Summary
이 원고는 supination 쥐에 단정 되는 반자동된 작업을 설명 합니다. 쥐가 도달 하 고, 파악 supinate 구형 manipulandum. 회전 각도 사용자가 설정한 조건을 초과 하는 경우는 쥐 펠 릿으로 보상 된다. 이 작업 처리량, 상해, 및 객관성 전통적인 작업에 비해 감도 증가 합니다.
Abstract
동물 모델에서 손 재주를 정확 하 게 측정 하는 작업은 손 기능을 이해 중요 합니다. 크게 손 재주를 측정 하는 현재 쥐 행동 작업 도달 하거나 음식 조작의 비디오 분석을 사용 합니다. 이러한 작업을 쉽게 구현할 수 있고 강력한 질병 모델, 그들은 주관적이 고는 실험에 대 한 힘 드는입니다. 더, 객관적, 효율적이 고 양적 전통적인 작업을 자동화 하거나 새로운 자동화 된 작업을 만드는 작업을 만들 수 있습니다. 그러나 때문에 쥐가 덜 보다 영장류, 중앙 신경 시스템 (CNS) 상해 더 미묘한 적자 손 재주, 생산, supination은 매우 교묘한 영향을 설치류에 중요 한 손에 영장류에 기능. 따라서, 우리 쥐에서 forelimb supination 측정 반자동된 작업을 설계 되었습니다. 쥐 하 도달 하 고 손잡이 모양 manipulandum를 파악 supination 보상을 받을 수에 manipulandum을 설정 훈련 된다. 쥐 20 ± 내 기술 5 일 얻을 수 있습니다. 훈련의 초기 부분을 감독 높은 동안 훈련의 많은 직접적인 감독 없이 수행 됩니다. 작업은 안정적으로 그리고 reproducibly 미묘한 적자 부상 후 캡처하고 임상 복구 곡선을 정확 하 게 반영 하는 기능 회복을 보여 줍니다. 분석 데이터의 그래픽 사용자 인터페이스는 직관적인 되도록 설계를 통해 특수 소프트웨어에 의해 수행 됩니다. 우리는 또한 훈련과 쇼 훈련 초기 동작에 사소한 수정 supination의 신뢰할 수 있는 인수를 생산 중에 발생 하는 일반적인 문제에 솔루션을 줄. 따라서, 노브 supination 작업 쥐 손 재주에 대 한 중요 한 운동의 효율적이 고 양적 평가 제공합니다.
Introduction
손 재주 후 신 경계 부상 또는 질병 크게 독립 및 영향을 받는 개인 1,2,,34에 대 한 삶의 질 감소의 손실. 따라서, 손 재주 신경 수리 및 운동 신경 제어 모터 학습의 기초를 잘으로 재활의 과학을 이해 하기 위한 중요 한 결과 측정 이다. 전통적으로, 단일 펠 릿에 도달, 파스타 조작, 어바인, Beatties, 및 Bresnahan (IBB) Forelimb 규모 수동 작업 동물, 특히 설치류 5, 6,7에 손 재주를 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 작업은 그들의 최소한의 작업 수집 시간이 대중화 되는. 그러나, 그들은 자연, 실험, 및, 때때로, 미묘한 적자 5,7,,89부상 후 기능 장애를 구분 하지 않는 힘 드는 질적. 전통적인 작업의 이러한 제한을 했다 동물, 모터 함수의 더 많은 양적 측정 개발 특히, forelimb 도달.
자동화 작업, 즉 객관성, 증가 된 처리량 및 저하 분석 시간을 몇 가지 이점이 있다. 새로운 자동화 된 작업 기존 작업 8,10보다 부상 후 손 재주를 평가의 더 민감한 측정을 제공 합니다. 또한, 그들은 적응 훈련 및 훈련을 짓는다는 테스트 및 어려움을 동물의 성능 테스트에 대 한 허용. 마지막으로, 많은 양의 데이터를 두 가지 장점을 제공 하는 생성 하는 자동화 된 작업. 첫째, 두 재판 내에서 데이터와 횟수가 증가 연구의 통계적 인 힘 증가. 둘째, 그것은 신경 모터 학습, 훈련, 및 운동 및 운동학 적 정보 11의 분석을 통해 더 견고 하 게 보상 하는 더 큰 데이터 집합을 제공 합니다.
몇몇 그룹은 전통적인 작업을 자동화 하려고 했습니다. 고속 카메라 작업 12도달 단일 펠 릿 같은 작업에서 운동학 적 데이터를 수집 하려면 사용할 수 있습니다. Alaverdashvili 및 위 쇼 도달 움직임을 프레임-의해-프레임 모션 측정 소프트웨어 피크 모투 13를 사용 하 여 자리 움직임 분석 고속 카메라를 이용 했다. 그러나,이 소프트웨어 컴퓨터 비전를 사용 하 여 숫자를 식별 하지 않습니다 있지만 대신 커서가 이동 포인트를 디지털화 실험을 요구 한다. 또한, 일부 작업 자동화 훈련 과정 14,,1516하 지류와 연습장과 함께에서 사용 되었습니다.
다른 그룹 공간 조정 평가 하 고 숙련 된 forelimb 파스타 조작, 다른 더 복잡 한 움직임 17캡처 작업 설계를 사용 하 여 도달에서 힘을 포스 센서 뿐만 아니라 고속 카메라를 사용. 이러한 작업은 도달 범위와 풀 작업 쥐 forelimb 움직임 18의 평면 및 회전 움직임을 캡처를 자유의 세 학위 로봇 장치를 사용 하 여입니다. 이 복잡도와 비용 증가 하지만 움직임의 속도 측정할 수 있는 장점이 있습니다.
여기, 우리 쥐 8supination 측정 반자동된 forelimb 작업을 보여 줍니다. Forelimb supination 팜 팜 아래에서 발의 회전입니다. Supination corticospinal 지역 기능의 우수한 마커 및 일상 생활 활동 8,,1920에 필요한 인간에서 임상으로 관련 된 운동 이다. 또한, supination 때 매우 중요 한 상해 및 비활성화, 특히 8를 도달 하는 단일 펠 릿에 비해. Supination 작업 버크 의료 연구 기관 및 달라스, 측정 회전 운동 평면 8,10텍사스 대학 사이 협력에서 발전 했다. 쥐 행동 상자 (그림 1A)에 배치 되 고 3 개의 움직임 (그림 1B)를 할 훈련: 직사각형 조리개;를 통해 도달 구형 manipulandum;를 파악합니다 지정 된 각도를 supinate.
동작 작업 PC 소프트웨어 (그림 1C)에 의해 제어 됩니다. 제어 소프트웨어 자동 위치 확인, 광학 인코더, 스피커, 및 급지대에 연결 된 마이크로컨트롤러에 지침을 보냅니다. 마이크로컨트롤러 및 그 주변 기기 연결 마이크로컨트롤러 상자 라고 합니다. 정보와 다음 컴퓨터, 마이크로컨트롤러, 광학 인코더에서 흐름 마이크로컨트롤러 다시. 제어 소프트웨어는 신호를 받으면 마이크로컨트롤러에 재판 성공 했다, 마이크로컨트롤러 피더를 펠 릿을 분배를 트리거합니다. 각 세션의 시작 부분에서 제어 소프트웨어 릴레이 무대의 조리개에서 정의 된 거리에는 손잡이 위치를 자동 위치 확인을 지시 하는 마이크로컨트롤러에 단계 정보. 자동 위치 확인도 자동 위치 확인에 있는 화살표 키를 사용 하 여 수동으로 운영 수 있습니다. 광학 엔코더 각도에서 100 Hz 및 측정값 변경에 대 한 데이터를 기록합니다. 모든 데이터는 이진 형식으로 저장 됩니다.
실험 소프트웨어 내에서 순차적인 교육 단계를 사용 하 여 미리 정해진 각도 성공 속도로 supinating에 habituation에서 쥐를 훈련. 습관 들 임, 동안 손잡이 manipulandum 어떤 제어 장치 없이 조리개 창 안에 배치 됩니다. 높은 감독된 훈련의 주 후 쥐 보상와 손잡이 연결 하 고 손잡이 독립적으로 선회 시작 합니다. 일단 쥐 독립적으로 설정할 수 있다, 노브 0.25 cm 단위로 쥐 돌 수 있다 독립적으로에서 1.25 cm. 제어 장치는 1.25 cm 철회 다음 6 g. 자동 훈련 단계 기차 supinate 노브를 동물에 3 g에서 1g 단위로 추가 6 g에서 최대 75도. 교육의이 단계는 주로 감독; 일단 쥐 적절 한 형태 (아래 설명)와 함께 작업을 채택, 그들은 제대로 supinate 계속. 쥐 supinate 75도 875 성공률 (적중률)에서 훈련 완료 됩니다. 여기, 우리가 전형적인 훈련 프로토콜 및 현재 솔루션 우리가 발생 하는 일반적인 문제에 설명 합니다. 우리 훈련 프로토콜을 통해 대표적인 성공 하 고 실패 한 쥐의 진행을 설명 하 고 보여 작업 하거나 더 심각한 적자와 기능 장애를 표시 하도록 수정할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜 작업을 설정 하 고 생활 및 조건, 뿐만 아니라 훈련 동물 먹이, 부상, 후 동물 테스트 및 동작 데이터를 분석 설정에 대해 설명 합니다. 동물 훈련의 4 단계도 설명: 습관 들 임, 보상 협회, 제어 훈련과 훈련 기준을 설정 각도. 모든 동물 실험 IACUC Weill 코넬 의학 대학 텍사스 달라스에 의해 승인 했다.
1. 설정 작업을
- 디자인 행동 상자 150 밀리미터 200 밀리미터 폭 250 m m 높이 여 긴 투명 한 플라스틱의 만든.
참고: 여기, 직사각형 조리개 높이 25.4 m m 폭 14.2 m m 이다. 손잡이 manipulandum 직경의 9.5 m m 메타 크 릴 산으로 만든 있으며 supination 100 ° 보다는 더 적은 제한 하는 두 정거장. 이러한 매개 변수 각각의 테스트 되었습니다 있고 결과 섹션에 설명 된 적자에 대 한 최적화. 행동 상자 및 manipulandum 그림 1A에 나와 있습니다. - 는 컴퓨터에 마이크로컨트롤러 상자를 연결합니다. 4 개의 마이크로컨트롤러까지 상자는 각 컴퓨터에 연결 될 수 있다.
- 는 작업을 시작 하려면 제어 소프트웨어 ( 그림 1C).
컨트롤에 대 한
- 선택 손잡이 장치입니다. 주체 이름에 입력 합니다 " 주제 " 필드. 선택 아래에서 훈련을 위한 무대는 " 단계 " 드롭다운 메뉴.
참고: 단계 지시 각 재판에 대 한 세 개의 매개 변수:는 " 명 중 창 " " 히트 임계값, " 및 " 초기 임계값. " 히트 시간의 정의 된 기간 내에서 기준 각도 도달로 정의 됩니다. " 칠 창 " 재판을 시작 하 고 기준 각도 도달 하는 동물에 대 한 할당 된 시간을 말합니다. " 히트 임계값 " 성공적인 재판에 대 한 기준 각도입니다. " 초기 임계값 " 재판을 시작 하 고 창; 히트 기준 각도 이 회전의 시작을 나타냅니다. 단계에 대 한 자세한 정보는 아래 섹션에서 볼 수 있습니다 " 훈련 동물. " - 클릭 " 시작 " 훈련 세션을 시작 하려면. 클릭 " 피드 " 수동으로 동물 먹이 및 " 중지 " 훈련 세션을 중지 하기.
참고: 수동 작업에 관심을 유지 하는 데 사용 해야 유와 섹션 3에서에서 자세하게 설명 됩니다. 세션을 중지 한 후 세션 데이터 c: 드라이브에 저장 합니다.
- 선택 손잡이 장치입니다. 주체 이름에 입력 합니다 " 주제 " 필드. 선택 아래에서 훈련을 위한 무대는 " 단계 " 드롭다운 메뉴.
2. 생활 및 먹이 조건
- 사용 성인 여성 Sprague Dawley 쥐 (175-200 g). 집 쥐 함께 반전된 12 h 다크/12 h 표준 장에 빛 사이클. 모든 교육을 수행 하 고 희미하게 조명과 어두운 주기 동안 테스트.
참고: 이후 그들은 쉽게 훈련 21 여성 쥐가 사용 됩니다. 여기 Sprague-Dawley 모터 훈련에 사용 되는 일반적인 긴장 때문에 제 닉에 대 한 지배적인 긴장은 사용 되었다. 그러나, 작업 (제어 장치, 회전 각도 기준, 손잡이, 노브 자체 거리)의 조정 가능한 특성상이 쉽게 조정 될 수 있었다 다른 긴장 그리고 더 큰 (예: 남성) 또는 작은 (예: Wistar) 쥐. - 연구의 첫 번째 5 일 주고 5 일 동안 영양 완전 한, 초콜릿 맛된 알 약 이외에 전체 여 물통을 쥐. 5 일 후 음식-쥐를 제한 그들의 정상 체중 곡선의 85%.
- 후 음식 제한 시작 했다 그들의 훈련의 전체에 걸쳐 쥐의 초콜릿 펠 릿 (나이 조정 무게의 85%를 유지 하기 위해 위로 또는 아래로 조정) 7.5 g을 피드. 쥐가 그들의 교육 세션에 초콜릿 펠 릿의 7.5 g를 받지 못한 경우 마지막 세션 후 withstandard 차를 보충.
참고: 주말 먹이 광고 libitum 표준 차 우와 함께 일요일 저녁까지, 다음 음식 박탈 하룻밤. 수술 또는 다른 침략 적 개입을 수행할 때 허용 식품 광고 libitum 최소 3 일 전에 그리고 다시 음식 제한에 쥐를 놓기 전에 (복구 시간)에 따라 수술 후 3 일.
3. 교육 절차
참고: 훈련 절차의 개요 그림 3A에 표시 됩니다. 프로토콜을 통해 기차 쥐 매일 두 번, 아침에 한번, 오후에 한 번. 오후 세션을 시작 하기 전에 아침 세션 후 적어도 3 시간을 기다립니다.
- Habituation
참고: 테스트 상자와 처리는 쥐를 habituation의 목표입니다.- 자동 위치 확인에 아래쪽 화살표 키를 눌러 손잡이 장치를 완전히 철회.
- 장소 15 분에 대 한 행동 상자에 쥐
- 상자에 15 분, 후 처리 하는 실험 쥐를 적어도 5 분 동안 손에 각 쥐.
- 두 일 동안 반복.
- 보상 협회
참고: 목표 음식 보상 노브의 연관 쥐를 훈련 하는 것입니다. 훈련의 보상 협회 단계 작업에 30 분의 전체 세션 길이 지출 기대 합니다.- 소프트웨어 열고 쥐 이름을 입력 합니다. 무대 설정 " K1: 손잡이 형성-도르래. "
참고: 0.0 cm에서 조리개에서 manipulandum 거리를 설정 하는이 " 초기화. Thresh. " 3 °, " 명 중 Thresh. " 5도, 그리고 " 히트 창 " 2 s. 쥐를 쥐 회전 노브 지난 3도 먹이를 수 있습니다. " 히트 창 " 2에 남아 훈련을 통해 s. - 행동 상자와 언론에 쥐를 넣어 " 시작 " 세션 시작.
- 한 번에 2-3 알 약을 분배 하 고 보상 탱크는 상자의 측면을 활용 하 여 보상 물에 쥐를 확인 합니다. 수동 급지대 버튼을 사용 하 여 알 약을 분배.
- 쥐 보상의 위치를 알고 있다, 일단 수동으로 특 면 1 펠 릿 쥐 조리개 앞에 있을 때.
- 한번 쥐 펠 릿 보상, 상태는 manipulandum와 상호 작용 하는 쥐의 기대에 조리개 이동 합니다.
- 쥐 manipulandum, 근처 45 mg 음식 펠 릿을 배치 하 여 또는 펠 릿 먼지는 manipulandum에 직접 적용 하 여 종사를 표시, 그것을 수 있도록 밖으로 도달 하 고 그것을 파악. 쥐 조리개에서 이동, 경우의 주의를 manipulandum 근처 상자에 누릅니다.
참고: 경우에 쥐의 도달 발와 노브만 진, 프로그램 쥐를 공급 합니다. 발 (무, nosing는 manipulandum)의 사용을 포함 하지 않는 어떤 상호 작용 정확 하 고 보상 하지 해야 합니다.
- 쥐 manipulandum, 근처 45 mg 음식 펠 릿을 배치 하 여 또는 펠 릿 먼지는 manipulandum에 직접 적용 하 여 종사를 표시, 그것을 수 있도록 밖으로 도달 하 고 그것을 파악. 쥐 조리개에서 이동, 경우의 주의를 manipulandum 근처 상자에 누릅니다.
- 쥐 원하는 발와 0.0 cm에서 10 회 연속을 보상 받고 손잡이만 지 시작를 사용 하 여 아래쪽 화살표 키 자동-포지 셔 너 ( 그림 1A)에 manipulandum을 철회 하 여 0.25 cm. 반복 이 0.25 c m 증가 manipulandum는 조리개에서 1.25 cm까지.
- 기자 " 중지 " 세션을 종료 30 분 후.
- 쥐 조리개 ( 그림 1B)에서 1.25 cm에서 원하는 발과 manipulandum supinates 때까지 보상 협회 계속.
- 쥐 2 연속 세션 supinating는 manipulandum 하 고 펠 릿 보상 검색 완료 되 면 시작 제어 훈련.
- 소프트웨어 열고 쥐 이름을 입력 합니다. 무대 설정 " K1: 손잡이 형성-도르래. "
- 평형 6 g 평형 supinate에 쥐를 훈련 하는 훈련.
커넥터는 평형의 끝에는 manipulandum의 L 자형 첨부 점을 연결 하 여 manipulandum에
- 장소 3g 제어 장치. 제어 장치는 자유롭게 중단 될 때까지 도르래를 통해 제어 문자열 피드.
- 소프트웨어 열고 쥐 이름을 입력 합니다. 무대 설정 " k 2: 손잡이 형성-도르래. "
참고: 1.25 cm에서 조리개에서 manipulandum 거리를 설정 하는이 " 초기화. Thresh. " 3 °, 그리고 " 명 중 Thresh. " 5도에서. 이 시점에서 1.25 cm에 manipulandum 거리 유지 됩니다. - 행동 상자와 언론에 쥐를 넣어 " 시작 " 세션 시작.
- 보도 " 중지 " 100 + 성공적인 시험 후. 쥐 100 + 성공적인 시험의 2 연속 세션 완료 되 면 세션의 끝 후에 1 g 무게를 증가. 후속 세션에 걸쳐 6 g, 3 세대에서 무게를 증가.
- Supination 6 g 및 100 + 성공적인 재판의 2 연속 세션 후 진행 하도록 3.4.
참고: 일 6 회 (3 일)의 평균에서에서 소요 3 세대 6 g. 제어 훈련에서 시작, 그것은 절대적으로 올바른 supination 움직임 보상 되 고 잘못 된 supination 운동 밖으로 형성 되 면. 비주얼 가이드 및 정확 하 고 잘못 된 supination 형태에 대 한 설명, 그림 2를 참조 하십시오.
- 기준선 훈련
참고: 모양 올바른 supination 움직임을 계속 기억 하십시오. 다시 그림 2 수정/잘못 된 supination 운동에 대 한 시각적 가이드를 잘못 supination 개량 하는 방법을 참조 하십시오. 훈련 기준 기준; supinate 하 쥐 여기,이 75% 이상 성공률에 6 g 제어와 75도입니다.- 6 g 제어 장치는 manipulandum에 배치.
- 소프트웨어 열고 쥐 이름을 입력 합니다. 무대 설정 " KSB4: 손잡이 훈련 중간 75 최대 "
참고:이 설정에서 " 초기화. 타 작. " 5 °에서 " 히트 임계값 최소 " 15 °, 그리고 " 히트 임계값 최대 " 75 °에. 이것은 라고는 " 적응 " 훈련 단계, 임계값 쥐로 증가 의미 ' s 성능이 향상 됩니다. 에 " KSB4 " 단계, 설정 된 임계값은 먼저 이전 세션 ' s 최종 임계값. 아무 이전 세션이이 단계에서 실행 되었다, 15도의 임계값 최소 임계값 설정 됩니다. 세션의 처음 10 재판 후 임계값 이전 10 타석에서 각 피크의 중간값으로 계산 됩니다. 따라서, 임계값 각 재판에 대 한 다른 고 쥐에 따라 ' 이전 재판에서 s 성능. - 30 분 후 세션 중지
- 계속 평균 피크 각도 75도 적응 단계를 사용 하 여 훈련 또는 더 큰. 그런 다음 3.5 단계로 진행 합니다. 이 일반적으로 약 10 일 또는 20 세션 후 발생 합니다.
- 기록 4 연속 기준선을 기준선 평가
- 6 g 제어 장치는 manipulandum에 배치.
- 소프트웨어 열고 쥐 이름을 입력 합니다. 무대 설정 " K27: 75도. "이 " 초기화. 타 작. " 5 ° 및 " 75 ° 히트 임계값.
- 기자 " 중지 " 30 분 또는 100 재판 후 도래 하는 첫째, 세션을 종료.
- 성공률 75% 이상으로 4 연속 기준선까지 계속.
4. 이후 부상 평가
- 소프트웨어 열고 쥐 이름 입력. 사전 부상 초기 테스트로 같은 정적 단계에 무대를 설정 합니다. 이 기준선에 대 한 사용 하는 동일한 매개 변수를 유지 합니다.
- 기자 " 시작 " 30 분까지 세션 실행
참고: 참여 수 있습니다 낮은 부상 후입니다. 이 설명서를 사용 하 여 해결 될 수 있는 피드 버튼 또는 쥐에 manipulandum와 함께 참여를 유도 하기 위해 manipulandum 근처 보상 펠 릿 배치. - 주간 간격으로 일주일에 한 번 테스트 후 부상 평가의 원하는 길이 도달할 때까지 반복.
참고: 여기, 우리가 평가 후 부상 성능 6 주 동안 매주.
5. 데이터 분석
참고: 데이터는 PC의 c: 드라이브에서 기본 위치에 저장 됩니다. 데이터는 100 Hz에서 히트 창 캡처하고 이진 형식으로 저장 합니다. 여기, 데이터는 사용자 지정 프로그램, 손 재주를 사용 하 여 분석 했다. 이 자유 소프트웨어에 대 한 액세스에 대 한 박사 제이슨 카라멜 이메일.
- 오픈 재주와 클릭 " 표준. "
- 쥐 데이터는 원하는 폴더를 선택 합니다 디렉터리를 찾습니다.
- 디렉터리를 선택한 후 분석을 위해 쥐를 선택 합니다.
- 클릭 " 유지 " 또는 " 삭제 " 유지 하거나 완전 한 또는 데이터 파일을 무시 하.
참고: 시간이 있다 잘못 된 매개 변수를 사용 하 여 및 단계 훈련 세션 시작 하는 때 그들은 즉시 중지 하는 동안, 파일 여전히 만들어집니다. 이 파일은 분석 하는 동안 삭제 될 필요가 있다. 또한 인스턴스, 특히 심하게 후 있다 상해, 동물 그들의 부상이 나 아주 작은 시련 때문에 아무 실험을 수행할 때. 그것은 그들의 성과의 표현 때문에이 세션에 대 한 파일 유지 되어야 한다. NaN 계산된 변수에 대 한 적절 한 장소에 배치 파일 없이 성공적인 실험을 유지 될 때. - 선택 여부 지금 또는 나중에; 실험 주석을 " 지금 주석 "은 선택, 새 창구 열릴 것 이다. 에 입력는 " 실험 이름 " " 그룹 이름 " " 이벤트 데이터, " 및 " 주 총 수 " 실험에.
- 그룹에 과목을 할당.
- 각 주 또는 시간 포인트에서 데이터 세션의 수를 입력합니다. 공백으로 입력된 세션을 분리 하 고 마지막 공간을 넣어 있는지 확인 번호 즉, (1 1 1 1).
- 시간 요소 레이블을 입력합니다. 공백으로 입력된 라벨 분리 및 마지막 레이블 즉 (사전 Wk1 Wk2 Wk3) 후 공간을 넣어 있는지 확인.
- 선택 때 이벤트가 발생, 분석 세션을 저장 하는 옵션이 나타납니다. 클릭 " 예 " 분석 세션을 저장 하.
- 주석 및 unannotated 데이터에 대 한 개요 표시 됩니다. 이 데이터를 플롯 옵션 준다.
- Unannotated 데이터에 대 한 클릭 " 그래프 제목 " 개별 주제를 또는 " 그래프 과목 "를 같은 그래프에 모든 과목.
- 주석된 분석 클릭 " 음모 "를 실험.
- 모두 주석 하 고 unannotated, 플롯 될 변수 목록에 대 한 드롭다운 화살표를 클릭 합니다. 줄거리를 보려면 변수를 클릭 합니다.
- 클릭 내보내기 내보내기 그래프 및 데이터 그래프와 관련 된.
Representative Results
훈련, 초기에 실험 쥐 행동을 형성 하는 작업에 더 많은 시간을 보낸다. 쥐에 쥐 supination 보상, 손에와 연결로 (그림 3A)은 감소 합니다. 습관 들 임, 보상 협회, 그리고 제어 훈련, 동안 전체 세션 길이 (30 분) 작업에 지출 이다. 그러나, 쥐 6 g 무게로 supinating는, 후 작업에 시간 점차적으로 줄이는 약 15 분을 쥐의 supination 각도 증가 함. 마지막으로, 쥐 기준에 도달 하면, 작업 시간은 최소한; 실험은 단지 행동 상자에 쥐를 놓고 프로그램을 시작 해야 합니다. 쥐를 실험에 동시에 작업할 수 있습니다 최대 수는 두 쥐 보상 연결 중, 제어 교육 및 기준선, 훈련 중 4 쥐 그리고 많은 만큼 쥐는 상자 기준 평가 및 사후 부상 테스트 중. 쥐의 평균, 75% (n = 56) 작업을 취득.
쥐 연관 supination 보상, 후 쥐의 supination 각도 (그림 3B)에 긍정적인 진행이 있다. 그림 3B, 쥐 데 7 주 3에서에서 6 g 평형 추를 3g에서 진행. 제어 훈련, 후는 supination 26에서 30도로 증가 하는 동안 하루 9, 7 일에서 적응 훈련의 짧은 기간이 이었다. 많은 변화 되지 않았기, 때문에 정적 임계값 하루 9 ~ 18에서에서 고용 되었다. 이 기간 동안 쥐 꾸준히 증가 30도에서 75도 8 일에. 일상적인 다양성 교육, 특히, 12 및 14 일에 걸쳐 있다. 그러나 일반적으로, 거기에 상승 추세 supination 각도. 하루 17-습관 들임 말까지 쥐의 첫 번째 기준선을 기록 했다 그리고 4 개의 세션 후, 그것은 기준선 평가 완료. 4 초기의 기록에 habituation에서 훈련 프로토콜에는 20 ±의 평균 5 일 소요 됩니다.
훈련 프로토콜을 통해 이상적인 진행을 보고 하는 것이 중요 하지만 실패 진행 보기 것 이다 동등 하 게 중요 한 (그림 4). 그림 4A, 오렌지 라인 보여주는 성공적으로 완료 된 프로토콜, 블루 라인 표시 실패 한 쥐 쥐 하 고 회색 라인 표시 다른 6 성공적인 쥐. 성공적인 쥐 도달 15 ± 기준선 0.6 일 (n = 7). 대표적인 성공 쥐 1 시 이해를, 실패 한 쥐 3 시 이해를 사용 하 여 사용 합니다. 두 쥐 2 일에 보상으로 손잡이 연결합니다. 또한, 두 쥐 비슷한 supination 각도 (그림 4A) 진행 되는 처음 4 일은 제어 장치를 추가한 후에 표시. 그러나,이 시점 이후 성공적인 쥐 실패 한 쥐에서 이탈 하기 시작 합니다. 이것은 실패 한 쥐의 이해가이 시점 전에 정정 될 수 없었기 때문에 ( 그림 2참조).
성공적인 쥐 50와 60도 사이의 고원 시작 하지만 다음 75도 향해 꾸준한 등산을 다시 시작 하는 supination 각도에서 가파른 상승이입니다. 그러나, 실패 한 쥐 supination 각도에서 더 점진적 증가입니다. 쥐 고원 약 20도, 쥐 더, supinate을 밀어 되 면 하지만 결국, 그것은 수동 먹이 함께 작업에 관심을 잃는다 고 supination 각도 하루 15 후 habituation 주위 빠르게 감소. 하루 17 후 habituation 후 약간의 복구 동안 쥐 supinate 25도 이상 하 고 투 한다. 쥐 20 일까 기준선을 달성 하지 않은, 우리이 쥐를 실패 한 고려 하 고 연구에서 쥐를 제거.
Supination 각도 이외에 하나 성공 하 고 실패 한 쥐 supination 파형 (그림 4B-D)의 육안 검사를 수행할 수 있습니다. 육안 검사를 수행할 때 여러 파형 특성을 찾고: 선, 대기 시간, 및 재판에 대 한 시간 창에서 봉우리의 수의 사면. 선의 기울기는 곡선의 발병 및 곡선의 피크 사이의 곡선의 파생으로 계산 됩니다. 대기 시간 재판의 개시와 히트 임계값을 교차 하는 곡선 사이의 시간으로 계산 됩니다. 마지막으로, 봉우리는 평가판 창에서 로컬 맥시 마를 찾으려고 파생을 사용 하 여 계산 됩니다. 이전에 우리 선, 또는 속도의 그 경사를 발견, supination 활동의 강력한 측정 이며 미묘한 적자 8에 민감한.
Supinate (그림 4B) 6 g를 사용 하 여 시작 후 훈련의 첫 번째 세 번째, 성공적인 쥐 (그림 4B1) 실패 한 쥐 (그림 4B2 동안 20도 근처 피크와 단일 파형을 보여줍니다. ) 두 차례, 또는 10도 가까이 첫 번째 피크와 5도 근처 두 번째 피크 두 봉우리를 보여줍니다. (그림 4C) 훈련의 중간 세 번째에 성공적인 쥐 (그림 4C1)에서는 피크 각도 20도 더 정의 단일 피크 곡선으로 50도에 증가 하는. 실패 한 쥐 (그림 4C2) 한편, 한계는 유일한 쇼 피크 각도 20도에 증가 그러나 향상 했다 형태로; 그것은 지금만 사용 하 여 단일 회전. (그림 4D) 교육의 마지막 1/3, 성공적인 쥐 (그림 4D1) 20의 피크 각도와 피크 실패 한 쥐 (그림 4D2) 대 약 65 °와 매우 발음된 단일 파형을 보여줍니다. 하지만 지금은 2 추가 피크도 15 °의 s. 이것은 또 다른 좋은 지표는 증가 훈련 어려움으로 쥐 하지 못했습니다 그 3 시 파악, 해결 하 고 차례로, 제대로 supinate 수 없습니다. 경우에이 쥐 연구에서 제외 되지 않았습니다 결국 75도 수행할 수, 여부 그것은 진정한 supination supination 보상으로 대 하는 것에 대 한 질문 남아 있다.
마지막으로, supination 작업 부상, forelimb 모터 피 질 병 변 endothelin 주사와 수행 corticospinal 지역, 사람, 자발적인 운동 위한 주요 통로의 컷된 병 변 등의 여러 종류 후 기능 장애 감지 그림 5 () 8,,1022. Pyramidotomy 그룹에 쥐 (보라색, n = 8) 대뇌 피 질의 병 변 그룹에서 쥐 동안 성공률 75% 이상에서 6 g에서 적어도 75 ° supinate을 훈련 했다 (녹색, n = 10) supinate 7.5 g 75% 이상에서 60 °에 훈련 되었다. 두 그룹에서 쥐 부상 (그림 5A) 후 성공률에 날카로운 감소를 보였다. Pyramidotomy 그룹에 쥐에 대 한 성공률은 90% ± 2% ~ 14% ± 8%에서 감소 했다. suc외피 병 변으로 쥐에 대 한 세금 비율 76% ± 1% ~ 10% ± 3%에서 감소. 6 주, 두 그룹은 여전히 장애인: pyramidotomy 그룹 동안 대뇌 피 질의 병 변 그룹 16% ± 7%에서 34% ± 11%에서 했다. Supination 각도 관해서는 두 그룹 사전에서 감소 후 부상 (그림 5B)를 표시합니다. 다른 조건 기준 supination 각도 인 pyramidotomy 그룹 외피 병 변의 그룹 (67 ° ± 0.52 °) 보다 더 높은 사전 부상 supination 각도 (85 ° ± 2.9 °) 했다. 외피 병 변 그룹 27 ° ± 2.9 °로 감소 하는 동안 pyramidotomy 그룹 38 ° ± 10 °에 줄였다.
그림 1: Supination 작업 설명. (A)는 쥐 조리개는 그것 도달 하 고 grasps supination에 설정 해야 합니다 손잡이와 유리 상자에 배치 됩니다. 손잡이 supination 각도 보다 큰 100 °를 방지 하기 위해 두 정거장. 손잡이 또한 제어;와 도르래는 이 쥐 supinate 하 극복 한다 토크를 만듭니다. 손잡이 정확도 0.25 °의 각도 측정 하는 광학 인코더에 연결 된다. 이 광학 인코더 차례로 작업을 제어 하는 컴퓨터에 연결 하는 마이크로컨트롤러에 연결 된다. 컴퓨터가 때 트리거 오디오 피드백을 마이크로컨트롤러에 고 성공 기준을 달성 하는 경우 급지대에서 펠 릿을 분배. 마이크로컨트롤러는 또한 0와 1.25 cm 사이 그 위치는 훈련 단계는 컴퓨터에 의해 설정에 의해 결정 하는 자동 위치 확인을 제어 합니다. 3 개의 연속 된 움직임에는 작업을 수행 하는 (B)는 쥐: 1 시, supinating 그리고에 있는 전력 파악으로 손잡이 잡고 조리개를 통해 도달. (C) 노브 supination 작업 제어 소프트웨어에 의해 제어 됩니다. 실험의 이름을 입력 하 고 프로그램 해당 매개 변수를 설정 하는 동안 훈련 단계를 선택. 하나의 성공적인 supination 재판의 파형 동안 성공 및 실패 한 실험의 순서는 녹색 및 빨강, 각각 파란색으로 표시 됩니다. 재판은 성공에 의해 표시 제어 소프트웨어 재판 표시 되지 않는 경우 실패 한 반면 supination 각도 정의 된 시간 창 내에서 히트 임계값 보다 큰 경우. 이 프로그램은 1 개의 상자를 제어합니다. 컴퓨터 당 4 개의 프로그램을 동시에 실행할 수 있습니다. 이 그림에는에서 수정 된 Sindhurakar 그 외 여러분, 2017, Neurorehabilitation 및 신경 수리8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Supination 움직임. 다이어그램 및 훈련 프로토콜 중에 발생 하는 일반적인 정확 하 고 잘못 된 supination 움직임에 대 한 설명 잘못 된 움직임 등 진정한 supination 되지 않을 수 있습니다 보상 메커니즘 올바른 움직임 진정한 supination, 허용 한다. 포함 하는 것은 부적절 한 움직임을 해결 하기 위해 제안된 솔루션입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 훈련 프로토콜. (A) 표준 시간대입니다. 약 25 일 총에서 지속 훈련의 5 개의 기간: Habituation (5d), 보상 협회 (d 1-3), 웨이트 트레이닝 (3-4 d), (8-12 d), 기준선과 기준선 평가 (2-4 d) 훈련. 타임 라인에 선 패턴은 실험의 각 세션 작업에 지출 하는 데 필요한 시간을 지정 합니다. 훈련 프로토콜 진행 작업에 시간 감소. (초기 평가 보상 협회에서 supinate 수 쥐의의 B) 일반적인 진행 전반적으로, 기준선으로 쥐의 긍정적인 선형 진행 이지만 관찰, 거기에 다양성 훈련 프로토콜을 통해 쥐의 성능. 웨이트 트레이닝, 후 있다 적응 훈련 기간 supination 각도 임계값 쥐의 성능에 맞게 변경 됩니다. 이 적응 훈련은 쥐 기준 달성 했다 때까지 정적 임계 처리 패러다임 옵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 성공 및 실패 작업 수집. 교육 성공 7 8 쥐에 대 한 프로토콜을 통해 supination의 (A) 진행 각도 하나 실패. (성공, 오렌지) 기준선 기준에 도달 한 대표 쥐와 하나의 실패 한 쥐 (파랑) 추가 사례 연구로 사용 됩니다. Habituation 후 훈련의 첫 7 일 이내에 모두 성공 하 고 실패 한 쥐 supination 각도에 비슷한 진행을 보여주었다. 하루 11 후 요법이 니에 의해 성공적인 쥐 실패 쥐 supinated 25 ° 동안 55 ° supinating 이었다. 하루 15 후 요법이 니, 후 성공적인 쥐 실패 쥐 성능에 거부 하는 동안 강한 상승 진행을 보여주었다. 훈련 후 habituation의 마지막 세 번째, 실패 한 쥐 동안 성공적인 쥐 80 ° supinating 했다 30 ° plateaued 했다. 95% 신뢰 구간 (B) 평균 파형 (검은 선) (대 한 성공, 파랑 오렌지 실패) 평형 추의 6 g 추가 후 훈련의 첫 번째 3. (B1) 성공적인 쥐-단일 피크 약 20 ° (B2) 실패 한 쥐-글로벌 최대 10 °의 더블 피크 95% 신뢰 구간 (C) 평균 파형 (검은 선) (대 한 성공, 파랑 오렌지 실패) 평형 추의 6 g 추가 후 훈련의 두 번째 3. (C1) 성공적인 쥐-45 °에서 단일 피크 (C2) 실패 한 쥐-20 ° 근처 단일 피크와 향상 된 양식 95% 신뢰 구간 (D) 평균 파형 (검은 선) (대 한 성공, 파랑 오렌지 실패) 평형 추의 6 g 추가 후 훈련의 마지막 3. (D1) 성공적인 쥐-65 °에서 단일 피크 발음. (D2) 실패 한 쥐-20 °에서 글로벌 최대 더블 피크 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5:강력한 > 다른 부상 모델 작업 감도. Pyramidotomy 그룹에 쥐 (보라색, n = 8) 대뇌 피 질의 병 변 그룹에서 쥐 동안 성공률 75% 이상에서 6 g에 75 ° supinate을 훈련 했다 (녹색, n = 10) supinate 6 g 75% 이상에서 60 °에 훈련 되었다. 표시 된 데이터는 평균 ± 표준 오차. (A) 성공률 대뇌 피 질의 병 변 대 pyramidotomy 병 변 대. 두 모델 모두 부상 후 부상 (주 1)을 사전에서 성공률에 날카로운 감소를 보였다. Pyramidotomy에 대 한 성공률 감소에서 0.90 ± 0.02 0.14 ± 0.08, 0.76 ± 0.01에서에서 대뇌 피 질의 병 변의 성공률 감소 하는 동안. (외피 병 변 대 pyramidotomy 대 한 supination B) 각도. 두 그룹 사전에서 감소 후 상해를 보여주었다: 대뇌 피 질의 병 변 그룹 27.1 ° ± 2.9 °로 감소 하는 동안 pyramidotomy 그룹 38.2 ° ± 10.1 °로 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
손잡이 supination 작업 forelimb supination 쥐 양적 및 반 자동화 된 방법을 사용 하 여 평가 합니다. 이러한 끝점을 달성 하기 위해 노브 정렬, manipulandum 디자인, 및 훈련 기준를 포함 하 여 작업에 대 한 설계 매개 변수의 많은 몇 년 동안 반복 되었습니다. 손잡이 맞춤, 우리 조리개에 관해서 노브의 3 개의 다른 정렬 실험: 손잡이 중심에 조리개, 조리개의 왼쪽에 정렬 하는 손잡이의 왼쪽, 그리고 노브의 오른쪽의 오른쪽에 맞춰집니다는 perture입니다. 우리는 왼쪽된 발에서 간섭 하는 시간의 짧은 금액에서 훈련 된 하 고 누가 supinated 최소한의 보상 메커니즘, 특히,이 생산된 쥐로 조리개의 오른쪽으로 정렬 되 고 노브의 오른쪽에 정착.
Manipulandum 디자인에 관해서는 우리 forelimb와 터 닝을 극대화 하 고 시체의 사용을 최소화 여러 가지 디자인 기능 변경. 또한, 우리가 수평 예측된 적자의 심각도를 작업의 어려움. Pyramidotomy, 후 supination 가장 강하게 영향을 받는 운동 이지만 손상이 여전히 상대적으로 미묘한입니다. 따라서, 우리는 부상 후 대규모 적자 관찰 했다 되도록 높은 기준선 기준 (75 °)에 쥐를 훈련 합니다. 더 혼란, 대뇌 피 질의 병 변에 대 한 7.5 g에 60도 임계값 부상 후 상당한 적자를 입증 하기에 충분 했다. 재판 및 오류 접근 방식을 통해 최적화 된 추가 매개 변수 조리개 크기, 조리개, 그리고 성공적인 시험을 달성 하기 위해 시간 창에서 노브 거리를 포함 한다.
훈련 프로토콜에 걸쳐 주의 감독을 요구 하는 몇 가지 중요 한 포인트가 있다. 기준선을 훈련 할 때 적응 임계 처리 방법 75 ° 10쥐를 훈련을 성공적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 쥐 수 피크에서 고원의 각도 보다 75 °; 성능 동일 4-5 세션 후 합니다. 성능 향상을 위해 정적 임계값을 사용할 수 있습니다. 정적 임계값은 최근 실적을 기반으로 변화 하는 적응형 임계값 반대로 쥐 성능의 독립 설정된도에 남은 임계값을 말합니다. 쥐 적응 훈련 기간 동안 고원, 하는 경우는 실험 정적 임계값을 변경 해야 합니다. 정적 교육 단계 에서부터 20 10 ° 단위로 70도. (무대 K28-K33). 이전 2 세션에서 쥐의 평균 피크 각도에 따라 정적 단계를 선택 합니다. 예를 들어 쥐는 평균 45 °, 50도 (K31)에 대 한 정적 단계를 선택 합니다. 모든 정적 단계 설정 "Init. 타 작. "5 °에서. 훈련 도중, 잃는 경우에 쥐 동기 부여, 수동으로 피드 쥐 경우 가까이 하지만 임계값 이상 하지 supinates.
또한, 초기 평가 동안 쥐의 약 5% 퇴보 supination 각 그들의 5-10 ° 및 성공률 세션 사이에서 5-10%. 이런, 쥐 3-4 세션 후 75 °의 평균 최대 각도 복구 하지 않는 경우 단계로 3.5 반환 하기 전에 쥐의 현재 평균 각도 10도 이내 정적 무대를 감소. 그것은 정적 훈련 단계에 배치 되었습니다 일단 적응 단계에 쥐를 다시 하지 해야 합니다.
작업에 몇 가지 제한이 있습니다. 잘못 된 이해 위치 설정 된 후 변경 쥐고 동작 (그림 2) 어려울 수 있습니다. 따라서, 조기 발견 및 수정이 중요 합니다. 쥐의 이해를 수정 하려면 조리개는 수평 및 수직 방향;에서 조리개의 크기를 축소 하 여 변경할 수 있습니다. 일반적으로 우리는 조리개를 조정의 가장자리를 유리 슬라이드를 테이프. 대부분 쥐에 대 한이 그들의 권력 형태를 향상 하는 때문에 그것은 특정 방식으로 manipulandum를 파악 하도록. 이것, 차례 차례로, 자신의 능력을 제대로 supinate 향상 시킵니다.
이 문제를 함께 쥐 supinate 보상 메커니즘을 개발할 수 있습니다. 이들은 supination; forelimb를 보조 하기 위하여 머리를 사용 하 여 팔꿈치와 어깨 관절의 노브;를 낮추는 왼쪽된 발을 사용 하 여 도움의 손잡이 또는 도달 발을 밀어. 이러한 행동의 모든 작업을 완료 하려면 사용할 수 있습니다. 위에서 설명 했 듯이, 행동 이해에 관련 된 조리개를 조작 하 여 수정 될 수 있습니다. 그러나 파악, 외부 보상 메커니즘, 실험 하지 보상 행동을 보상 하 여 적극적인 참여를 필요로 합니다. 부상 후 복용 supinating 전에 적절 한 위치에 발을 배치를 여러 실험 쥐를 관찰 했습니다. 우리가 분석 하지 작업의 구성 요소는 supination의 손실에 기여할 수 있습니다, 비록 이러한 정확한 그립의 손실을 포함 시킬 고 많은 가능성 중 힘 변조, 손상.
반자동된 supination 걸리는, 평균, 20 ± 5 일 기준, 쥐를 훈련 하 고 동물의 25%는 작업에 훈련 될 수 없습니다. 훈련 시간에 기여 하는 사실 우리가 자연스럽 게 오른쪽 선호 쥐 선택 하지 하지만 대신 그들의 오른쪽 발을 사용 하 여 모든 동물을 강제로 대부분 도달 분석에서 일반적으로 이다. 우리는 왼쪽 기본 쥐를 사용 하 여 시도 하지 않은 하지만 먼저 발 취향을 확인 하 고 지배적인 발 훈련 하는 흥미로운 탐구 연구 될 것 이라고. 이 맞게, 조리개; 반전 되도록 문의 방향을 대칭 이동 시켜야 이 쉽게 할 수 있습니다.
IBB 또는 단일 펠 릿 도달 같은 전통적인 작업에 비해, supination 작업 정량적이 고 객관적으로 측정 forelimb에 도달 합니다. 그것은 심각한 상해 (대뇌 피 질의 병 변) 및 미묘한 부상 (pyramidotomy), 감도 보여줍니다 그리고 훈련 절차 부상 모델의 심각도 따라 수정할 수 있습니다. 때문에 반자동, 작업 훈련 단계에 따라서 동시에 여러 쥐를 훈련 하 실험을 수 있습니다. 실험의 생산성과 쥐 처리량에 크게 향상 됩니다. 작업은 안정적이 고 쥐 사이 재현. 동안 훈련 프로토콜을 참조 하는 경험에 대 한 문제 해결 가이드 (그림 2)을 만들어 여러 가지 잘못 된 행동으로 문제를 해결 하려면 솔루션 표준화는 우리. 마지막으로, 작업 많은 양의 데이터를 분석 하는 직관적인 방법을 제공 하 고는 실험 supination의 활동에 더 깊이 탐구 하는 능력을 제공.
미래에, 우리 것 사용 반자동된 supination 작업 플랫폼으로 종류, 복용량, 및 재활의 타이밍. 우리 실험실은 부상 후 기능 향상에 자극의 효과에 관심을. 또한, 우리는 어떻게를 신경 자극 요법 수리 또는 개선 신경 전도에 관심이 고 통신 재활에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 또한 우리가 모터 학습; 공부할 수 있도록 전기 생리학과 호환 되도록 작업 수정에 관심을가지고 머리와 쥐모자는 정기적으로 작업을 수행 하 고 추가 녹음 또는 자극에 대 한 정류 할 간단한 것. 작업을 설명 하 고, 쥐, 있지만 실험실 작업에 대 한 마우스를 사용 하 여 실험도 있다. 일반적으로,이 작업 및 차례로 재활 전략을 평가 하기 위한 다양 한 상해 모델 및 질병 상태에에서 설치류의 forelimb 함수를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 앞으로 이동, 우리는 잘못 된 행동을 완화 하 고 개선 작업 수집 속도 및 훈련 시간에 수정 작업을 개선 하기 위해 계속.
Disclosures
Dr. Rennaker와 Dr. 슬로이 발행물에서 장비를 제조 하 고 Vulintus inc의 소유자가 있습니다. 다른 작가 대 한 관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
이 연구는 NIH NINDS R03 NS091737에 의해 자금 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Base Cage - Rat Model | Vulintus | MotoTrak Rat System | N/A |
| Controller | Vulintus | MotoTrak Rat System | N/A |
| Behavior Module | Vulintus | MotoTrak Rat System | Supination Task, Methacrylate Dual Stop Knobs |
| Pellet Dispenser - 45mg | Vulintus | MotoTrak Rat System | N/A |
| Autopositioner | Vulintus | MotoTrak Rat System | N/A |
| 45 mg, Chocolate Flavor, 50,000/Box | Bio-Serv | F0299 | N/A |
| HP Z230 Tower WorkStation | HP | N/A | Intel Xeon CPU E3-1225 v3 @ 3.20 GHz, 16GB RAM, 1TB HDD. Min Requirements: 8GB RAM, Multi-Core Processor |
| Dexterity | Burke Medical Research Institute | Matlab software for data analysis | |
| Enviropak | WF Fisher and Son | N/A | N/A |
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