek (buz ile doğrudan temas önlemek). Numuneler tercihen küçük, köpük stoppered, plastik kaplarda yapılacak ve nerede onlar görülebilir bir buzdolabı yerine bir elektrikli buzdolabı ya da derin dondurucu yerleştirilir.
- Örnek bir Petri kabına yerleştirin ve diseksiyon mikroskop altında görüntülemek için ayarlayın. Hızla çalışmaya, anestezi korumak için ve insizyon (saniye içinde oldu bu can) yapıldıktan sonra doku dejenerasyonu önlemek için önemlidir.
- Anten Forseps ile kaldırın. Eğer bir batma böcek ile çalışma, ilk stung önlemek için gaster kesmek için tavsiye edilir.
- Keskin jilet kullanarak ağız parçaları kaldırın; Forseps örnek tutmak için kullanılabilir. Bu beyin çekiştirmeye olmadan (küçük örnekler) mümkün olduğunca gözleri retina gözyaşı göz (büyük örnekler) veya olarak kapatmak için ön parçası kesti.
- Baş kapsül açmaya hazırlanın. Böylece ilk kesi yukarıyı numune açı; Bu ya diseksiyon mikroskop altında örnek forseps veya görsel denetim altında numune başparmak ve ön parmak arasında tutarken tutarken gerçekleştirilebilir.
- Baş ventral kısmını kaldırmak için kafasından enine bir kesi yapmak; ventral göz parçası büyük tür fiksasyon ve infiltrasyon geliştirmek için kaldırılmış olabilir. Kafa hala vücuda bu noktada eklenmelidir.
- Vücuttan kafa kapsül bileşik göz sadece arka koronal bir kesi yaparak sever.
- Bileşik Gözler ile disseke baş kapsül buz soğuk sabitleştirici yerleştirin: %2.5 oxazolidin ve % 2 paraformaldehyde fosfat tampon (pH 7.2-7,5).
Dikkat: Sabitleştirici aşındırıcı ve zehirli olduğunu; uygun koruma giymek ve duman mahallede çalışma.
Not: Hızlı bir şekilde sinir dokusu dejenerasyon tutuklamak için çalışmak önemlidir. Diseksiyon 2 dk içinde tamamlanmış veya daha az olmalıdır (verimli diseksiyon biraz pratik gerektirebilir).
Not: gözün parlak ya da ölü şartlarına adapte gerekiyorsa, ilk bir kaç saat için gerekli ışık durumuna hayvanlar sunarsınız. Gruptakiler, anılan sıraya göre ışık koşullarında yerine getirir. Gruptakiler kırmızı ışıklar altında karanlık simüle etmek için yürütülen olabilir.
- Numuneler soğutma veya gaz halinde olan yakıtlar CO2maruz uyuşturan.
- Numune işleme
- 2 h. büyük örnekler uzun fiksasyon kez gerektirebilir için numuneler sabitleştirici bir orbital Çalkalayıcı, hareket ile oda sıcaklığında tutmak.
- Sabitleştirici kaldırın ve uygun şekilde atın. İçinde oda sıcaklığında fosfat tampon (3 kez, 5 dk her) numuneler üzerinde shaker yıkayın.
Not: Fosfat tampon 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4ve 0,244 g KH2PO4 ' te 1 litre saf H2O (pH 7.2) oluşur. - Fosfat tampon kaldırın ve % 2 ekleyin OsO4. Duman başlıklı shaker 1-2 h için numune kavanoz yerleştirin. Bu yağlar düzeltmek ve ayrıca TEM için kontrast sağlamak için bir sonrası fiksasyon adımdır.
Not: Numune boyutu tabi Osmiyum fiksasyon zamanlardır; bir kaba kural olarak, fiksasyon 1 mm3başına 1 h hesaplayın. - Osmiyum çözüm kaldırın ve uygun şekilde bertaraf. Oda sıcaklığında arabelleği (3 kez, 5 dk her) örnekler üzerinde shaker yıkayın.
- Numuneler etanol veya aseton konsantrasyonları artan yerleştirerek kurutmak; Örneğin, 50, 70, 80 ve 10 min için % 95'i ve son olarak % 100 (2 kez, 15 dk her). Numuneler shaker çözüm değişiklikler arasında yerleştirin.
Not: gerekirse, örneklerin % 70 etanol gecede depolanabilir. - Etanol drenaj ve % 100 aseton ekleyin. Shaker (Bu adım aseton içinde dehydrating Eğer atlama) için 20 dakika bırakın. Taze aseton ile değiştirin ve bir ek 20 dk için bırakın.
- Reçine için aseton aşağıdaki oranları kullanarak reçine ile belgili tanımlık doku sızmak: 2:1 (3 h), 1:1 (gece), 1:2 (4 h) ve saf reçine (gece). Her adımda numuneler shaker içinde duman başlık çıkarma ve kapsayıcı için son iki adımı dışındaki tüm kap.
Not: Reçine numuneler her adımda yeni bir tek kullanımlık kap taşınması gerekir bu yüzden drene çok yapışkan. - Blok örnekleri bağlamaya hazır olun. Bloklar özel kesim akrilik cam tarafından küçük dikdörtgen bloklar (1.5 x 0.5 x 0,3 cm) yapılmış olabilir. Blokları da (orada birçok ticari kitleri kullanılabilir) dökme epoksi reçine ile bir silikon kalıp içine yapılabilir ve sonra 12-14 h 60 ° C'de fırında tedavi
Dikkat: İyileşmemiş (sıvı) reçine kanserojen ve tamamen sertleştirilmiş kadar fırın için döndürülmelidir. - Blok kalıp içinde dikey olarak yerleştirin. Dikkatle sıvı reçine gelen numuneler alın, boşaltmak aşırı reçine izin ve numune blok üstüne yerleştirin. Ek reçine az miktarda numune için blok bağlamak için kullanılabilir.
- Blok etiketi. Kağıt etiketleri yazdırmak ve blok içinde katıştırabilir veya bir blok yüz ekleyin.
- 60 ° C'de 12-14 h fırında katıştırılmış bloklarla kalıp tutmak
- Numune blok temiz bir zarf içinde saklayın. Bu yıl için birkaç ay içinde bu şekilde saklanabilir.
- Kullanılan konteyner, kirli eldiven ve kontamine diğer ekipman aseton tamamen buharlaşmasına izin vermek için duman mahallede bırakın (en az 12 h).
- Tek kullanımlık ekipman atarak veya reçine forseps gibi diğer öğeler kapalı kazıma önce fırında reçine tedavi.
- Kesit
- Numune oryantasyon parça uçak için uygun olduğundan emin olmak için diseksiyon mikroskop altında blok gözlemlemek.
- Yönlendirmeyi uygun değilse, bir kuyumcu 's gördüm Numune kesme ve örnek yeniden oturtmak için set reçine ve taze reçine parçaları kullanarak yeniden yönlendirmek için kullanın. Başından iki yarısını iki gözü ayrı ayrı bölüm bölünebilir. Devam etmeden önce reçine tedavi.
- Blok çıkarılabilir microtome chuck bağlayın. Chuck kaldırmak ve yer tutucu üzerinde.
- Diseksiyon mikroskop altında bir tıraş bıçağı kullanarak reçine blok döşeme.
Dikkat: kol sarsıntı olarak yatakları zarar chuck microtome kol üzerinde monte edilmiş durumdayken bunu yapmayın. - Chuck microtome kol üzerine yeniden bağlayın ve numune açı.
- Uygun açıda tutucu üzerinde bıçak monte (cam bıçak, 0° elmas bıçak için üreticisinin yönergelerine bakın).
Not: Cam bıçak cam bıçak maker ile rezervasyon yaptırın yapılabilir ama onlar onların kenar kaybetmek gibi periyodik olarak değiştirilmesi gerekir; yüksek kaliteli elmas bıçak satın alınabilir ama pahalı, özel bir dikkat gerektirir ve yeni başlayanlar için uygun değildir. - Bıçak tekne (0,45 µm gözenek boyutu) filtre ile donatılmış bir Ģırınga kullanarak distile su ile doldurun.
- Su seviyesi bıçak kenarı ulaşıncaya kadar tekne doldurmak; Menisküs teknenin diğer alanlarında dışbükey olabilir.
- Menisküs çok hafif içbükey ama hala bıçak kenarına ulaşır kadar tekneyi boşaltmak. Herhangi bir noktada ama her zaman bıçak kenarı uzağa su seviyesi ayarlanabilir.
- Dikkatle örnek doğru bıçak getirin ve bıçağı bloğuna hizalayın. Bu en iyi bıçak mercek ve yan yakınlığı yavaş yavaş, düzenli aralıklarla kontrol yapılır.
Not: kontrol aletleri değişir gibi özel yönergeler için araç el kitabı. - Bölüm kalınlığı microtome ayarlayın. Doğru kalınlığı seçerek örnek boyutu, bölge ilgi ve kullanılan bıçak tür bağlı olacaktır.
- Malzemenin çok uzakta ilgi alanı ulaşmadan önce kesmek gerekir Eğer bir cam bıçak kullanarak (örneğin, 4 µm), daha yüksek bir ayar seçerseniz. Bir elmas bıçak kullanılmışsa veya örnek çok küçük ise, 1-2 µm daha uygun olabilir.
- "(Microtome tekerlek cranking) kesme" bıçak yakın olduğunda ancak henüz yaklaşım son bölümünü gerçekleştirmek için Numune kesme değil başlamak. Bölümler içinde birkaç rotasyonlar görünen başlayacaktır; Eğer değilse, durdurmak ve çok dikkatli bir şekilde bıçak biraz yaklaştırır.
- Kalınlık (yarı ince kesitler için 1 µm) ne zaman toplama bölümü ayarlamak bölgenin ilgi yaklaşıyor.
- Bir kirpik aracını kullanarak herhangi bir bölümü toplamak.
Not: Tırnak cilası ile ince bir sopa üzerine monte edilmiş bir kirpik kirpik araçlar yapılabilir. - Maddi bir sürü kaldırılmalıdır birikir ve topluca bıçağı çıkarıp su ile fışkırma çıkarmak için bölümleri izin vermesi. Bir cam bıçak kullanarak, bu bıçak taze bir bölümünü veya yeni bir bıçak değiştirmek için uygun bir zaman olabilir.
- Yer bir dizi küçük bir Pasteur pipet veya ideal olarak, filtre kullanarak slayt üzerindeki distile su damlacıkları şırınga donatılmıştır.
- Dikkatlice kirpik su damlacığı üzerine toplanan bölümüne kaydırın.
- Kesit derinliği kontrol etmek uygun olana bu gibi bölümler toplamak.
Not: her ne kadar sıkıcı olabilir, her zaman sık sık kontrol etmek en iyisi. - Slayt 60 ° C'ye ayarla bir ocağın üzerine yerleştirin Tüm su buharlaşır ve slayt için uygun bölüm sağlar.
- Boya toluidin bölümlerle 10-60 s için mavi (zaman boyama değişir bölüm kalınlığı ile). Boya (yukarıdaki gibi) bir filtre ile donatılmış bir şırınga dağıtmak.
- Slaydı bir ucunda bir damla boya yerleştirin ve iğne tarafında dokunmadan veya bölümleri kazıma kullanarak yayıldı. Slayt aspiratör için yaklaşık 10-20'lerin üzerinde bir yer.
- Yıkama şişe içinde distile su ile püskürtülerek sürgüyü durulama ve bu kuru sıcak tabağa yerleştirin.
- Bileşik mikroskop altında kontrol edin ve onları görüntü.
- Bölge ilgi ulaşılana kadar yineleyin.
- Ultra-ince kesitler için: TEM bölümlerde toplamak için 40-60 nm arasında kesme kalınlığı ayarla.
- Kesme hakkında 3-5 bölüm ve bir girişim renk tablosu kullanarak onay kalınlığı. Bölümler bir açıyla izlendiğinde açık gri yansıtmalıdır.
Not: Kloroform duman bölümleri üzerinde herhangi bir kırışıklıklar rahatlamaya pipetted. Bu deneyimli kullanıcılara en alakalı ve yeni başlayanlar değil endişe gerek. Çok fazla kloroform çok yakın bölümüne serbest bölümler zarar verebilir. - Forseps Formvar tarafı ile düzenlenen bir Formvar kaplı, bakır, slot kılavuz almak. Formvar kaplama delmek değil dikkatli olun.
- Kılavuz edgeways tekne içine daldırma ve uzak bölümleri, sonra yüzeye paralel ızgarası öğesinin altındaki bölümlerde getir.. Gerekirse kirpik bölümleri kılavuz üzerinde yol göstermesi için kullanın.
- Silah arasında sıkışıp su kadar emmek için filtre kağıdı ile forseps ucu etrafında dikkatlice kurulamak. Eğer bu yapılmazsa, su gerginlik kılavuz kolları arasında yukarı çekin veya bir yana durdurabilmek. Bu kirlenme veya mekanik hasar ile sonuçlanabilir.
- Dikkatli bir şekilde fazla suyu ızgara edgeways filtre kağıdı üzerine beklemede kılavuzundan kaldırın.
- Bir kılavuz tutucu kılavuzunda bir yer.
- Yeterli bölümleri toplayana kadar yineleyin.
- Yarı ince kesitler bir fotoğraf makinesi ile donatılmış herhangi bir bileşik mikroskop ile doğrudan yansıması. Daldırma yağ doğrudan bölümler yerleştirilebilir. Slaytları bir slayt kutusunda renk değişimi önlemek için saklanmalıdır.
- TEM kontrast için ultra-ince bölümüne boyama
Not: boyalar ışık ve CO2 hassas olarak aşağıdaki adımları örtü altında yapılmalıdır. Ayrıca, EM boyalar ağır metaller kontrast üretmek için kullanır ve bu nedenle tehlikeli maddeler. Bu lekeler işlerken uygun bakım alınması gerekir.- Birkaç büyük Petri yemekler ışık engellemek için alüminyum folyo ile kapak. Bunlar aşağıdaki adımları için altında çalışır. Kısmen çalışma alanı izin ama kapakları geri en kısa zamanda yerleştirmek için onları ortaya çıkarmak.
- Balmumu film bir parça keser ve dikkatle beş %6 doymuş uranyl asetat damlacıkları üzerinde Pasteur pipet kullanarak yerleştirir.
- Çözüm hazırlamak için 2 g uranyl asetat distile su 100 mL % 50 metanol ile karıştırın ve kullanmadan önce çözüm filtre. Çözüm depolanamaz ve her saat19taze yapılmalıdır.
- Dikkatle forseps ve denge üzerine boya damlacıkları bölüm yüzü TEM Izgaralar seç. 25 dk için bırakın.
- Izgaralar tek tek onları distile su içinde ve dışında hızla daldırma durulayın; dört farklı şişeleri distile su yoluyla ilerleme.
- Beş kurşun sitrat damlacıkları film taze bir parça üzerine yerleştirin. Boya damlacıkları çevresinde birkaç NaOH Pelet düzenlemek (Bu kurşun karbonat yağış önlemek için atmosferik CO2 emer).
- Kurşun nitrat çözümü sağlamak için bi distile su kaynar distile su ile 0,5 h. izin ver su serin ve yapışmalı bir kap içinde 0.3 g kurşun sitrat bi distile su 100 mL için eklemek için hazır olun. 1 mL 10 M ekleyin NaOH, sıkı konteyner mühür ve çözünmüş19kadar çalkalanır.
- Izgaralar üzerinde boya damla 4.3 ve kapak bölümünde açıklandığı gibi yere. Leke 5 min için.
- Önce distile suda 20 kez distile su içinde ve dışında Izgaralar daldırma durulayın. Distile su üç gemi yoluyla ilerleme.
- Filtre kağıdı ile aşırı su kadar emmek ve Izgaralar bir kılavuz çizgileri kutusunda kurumasını sağlar.
- TEM alçak hızlanan gerilim, görüntüde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yöntem tanımlamak burada detaylı çalışmanın basit ve bileşik gözler karıncalar etkinleştirin. Z-yığın photomicrography teknikleri kullanarak baş sırt görünümünü görüntüleme bir görsel sistemi (şekil 1) düzeninin özetini elde etmek izin verir. Bu gruptakiler için ve gerekli parça açısını belirlemek için iyi bir hazırlık var. Bu teknik de kafa genişliği, göz uzunluğu ve ocellar objektif çapı gibi ölçümleri alarak yararlıdır. SEM görüntüleme ayrıca ayrıntılı genel bakış görüntüler verir ama Ayrıca yüksek büyütme ve yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar. Gözde ilgi belirli bölgeler ayrıntılı olarak incelenmiştir ve varyasyonları mercek şeklinde olabilir (Şekil 2) tespit. SEM görüntüleri karıncalar küçük gözleri ve ocelli çözmek için özellikle yararlı olur. Kornea yinelemeler şekli, boyutu ve sayısı her göz (şekil 3) lensler hakkında bilgi vermek. LM teknikleri kullanarak yansıma yarı ince bölümler göz (şekil 4 ve şekil 5); brüt iç anatomisi incelenmesi olanak sağlar. Bu objektif, kristal koni çapı, kristal koni yolu, şekil, genişliği ve uzunluğu, birincil ve ikincil pigment hücreleri konumunu ve dorsal RIM alan eşleme rhabdom varlığı kalınlığını içerir. Bu tekniğin güzel Ultra-ince kesitler TEM, ultrastructure özellikle, microvillar yönlendirmesini (şekil 4) belirlemek için sağlayan kullanarak yansıma tarafından tamamlanmaktadır ve miktarının daha küçük (Örneğin, genişliğini yapıları dar kristal koni yolu, şekil 5).
Resim 1: Z-yığın photomicrographs, üç castes Avustralya şeker karınca, Camponotus consobrinus. Bu sistemdeki tüm üç castes görsel yerleşimini genel bir bakış sağlar. Başvuru20' den uyarlanmıştır. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Elektron filmler bu teknik görüntüleme yeteneklerini gösteren karınca görsel sistemin tarama. Üst satır farklı göz pozisyonları ve göz boyutlarda gösterir:(a) Myrmecia nigriceps; (B) Opisthopsis pictus; ve (C) Amblyopone australis (Not çok küçük gözleri, beyaz ok). Gösterilen yüksek büyütme oranında alınan görüntüleri: (D) üç basit gözünde Myrmecia nigriceps; farklı işçilerin ölçekli bileşik gözlerinin içine (E) Rhytidoponera metallica (Not farklı olarak ommatidia şeklinde farklı bölgelerinde bileşik göz sarı), (F) Amblyopone australis, (G) Myrmecia pyriformis, (H) Orectognathus clarkive (ben) Pheidole türler. Ölçek çubukları = 1 mm (A-C), 100 µm (D-H), 10 µm (I). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: karınca göz ve ocelli kornea çoğaltmalarını. Bileşik göz Myrmecia nigricepsbir işçinin(a)kopya. Dışbükey yineleme insizyon yaparak dümdüz. İlave arka (p), anterior () ve dorsal (d), ventral (v) eksen gösterir. Myrmecia tarsataişçi ocelli (B) kopya. Ölçek çubukları 0,5 mm (A), 10 µm (B) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: rhabdom kesit LM ve EM görüntülerini. Toluidin içinde mavi lekeli Myrmecia nigriceps distal rhabdoms kesiti(a)dairesel veya dikdörtgen şeklinde rhabdoms ayırt etmek için kullanılabilir. Transmisyon elektron Filmler göstermek: birden fazla yönelimleri dairesel rhabdom içinde microvilli ve (C) microvilli (B) odaklı dikdörtgen şekilli rhabdom iki zıt yönde. (D) kullanarak ışık mikroskobu, dikdörtgen rhabdoms uzun ekseninin Camponotus consobrinus; bir Kraliçe gözlerine sırt bölgesinin bir fan benzeri düzenlemesini gösterme için eşleştirilir iç metin arka (p), anterior (a) ve lateral (l), medial (m) eksen gösterir. Panel D başvuru20' den uyarlanmıştır. Ölçek çubukları 10 µm (A), 1 µm (B-C), 100 µm (D) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: LM ve EM görüntüleri Myrmecia tarsata, ışık adapte gözünde bir ommatidium. (A)boyuna kornea (C), kristal Koni (CC), koni yolu (ct), rhabdom (Rh) ve ilköğretim gösteren bir ommatidium bölümünü pigment hücreleri (PPC). (B) kesik çizgili dikdörtgen kutu içinde A panelinden başka bir bölüme koni yolu dar genişliğini ölçmek için TEM altında görüntülendi. Başvuru21uyarlanmıştır. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: yarı ince ve ultra-ince kesitler (fiksasyon ve infiltrasyon, kesme ve boyama) ile ilgili genel sorunların. (A)doku nedeniyle yetersiz penetrasyon (ok) yarı ince bir bölümü Pheidole türler olan zavallı fiksasyonu; (B) Iridomyrmex calvus içinde (yarı ince); kesit sırasında kopyalama (C) (sol) Boyama mükemmel ve (sağda) ile toluidin boyama içinde Myrmecia croslandiiçinde mavi; (D) pigment (Daire) ve doku zavallı reçine ve doku yoğunluğu (reçine çok yumuşak) eşleme nedeniyle (oklar) kesit sırasında kopyalama. Bölümünü (yıldızlar) katlanır, bölümler bıçak tekne toplarken olabilir; (E) yoksul (iç metin için yetersiz boyama nedeniyle) Karşılaştır kontrast, kurşun sitrat kristaller (beyaz ok) CO2ve dikey bıçak maruz üzerinden (siyah oklar); mark (F) Melophorus hirsutus bileşik göz zavallı fiksasyonu nedeniyle doku (beyaz ok) delikler; (G) reçine çok yumuşak, kesit zaman chitter yol açar bölümünde; dikey dalgalanmalar olarak görülen (H) bölüm çok kalın (~ 100 nm) zavallı kontrast karanlık görüntü sonuçlandı, bakteri ve Partiküler madde için kirlenmiş distile su kurşun dağınık boyunca bölümü (beyaz ok) Pheidole türler. Ölçek çubuğu = 25 µm (A-B), 10 µm (C-H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belgili tanımlık maiyet yukarıda belirtilen yöntemlerden karıncalar ve diğer böcekler optik sistemi etkili bir soruşturma için izin verir. Bu teknikler örnekleme çözünürlüğü, optik duyarlılık ve okudu göz potansiyel polarizasyon duyarlılığını anlayışımızı bilgilendirmek. Bu bilgi görsel yetenekleri fizyolojik ve davranışsal soruşturma için önemli bir temel sağlar. Burada ayrıntılı yöntemleri karınca görüntü sistemleri üzerinde odaklanmıştır, Ayrıca, bu teknikleri diğer böcekler üzerinde hafif değişiklikler de olsa (fiksasyon ve daha kalın dokularda infiltrasyon süresi artanörneğin,) iletişim kuralı ile kullanılabilir . Biraz değiştirilmiş protokolleri böcekler ağustosböcekleri22, sinekler14, arılar23, Yaban arıları24, kelebekler25ve güveler26da dahil olmak üzere çeşitli görüntü sistemleri tanımlamak için kullanılmıştır. Her ne kadar tekniklerin çoğu ana hatlarıyla burada olmuştur kullanılan bir süre için bu makalede karıncanın optik sistem eğitimi bağlamında onları bir araya getirmek ve alternatif teknikleri Karşılaştır ve ortak tuzaklar tanımlamak için bir fırsat alır.
Uygulamaları üst üste sahip birçok görüntüleme teknikleri mevcut ve el altında görev için uygun tekniktir değerlendirmek zor olabilir. Burada ilgili bir örnek bir teknik genel bakış görüntüleme için seçmektir. Kafa ve göz dış morfolojisi ve kafasına optik sisteminin göreli konumlandırma yapılabilir SEM veya photomicrography kullanarak. Ancak, bazı özel konuları vardır gözleri Imaging zaman, güçlü ve zayıf bu tekniklerin gözden geçirilmiş27olmuştur. Göreli konumlandırma ve gözleri boyutunu görüntüleme, her iki tekniğin de avantaj ve dezavantajları var. SEM görüntüleri renk bilgi eksikliği ve pigmentasyon ilgili olduğu bu nedenle photomicrography daha iyi. Ancak, SEM görüntüleri güzel yapıları arası ommatidial kıllar ve faset sınırları daha ayrıntılı gibi göstermek ve yüzey özellikleri photomicrography teknikleri (örneğin, ocellar lensler, ve heykelcilik yüzey altında görünmez bile ortaya Bileşik göz lensler). SEM keşif görüntüleme ve çünkü o-ebilmek işletmek numune boyutlarda geniş bir dizi bu aralığı boyunca çok yüksek çözünürlükte tutarken faiz özelliklerinin belirlenmesi konusunda çok yönlü bir tekniktir. Bununla birlikte, diseksiyon mikroskop olarak yaygın olarak erişilebilir değil ve daha yüksek bir düzeyde gerekir. Sık sık bir gerektirir bilgi elde etme tek yolu yoktur. Böyle bir senaryoda ne mevcuttur ve kaynakları yatırım en önemli olduğu dikkate almak yararlıdır.
Oje yinelemeler kornea model numaraları ve faset çapları en doğru ölçü alınırken en yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu böcekler11,22,28,29çeşitli artık kullanılmıştır. Bir SEM alınan görüntüleri kalitesini çok daha üstün olmakla birlikte, göz eğriliği her tarafı dizinin doğru ölçümler engeller. Model dağıtım ve model boyutta eşleme da mikro bilgisayarlı tomografi5alınan taramaları uygun olmalıdır.
LM ve TEM teknikleri, örnek hazır ve de görüntüleme son aşamaya kadar işlenen olup olmadığını bilmek zordur. Komplikasyonları önlemek için temiz alanlarda ve düzenli olarak taze çözümleri hazırlama araçları ve iyice filtre su çalışma bakımı gibi iyi uygulamaları kurmak önemlidir. Çıplak gözle kirletici EM örnekleri berbat edebilir. Bu nedenle, yüzeyleri ve aletleri etanol veya aseton ve tüysüz-üreten mendil gibi bir solvent kullanarak silmek yararlı olabilir. En uygun kesit, EM kesitler, boyama ve SEM örnekleri hazırlarken bu. Benzer şekilde, distile su kaynakları mevcut sorunları ve öylesine her zaman filtreleri kontrol edin, onları düzenli olarak değişir ve her zaman taze filtrelenmiş su kullanmak en iyi kirleticiler tanıtmak (saklamayın). Çoğu Fiksajlar, lekeleri ve gömme malzemeleri sonsuza kadar saklanamaz ve hazırlama tarihini içeren tüm çözümler etiketlemek önemlidir. Sistematik bir yaklaşım ve bir kenara kesintisiz iletişim kuralları yürütmek için yeterli zaman ayarlamak önemlidir.
Teknikleri farklı türler için adapte her zaman deneme yanılma bir mesele. Karınca içinde çalışırken, temel farklılıklar hayvan ve kas kütlesi kafa içinde yalan. Karıncaların kafalarını daha fazla kas ile genellikle düzeltmek için daha uzun sürer. Çok büyük karıncalar ile çene kemiğinde kas, trakea ve çene kemiğinde bezleri, sinir dokusu ile en az girişim sağlarken kaldırmak en iyisidir. Küçük karıncalar ve az çene kemiğinde kasları olanlar, sadece sapa kaldırma ve clypeal bölge başkalarının eline geçmesini yeterli fiksasyon ulaşmak mümkündür. Bu gibi durumlarda, küçük delikler önemsiz ayrıntılar iğne kullanarak kafasına fiksasyon geliştirmek için yapılabilir.
Çevre koşulları da hazırlıklar etkileyebilir unutmamak gerekir. Sıcak ve nemli ortamlarda (özellikle tropikal alan istasyonları) infiltrasyon aşamasında bir meydan okuma olmak kanıtlayabilirim. Sıcak koşulları kısmen zamanından önce giderek daha yapışkan hale kullanılmayan reçine kaynaklanan polimerize reçineler yol açabilir. Bu durumda, en iyi seçenek reçine küçük, tek kullanımda buzdolabı ya da derin dondurucu kaplarda saklayın etmektir. Fiksajlar soğutma sıcak koşullarda sayaç daha hızlı doku çürümesi için yararlı olabilir. Ancak, soğutmalı çözümleri daha yavaş tedavi kez uygun penetrasyon sağlamak için genişletilmiş Yani dağıtmak.
Akılda bu uyarılar ile karıncalar ve diğer böcekler optik sistemi soruşturma çok ödüllendirici kanıtlayabilirim. Görsel sistem eğitim visual alanları, interommatidial görüş açıları, optik duyarlılık ve örnekleme çözünürlük boyutunu tahmin etmek için bize izin verir. Göz anatomisi anlamak bizim anlayış ve hayvan davranış yorumlanması bildirir. Örneğin, anatomi gündüz veya gece, olup gibi hayvanların görsel yetenekler konusunda Öngörüler yapmak için bize izin verir hangi daha önce belgelenmemiştir. Karıncalar avuç görsel sistemi hakkında güncel bilgi göz önüne alındığında, biz bizim yöntemleri anlayışımız daha da biyologlar ve myrmecologists bileşik göz ve karıncalar ocelli incelemek için ilham kaynağı olacak umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.
Acknowledgments
Böcek anatomi bilgi paylaşımı için Jochen Zeil, Paul Cooper ve Birgit Greiner için minnettarız ve tekniklerin birçoğunu gösteren için burada anlatmıştık. Merkezi yetenekli ve destek personeli için gelişmiş mikroskobu, ANU ve MQU mikroskobu birimi için sana şükrediyoruz. Bu eser FRE ve hibe yüksek lisans burs Avustralya Araştırma Konseyi (DE120100019, FT140100221, DP150101172) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ant | Myrmecia midas | ||
| Stereomicroscope | Leica M205 FA | ||
| Sputter coater | Pro Sci Tech | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | ||
| Petri dish | ProSciTech | ||
| Dissecting microscope | Leica MZ6 | ||
| Insect Pin | ProSciTech | ||
| Colourless nail polish | Non branded: from any cosmetic store | ||
| Glass slide | ProSciTech | ||
| Razor blade | ProSciTech | ||
| Foreceps | ProSciTech | ||
| Cover slip | ProSciTech | ||
| Compound microscope | Leica DM5000 B | ||
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | ||
| Paraformalydehyde | Sigma Aldrich | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | ||
| di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sigma Aldrich | ||
| Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | ||
| Osmium tetroxide | Sigma Aldrich | ||
| Acetone | Sigma Aldrich | ||
| Araldite Epoxy Resin | Sigma Aldrich | ||
| Pasteur pipette | Sigma Aldrich | ||
| Toluidie Blue | Sigma Aldrich | ||
| Hotplate | Riechert HK120 |
References
- Zeil, J. Visual homing: an insect perspective. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 285-293 (2012).
- Wehner, R. Desert ant navigation: how miniature brains solve complex tasks. J. Comp. Physiol. A. 189, 579-588 (2003).
- Fent, K., Wehner, R. Ocelli: a celestial compass in the desert ant Cataglyphis. Science. 228, 192-194 (1985).
- Warrant, E. J., Dacke, M. Visual navigation in nocturnal Insects. Physiology. 31, 182-192 (2016).
- Taylor, G. J., et al. The dual function of Orchid bee ocelli as revealed by x-ray microtomography. Curr. Biol. 26, 1-6 (2016).
- Hölldobler, B., Wilson, E. O. The Ants. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1990).
- Ali, T. M. M., Urbani, C. B., Billen, J. Multiple jumping behaviors in the ant Harpegnathos saltator. Naturwissen. 79, 374-376 (1992).
- Weiser, M. D., Kaspari, M. Ecological morphospace of New World ants. Ecol. Entomol. 31, 131-142 (2006).
- Bulova, S., Purce, K., Khodak, P., Sulger, E., O'Donnell, S. Into the black and back: the ecology of brain investment in Neotropical army ants (Formicidae: Dorylinae). Naturwissen. 103, 3-4 (2016).
- Narendra, A., Reid, S. F., Hemmi, J. M. The twilight zone: ambient light levels trigger activity in primitive ants. Proc. R. Soc. B. 277, 1531-1538 (2010).
- Narendra, A., et al. Caste-specific visual adaptations to distinct daily activity schedules in Australian Myrmecia ants. Proc. R. Soc. B. 278, 1141-1149 (2011).
- Moser, J., et al. Eye size and behaviour of day-and night-flying leafcutting ant alates. J. Zool. 264, 69-75 (2004).
- Stöckl, A. L., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Adaptations for nocturnal and diurnal vision in the hawkmoth lamina. J. Comp. Neurol. 524, 160-175 (2016).
- Zeil, J. Sexual dimorphism in the visual system of flies: the compound eyes and neural superposition in Bibionidae (Diptera). J. Comp. Physiol. A. 150, 379-393 (1983).
- Dacke, M., Nordström, P., Scholtz, C. H. Twilight orientation to polarised light in the crepuscular dung beetle Scarabaeus zambesianus. J. Exp. Biol. 206, 1535-1543 (2003).
- Greiner, B., Ribi, W. A., Warrant, E. J. Retinal and optical adaptations for nocturnal vision in the halictid bee Megalopta genalis. Cell Tiss Res. 316, 377-390 (2004).
- Warrant, E. J., et al. Nocturnal vision and landmark orientation in a tropical halictid bee. Curr. Biol. 14, 1309-1318 (2004).
- Lattke, J. E. Ants Standard Methods for Measuring and Monitoring Biodiversity. , 155-171 (2000).
- Ribi, W. A. A Handbook in Biological Electron Microscopy. , 1-106 (1987).
- Narendra, A., Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A. Compound eye and ocellar structure for walking and flying modes of locomotion in the Australian ant, Camponotus consobrinus. Sci. Rep. 6, 22331 (2016).
- Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches. J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).
- Ribi, W. A., Zeil, J. The visual system of the Australian "Redeye" cicada (Psaltoda moerens). Arthr. Struct. Dev. 44, 574-586 (2015).
- Ribi, W. A., Warrant, E. J., Zeil, J. The organization of honeybee ocelli: regional specializations and rhabdom arrangements. Arthr. Struct. Dev. 40, 509-520 (2011).
- Ribi, W. A. Colour receptors in the eye of the digger wasp, Sphex cognatus Smith: evaluation by selective adaptation. Cell Tiss. Res. 195, 471-483 (1978).
- Ribi, W. A. Ultrastructure and migration of screening pigments in the retina of Pieris rapae L. (Lepidoptera, Pieridae). Cell Tiss. Res. 191, 57-73 (1978).
- Lau, T., Gross, E., Meyer-Rochow, V. B. Sexual dimorphism and light/dark adaptation in the compound eyes of male and female Acentria ephemerella (Lepidoptera: Pyraloidea: Crambidae). Eur. J. Entomol. 104, 459-470 (2007).
- Wipfler, B., Pohl, H., Yavorskaya, M. I., Beutel, R. G. A review of methods for analysing insect structures - the role of morphology in the age of phylogenomics. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 60-68 (2016).
- Streinzer, M., Brockmann, A., Nagaraja, N., Spaethe, J. Sex and caste-specific variation in compound eye morphology of five honeybee species. PLoS ONE. 8, e57702 (2013).
- Somanathan, H., Warrant, E. J., Borges, R. M., Wallén, R., Kelber, A. Resolution and sensitivity of the eyes of the Asian honeybees Apis florea, Apis cerana and Apis dorsata. J. Exp. Biol. 212, 2448-2453 (2009).
