Summary
ويصف هذه المخطوطة تقنية للكشف عن الطفرات من ذات التردد المنخفض في كتدنا، يليها ER ويتمايز هذا الأسلوب باستخدام فريدة من نوعها تصحيح الخطأ اثنين ثنائي الاتجاه، وتصفية الخلفية الخاصة، واكتساب كفاءة الجزيئية.
Abstract
تحليل تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) باستخدام الجيل التالي التسلسل (خ ع) أصبح أداة قيمة لتطوير علم الأورام السريري. ومع ذلك، تطبيق هذا الأسلوب تحديا بسبب حساسيتها منخفضة في تحليل تتبع كمية من كتدنا في الدم. وعلاوة على ذلك، قد تنشئ الطريقة النتائج الإيجابية والسلبية الكاذبة من هذا التحليل تتابعها واللاحقة. تحسين جدوى وموثوقية للكشف عن كتدنا في العيادة، هنا نقدم أسلوب الذي يثري الطفرات النادرة للتسلسل، "التسلسل طفرة نادرة إثراء" (ER-Seq). يمكن تمييز ER-Seq طفرة واحدة من أصل 1 × 107 نوع البرية النيوكليوتيدات، مما يجعله أداة واعدة للكشف عن التعديلات الوراثية الغاية منخفضة التردد، وهكذا سوف تكون مفيدة جداً في دراسة هيتيروجينيسيتي المرض. حكم ربط المحول تسلسل فريد من نوعه، يتيح هذا الأسلوب استعادة كفاءة الجزيئات كتدنا، بينما في الوقت نفس تصحيح للأخطاء bidirectionally (معنى و antisense). لدينا مجموعة المجسات 1021 كيلو بايت يثري قياس المناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 95% الطفرات سائق ذات الصلة بورم في الأورام 12. تتيح هذه الطريقة فعالة من حيث التكلفة والعالمي إلى تراكم نجاح فريد من البيانات الوراثية. بعد كفاءة تصفية الأخطاء في الخلفية، ER-seq دقة الكشف عن الطفرات النادرة. استخدام دراسة الحالة، نقدم بروتوكول مفصلة تثبت المسبار تصميم وبناء مكتبة، ومنهجيات التقاط الحمض النووي المستهدف، بينما أيضا بما في ذلك سير العمل تحليل البيانات. عملية الاضطلاع بهذه الطريقة عادة ما يأخذ 1-2 أيام.
Introduction
الجيل التالي التسلسل (خ ع)، أداة قوية للتحقيق أسرار الجينوم، يمكن أن توفر كمية كبيرة من المعلومات التي قد تكشف عن التعديلات الوراثية. تطبيق تحليل خ ع في العيادة قد أصبحت أكثر شيوعاً، خاصة بالنسبة للطب شخصية. واحدة من أكبر القيود المفروضة على خ ع، غير أن نسبة خطأ عالية. على الرغم من أنها تعتبر مناسبة لدراسة الطفرات الموروثة، هو تحليل الطفرات نادرة إلى حد كبير محدودة1،2، خاصة عند تحليل الحمض النووي التي تم الحصول عليها من "خزعة سائلة".
تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) هو دون خلايا الحمض النووي (كفدنا) في الدم الذي هو يسفك من الخلايا السرطانية. وفي معظم الحالات، كمية كتدنا منخفضة للغاية، الذي جعل الكشف والتحليل صعبة للغاية. ومع ذلك، قد كتدنا العديد من السمات الجذابة: عزلتها كسبها، ويمكن الكشف عن ذلك في المراحل المبكرة من نمو الأورام، ويعكس مستوى كتدنا الكفاءة العلاجية وكتدنا يحتوي على طفرات الحمض النووي الموجودة في الآفات الأولية والمنتشر 3 , 4 , 5-ولذلك، ونظرا للتطور السريع لهذه التقنية خ ع والتحليل، التطبيق للكشف عن كتدنا أصبح أكثر جاذبية.
استخدمت نهوج مختلفة يسلسل موازية على نطاق واسع للكشف عن كتدنا ولكن أيا من هذين النهجين قد قبلت للاستخدام الروتيني في العيادات بسبب محدوديتها: انخفاض حساسية والافتقار إلى التنوع، وتكلفة عالية نسبيا6 ،،من78. على سبيل المثال، تسلسل المزدوجة، استناداً إلى علامة معرف فريد (UID)، مرارا وتكرارا بتصحيح الأخطاء في bidirectionally إلى توافق في الآراء، تصحيح معظم الأخطاء الخاصة بالتسلسل. ومع ذلك، يضيع جدوى هذا الأسلوب نظراً للتكلفة العالية وانخفاض بيانات الاستخدام9،10. وبالمثل، Seq كاب وبه تكرار محسنة، كاب-ايديس11،12، يكون التطبيق العملي أكبر في الكشف عن كفدنا، على الرغم من دقة وشمولية هذه الطرق بحاجة إلى التحسين.
لتلبية الاحتياجات الحالية للكشف عن كتدنا دقيقة وتحليل، قمنا بتطوير استراتيجية جديدة، "إثراء نادرة الطفرات التسلسل" (ER-Seq). يجمع هذا النهج بين ما يلي: محولات تسلسل فريدة من نوعها لاستعادة كفاءة الجزيئات كتدنا، مع تصحيح الخطأ ثنائي الاتجاه، والقدرة على التمييز بين طفرة واحدة من أصل > 1 × 107 نوع البرية النيوكليوتيدات؛ المسابر 1021 كيلو بايت التي تثري قياس مناطق المستهدفة التي تغطي أكثر من 95% الطفرات المتصلة بورم من الأورام 12، بما في ذلك سرطان الرئة، سرطان القولون والمستقيم، سرطان المعدة، وسرطان الثدي، وسرطان الكلي، سرطان البنكرياس، سرطان الكبد، سرطان الغدة الدرقية، سرطان عنق الرحم، وسرطان المريء، وسرطان بطانة الرحم (الجدول 1)؛ وفحص قاعدة بيانات خط الأساس جعلها فعالة وسهلة لدقة الكشف عن الطفرات النادرة في كتدنا.
لإنشاء قاعدة بيانات خط أساس، تجد جميع طفرات الجينات واسطة ER-Seq من عدد من نفس النوع من العينات (~ 1000 في البداية). يجب التحقق من هذه الطفرات الحقيقية بالعديد من أساليب الكشف موثوقة والتحليل. بعد ذلك، تلخيص نمط الطفرات كاذبة والمجموعة جميع الطفرات كاذبة لبناء قاعدة بيانات خط الأساس الأولى. استمر في إضافة الطفرات كاذبة تبين من التجارب اللاحقة التسلسل إلى قاعدة البيانات هذه. ولذلك، يصبح هذا قاعدة بيانات خط الأساس توسيع قاعدة بيانات ديناميكية، مما يحسن إلى حد كبير من دقة تسلسل.
لتعزيز التقدم المحرز في تشخيص الورم، والرصد، ونقدم ER-Seq، وسيلة منخفضة التكلفة ومجدية للحصول على بيانات عالمية. نقدم دراسة الحالة التي خضعت للتحليل ER Seq، مما يدل على دقة للكشف عن الطفرات النادرة وجدوى استخدامها في العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على عينات الدم وعينات الورم وفقا لبروتوكول أقرته "لجنة الأخلاقيات لشعب جامعة بكين" ' s المستشفى. تم الحصول على الموافقة الخطية من المرضى لاستخدام العينات الخاصة بهم. تم فحص المشاركين وفقا للمعايير التالية: أنثى، متقدمة عدم الصغيرة "سرطان الرئة"، طفرة p.L858R EGFR وتبين حسب "تسلسلها سانغر" السابق، تطور المرض عقب الدورة اثنين من EGFR استهدفت العلاج مع ارلوتينيب، و ER-Seq الذي طبق على كتدنا لتحليل قضية المقاومة وإيجاد أدوية جديدة للهدف-
1-"استخراج الحمض النووي" من "الدم المحيطي" كفدنا والحمض النووي (جدنا)
- وجمع 10 مل دم المحيطي في أنبوب جمع، وعكس بلطف صعودا وهبوطاً 6-8 مرات إلى المزيج. تجنب إمالة الخلية. يمكن تخزين عينات الدم في أنبوب جمع في 6-37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.
- الطرد المركزي أنبوب جمع في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في 1600 (±150) × غ.
- نقل المادة طافية (البلازما) من أنبوب جمع بأربعة نظيفة 2 مل مناسب المسمى أنابيب الطرد المركزي باستخدام بيبيت المتاح دون الإخلال بطبقة بيليه (خلايا الدم البيضاء). المسمى
- Transfer1 مل من الخلايا باستخدام بيبيت نظيفة المتاح لمل 2 شكل مناسب أنبوب الطرد المركزي. يمكن أن تكون الخلايا المخزنة في-20 درجة مئوية أو أبرد قبل الخطوة 1.8.
- الطرد المركزي البلازما (من الخطوة 1، 3) 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، و 16000 (±150) × غ.
- نقل البلازما لتنظيف أنابيب الطرد المركزي التي توصف بشكل صحيح " البلازما "، اترك مل ~0.1 من وحدة التخزين المتبقية في الجزء السفلي لتجنب التلوث. تخزين البلازما في-80 درجة مئوية حتى الخطوة 1.7.
- استخدام 3 مل بلازما من الخطوة 1، 6 لعزل كفدنا (يحتوي على كتدنا) باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً، بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s.
- استخدام 200 ميليلتر من خلايا الدم البيضاء من الخطوة 1، 3 عزل جدنا باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً، بعد الشركة المصنعة ' تعليمات s-
ملاحظة: كل كفدنا وجدنا يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية قبل الاستخدام. - تطبيق ضوابط الجودة المختلفة كفدنا وجدنا (الجدول 2). تنفيذ مراقبة الجودة بطريقة موحدة بيواناليزير لتحديد مستويات التدهور عينة و/أو تلوث جدنا. تحليل ذروة نوعية استخراج كفدنا يجب أن تظهر مشابهة الشكل 1-
ملاحظة: أقصى حجم كفدنا هو حوالي 170 هناك علما أن زيادة كمية الحمض النووي سيؤدي إلى مكتبة نوعية أعلى للكشف عن الطفرات النادرة في كفدنا فعالة. ونحن نوصي باستخدام على الأقل 30 نانوغرام كفدنا (000 30 نسخة)-
2. إعداد مكتبة
ملاحظة: فيما يتعلق بمكتبة قاعدة البناء على الحمض النووي مجزأة، كفدنا موجود في شظايا مع ذروة حجم ~ 170 شركة بريتيش بتروليوم وبالتالي لا تحتاج إلى أن تكون مجزأة.
نموذج- يفتت عنصر التحكم (جدنا) التي سونيكيشن للحصول على 200-250 شركة بريتيش بتروليوم الشظايا.
- إعداد 1 ميكروغرام من عينة جدنا في 100 ميليلتر تريس يدتا المخزن المؤقت في أنبوب نظيف sonication.
- تعيين البرنامج sonication ك 30 s s على و 30 قبالة لدورات 12 لإجمالي 12 دقيقة
- سونيكيشن، وبعد التأكد من المنتج (5 ميليلتر) يحتوي على 200-250 شركة بريتيش بتروليوم الشظايا عن طريق تشغيل تحليل مع 2% [اغروس] هلام.
- نقل جميع تجزئة المنتجات إلى أنبوب 1.5 مل جديدة واحتضان مع 150 ميليلتر من حبات المغناطيسية لمدة 5 دقائق لتحديد الأجزاء الصحيحة.
- إزالة المادة طافية عن طريق وضع الأنبوب في رف مغناطيسية لمدة 30 س. أغسل
- الخرز مع 200 ميليلتر من الإيثانول 80% (طازج) مع أنبوب البقاء على الرف المغناطيسية. احتضان لمدة 30 ثانية قبل إزالة المادة طافية. كرر مرة واحدة.
- الهواء الجاف الخرز مع غطاء أنبوب مفتوحة مع البقاء على الرف المغناطيسية. تجنب الخرز أوفيردريد للتأكد من أن يسترد الحمض النووي الهدف جيدا. الوت شظايا من الحمض النووي من الخرز بإضافة ميليلتر 32 10 مم تريس-HCl (pH 8) الخرز لحل الشظايا من الحمض النووي تبع القياس الكمي مطيافية الأشعة فوق البنفسجية/Vis.
ملاحظة: على الأقل 200 نانوغرام المسبق للتجارب التالية-
- "نهاية الإعدادية رد فعل"
ملاحظة: تتبع الشركة المصنعة ' s التعليمات وتعديلها حسب الحاجة. استخدام 30 نانوغرام من كفدنا؛ و 1 ميكروغرام من جدنا كعنصر التحكم. نغ- ميليلتر 7 إضافة رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر من هذا المزيج الإنزيم، 30 من كفدنا في أنبوب خالية نوكلاس عقيمة، وإضافة ddH 2 س إلى إجمالي حجم 60 ميليلتر. في أنبوب منفصل، أضف المكونات المذكورة أعلاه ولكن مع 1 ميكروغرام من جدنا بدلاً من كفدنا-
- ميكس واحتضان المخلوط في 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تليها 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في ثيرموسيكلير دون غطاء ساخنة. الشروع فورا في الخطوة التالية-
- "ربط محول"
- إضافة 30 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط و 1 ميليلتر من محسن ربط ميليلتر 4 محولات تسلسل فريدة من نوعها إلى الخليط من الخطوة 2، 2-
- إينكوباتي في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في ثيرموسيكلير دون غطاء تسخينها.
- دوامة ريسوسبيند المغناطيسي الخرز وترك الخرز في درجة حرارة الغرفة مدة 30 دقيقة على الأقل قبل الخطوة التالية-
- إضافة ميليلتر 87 من الخرز المغناطيسي ريسوسبينديد إلى الخليط المذكور آنفا؛ ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً واحتضان ثم في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5
- المياه والصرف الصحي والهواء الجاف الخرز كما هو موضح في "الخطوة 2، 1"-
- الوت الهدف الحمض النووي من الخرز بإضافة 20 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-
- شظايا من "الإثراء للحمض النووي" متصلة بمحول
- إضافة 20 ميليلتر من الحمض النووي المحول متصلة الأجزاء، 5 ميليلتر من الفهرس التمهيدي/i7 (2.5 ميليلتر التمهيدي-P7 (10:00 م) و 2.5 ميليلتر من التمهيدي-P5 (10:00 م)، لأغراض التسلسل)، 25µL من مكتبة التضخيم مزيج الرئيسي، و ddH 2 س إلى إجمالي حجم 50 ميليلتر.
- بكر تضخيم الحمض النووي المحول متصلة ودورة الحرارية كما يلي: تمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية ل 45 s، تليها 8 دورات (كفدنا) أو 4 دورات (جدنا) من الصلب درجة مئوية لمدة 15 ق، 65 درجة مئوية لمدة 30 ق، 72 درجة مئوية لمدة 30 s) ، وملحق نهائي في 72 درجة مئوية ل 60 s، ثم عقد درجة حرارة 4 درجة مئوية.
- ميليلتر 45 إضافة لتعليق الخرز المغناطيسي للحمض النووي المخصب PCR للحصول على شظايا المكتسبة.
- "الدنا الوت" شظايا مع محولات في 30 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-
- "مراقبة الجودة في مكتبة"
- تتبع الشركة المصنعة ' بروتوكول s للمجموعة التجارية لقياس محول متصلة تركيز الحمض النووي. استخدام بيواناليزير تحديد نوعية الحمض النووي-
3. استهدفت القبض على الحمض النووي
ملاحظة: إثراء الهدف أجرى باستخدام التقاط تسلسل مخصص-مسبار الذي صمم خصيصا لمنطقة تخصيب هدف 1021 كيلو بايت تغطي الطفرات المعروفة المرتبطة بورم برنامج التشغيل من 12 أنواع مختلفة من الأورام. تعديلات على الشركة المصنعة ' بروتوكول s هي مفصلة في الخطوات التالية-
- وقف
- إضافة 1.5 ميكروغرام تجميع المكتبات (الحد الأقصى لعدد من المكتبات إلى تجمع كفدنا هو 6، جدنا هو 20) من الخطوة 2، 8 ميليلتر من P5 Block(100P) و 8 ميليلتر من P7 Block(100P) 5 ميليلتر من "الحمض النووي" عند استخدام سرير-1 (1 ميكروغرام/ميليلتر) في أنبوب عقيم. الجاف لمحتويات الأنبوبة باستخدام مركز فراغ في 60 ° C.
- هيبريديزي القبض على الحمض النووي تحقيقات مع المكتبة.
- أضف المكونات التالية إلى الأنبوب من الخطوة 3.1: 8.5 ميليلتر 2 X التهجين العازلة، ميليلتر 2.7 محسن التهجين، وميليلتر 1.8 خالية نوكلاس ddH 2 أولمبيك
- مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في ثيرموميكسير عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10
- عقب الحضانة، فورا إضافة 4 ميليلتر "التحقيق مخصص". احتضان عينات في cycler حرارية في 65 & #176؛ ج مع غطاء تسخينها إلى 75 درجة مئوية ل 4 h.
- الحمض النووي وشظايا التقاط
- احتضان الهدف المهجن الحمض النووي مع الخرز streptavidin متبوعاً بالغسيل الخرز لإزالة الحمض النووي غير منضم. استخدم هذه المجموعة التجارية وفقا للشركة المصنعة ' s التعليمات للحصول على ميليلتر 20 نهائي من حبات حراكه مع الحمض النووي تم التقاطها وشظايا.
- تضخيم الحمض النووي تم التقاطها وشظايا
- "بكر أداء" التجاري باستخدام طقم مع 2 ميكرومتر العمود الفقري النوكليوتيد، وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s.
- تفاعل PCR عند اكتمال، إضافة ميليلتر 45 من الخرز مع وقف التنفيذ مباشرة إلى المنتج بكر وإثراء الشظايا من الحمض النووي الهدف تضخيم ملزمة الخرز شطف مع 30 ميليلتر من 10 ملم تريس-HCl (pH 8)-
- كمياً الشظايا من الحمض النووي مع مجموعة أدوات القياس الكمي المكتبة وتحديد طول جزء متوسط من بيواناليزير ( الشكل 2).
4-التسلسل
- تسلسل متعدد المكتبات باستخدام 75 شركة بريتيش بتروليوم نهاية الاقتران يعمل على المنظم benchtop 18 h. مجموع البيانات المنتجة هو يصل إلى 60 غيغا بايت، و 15 ز مطلوبة من أجل كفدنا عينة المريض وز 1 عنصر تحكم نموذج جدنا.
5-سير العمل في تحليل البيانات
ملاحظة: الرقم 3 يعرض عملية تحليل البيانات وتدفق العمل العام. تظهر المعلمات تحليل البيانات والأوامر أدناه.
- تصفية يقرأ منخفضة الجودة وتصحيح الأخطاء وإخفاء UID استخدام نكفيلتير-
NCfilter(own)
نكفيلتير تصفية-l 5-q 0.5-n 0.1-تي fastq1 3-G-1 fastq2-2
realSeq(own)
بيثون بن/ريلريلسيق fq1 ماسكويد-1 fq2-2-o الإخراج dir-p بادئة-ش 4-s 7-م 3-i أويدفيلي-ف. - المراجع hg19 المجين (الجينوم البشري 19)، حدد موقع النتائج التسلسل باستخدام mem التحالف (الإصدار 0.7.12-r1039) ومواءمة مع أدوات تحليل الجينوم (جتك) (الإصدار 3.4-46-gbc02625)-
التحالف mem-t 3 hg19 fastq1 fastq2
جافا-d64-خادم--XX: + أوسيباراليلجك--XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-
Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة
GenomeAnalysisTK.jar-T تارجيتريجيون-L hg19 ريليجنيرتارجيتكريتور-R-المعروف dbsnp —
اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nt 10-أنا كانسيربام-أنا نورمالبام
جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 إينديلريليجنير-R جرة GenomeAnalysisTK.jar-T-المعروف dbsnp
-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس — فترات تارجيتينتيرفالس--أنا كانسيربام--أنا نورمالبام - المجموعة المكررة حسب المعرف الفريد وموقف أجزاء القالب، التي سيتم تصحيح الخطأ عرضته بكر/تسلسل القواعد وتعديل نوعية قاعدة.
realSeq(own)
الكتلة بيثون ريلسيق/بن/ريلسيق-ب-ص unmarkdup_sort_merge.bam تشيبريجيون-س output_dir-ف
بادئة-م 6 - إعادة محاذاة التكرارات متفاوت المسافات من التحالف mem.
التحالف mem-t 3 hg19 fastq1 fastq2 - القيام بإعادة تنظيم محلي متبوعاً تقويم نقاط الجودة الأساسية باستخدام جاتك (الإصدار 3.4-46-gbc02625)-
التقويم Loacal: جافا-d64-خادم--XX: + أوسيباراليلجك--XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة GenomeAnalysisTK.jar-T ريليجنيرتارجيتكريتور-R hg19-L تارجيتريجيون-المعروف dbsnp-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nt 10 --كانسيربام-أنا نورمالبام
جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 جرة GenomeAnalysisTK.jar-T إينديلريليجنير-R-المعروف dbsnp-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-تارجيتينتيرفالس فترات-أنا كانسيربام--أنا نورمالبام
قاعدة نقاط الجودة تقويم: جافا-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-تارجيتريجيون-L hg19 باسيريكاليبراتور-R جرة GenomeAnalysisTK.jar-T- كنوونسيتيس dbsnp-كنوونسيتيس الكونية-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس-nct 10-أنا جافا الفايبرجلاس-س أم-d64-خادم-XX: + أوسيباراليلجك-XX: باراليلجكثريدس = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-جرة GenomeAnalysisTK.jar-T برينتريدس--أنا أم-بقسر الفايبرجلاس-س أووتبام hg19-R-nct 8-اللووبوتينتياليميسينكوديدقوالس - الهولندية (متغير واحد-النوكليوتيدات) والدعوة إينديل (الصغيرة عمليات الإدراج أو الحذف)، دقة الطفرات ذات التردد المنخفض أكد GSR (الدعم الجيد ما يلي) مع كل قراءة حبلا إلى الأمام وعكس أزواج والترشيح من خلال مجموعة المراقبة (germline الطفرات) وقاعدة بيانات خط الأساس-
realDcaller(own)
بيثون ريلدكالير-و hg19-r تشيبريجيون-ج باسيلينيدب-O-L كانسيربام 2 نورمالبام-ف 30 - استخدام عينات أساسية كعنصر تحكم للاتصال المسيحي (تباين عدد نسخ)-
NCcnv(own)
بيثون نككنف-س كنفدير-t tmpdir-r تشيبريجيون المسيحي-نورمجت نورمالبام-تومجت كانسيربام-ريبدب ريبيتمارسك - ريليجنيد غير معينة، مقاطع ويقرأ زوج المتنافرة لاستدعاء SV (تباين).
NCsv(own)
بيثون نكسف tmpdir-تي-آر hg19-س أووتبوتدير بواباث نسخة-س-ث-ن 4 نورمالبام كانسيربام
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
المسابر 1021 كيلو بايت المناطق المستهدفة المخصب يستخدم في ER-Seq ترد في الجدول 1، التي تغطي أكثر من 95% طفرات الجينات في 12 من الأورام الشائعة. مجموعة واسعة من هذه المسابر يجعل هذه العملية تنطبق على غالبية مرضى السرطان. بالإضافة إلى ذلك، لدينا محولات تسلسل فريدة من نوعها وفحص قاعدة بيانات خط الأساس جعلها ممكنة للكشف عن الطفرات النادرة تحديداً.
نظراً للخصائص المختلفة لجدنا وكفدنا المستخرجة من الدم المحيطي، هناك طائفة من نوعية البيانات، التي تتحدد بالأدوات المختلفة وضوابط الجودة هو مبين في الجدول 2. يجب عرض كفدنا بنجاح استخراج أقصى حجم لشركة بريتيش بتروليوم، كما تم تحليلها قبل بيواناليزير QC ~ 170 و هو مبين في الشكل 1. تشير الشظايا الكبيرة إلى التلوث من الحمض النووي، التي لا ينبغي أن تظهر في المنتج النهائي. الحمض النووي المستخرج من هذه العينة المريض كان يكفي النوعية والكمية ل ER-Seq (كفدنا-42.6 نغ؛ جدنا-3.426 ميكروغرام).
ثم اتسع نطاق التقاط الحمض النووي الهدف باستخدام مسبار مخصص واسطة PCR. تم تقييم حجم متوسط جزء من البيانات بيواناليزير وممثل كفدنا المريض في الشكل 2 (أ) أظهرت ذروتها حوالي 320 ~ بي بي، وفرقة فريدة من نوعها على [اغروس] هلام. يجب أن تظهر جدنا مسحه على [اغروس] هلام، كما هو مبين في الشكل 2. الصفات من كل المكتبات مقبولة لتسلسل اللاحقة.
بعد التسلسل، وقد تم تحليل البيانات بالترتيب وفقا لسير العمل في الشكل 3B. لتوضيح مميزات لدينا ER Seq مقابل الطريقة التقليدية، أجرينا كل التحاليل باستخدام نفس العينة. يتم إظهار النتائج من كل التحليلات في الجدول 3 و الجدول 4. لقد أظهرنا أن يحسن ER-Seq عمق التغطية قبل 23% بالمقارنة مع الطريقة التقليدية (الجدول 3، 3214.3 على ما يلي في ما يلي: 2475 مقابل ER-Seq في التحليل التقليدي)، الذي يرجع إلى انتعاشها تتسم بالكفاءة لجزيئات كفدنا، وبالتالي إلى حد كبير تعزيز تحليل الطفرات النادرة. من الواضح أيضا أن تمكين تسلسل فريد المحولات المستخدمة في ER-Seq التفريق السهل من الازدواجية الطبيعية وتلك التي يسببها بكر (الجدول 3، 0 PCR الناجم عن تكرار قراءة في ER-Seq). بالإضافة إلى ذلك، وجدنا في نتائج الاستدعاء أن التحليل القائم على ER-Seq 100% متسقة للكشف عن p.L858R EGFR وأن كان تواتر الكشف قليلاً أعلى (2.7% مقابل 1.2%) عند المقارنة مع التحليل التقليدي (الجدول 4). الأهم من ذلك، تحليل ER-Seq تمكين الكشف عن سائر الطفرات ذات التردد المنخفض نسبيا، بما في ذلك p.T790M EGFR (التباين تردد 0.53%) (الجدول 4)، وهذا لم يتم التعرف بالتحليل التقليدي بسبب ضجيج الخلفية عالية.
الشكل 1. كفدنا مراقبة الجودة "نتيجة لنجاح عزل" الممثل
للرسومات البيانية الأيسر، المحور X يظهر حجم جزء (bp) والمحور Y يشير إلى وحدات fluorescence النسبي (فو). الحجم الرئيسي من كفدنا هو ~ 170 شركة بريتيش بتروليوم وليست هناك أي أجزاء كبيرة من التلوث. هلام التفريد محاكاة يرد على الحق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. مثال للمكتبات بتحليل ومراقبة الجودة.
المحور X يظهر حجم جزء (bp) والمحور Y يشير إلى وحدات fluorescence النسبي (فو). وأبدى جل التفريد محاكاة على الحق في كل رسم بياني. (أ) عينة كفدنا المريض أظهر ذروة حادة بعد أنه تم تضخيمه مع محولات. (ب) أظهرت العينة جدنا تحكم الأجزاء الموزعة بشكل متساو مع لا ذروة حادة ولا انحياز إلى جانب واحد. كلا نماذج مقبولة لتسلسل اللاحقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. ER-Seq تدفق العمل.
(أ) تدفق العمل العامة. (ب) بيانات تحليل تدفق العمل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| exons 2735 من كل منطقة إكسون الجينات 70 | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | كيه | آسيا والمحيط الهادئ | AR | عارف | أجهزة الصراف الآلي |
| أية تي آر | أوركا | أوركب | AXL | BAP1 | BCL2 | براف | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | مصرف ليبيا المركزي | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | كركل | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | ذاكرة DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | أرج | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | فلكن |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | جناق | جناس |
| HDAC1 | HDAC4 | هجف | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
الجدول 1. 1021 كيلو بايت يسبر المناطق المستهدفة المخصب.
هذه المناطق تشمل: 2735 exons من الجينات 170؛ إينترونس ومناطق المروج ومناطق توقف من الجينات 24؛ 1122 exons من 847 الجينات ذات الصلة. وهذه تغطي أكثر من 95% الورم المتصلة بمواقع الطفرة المستهدفة والطفرات سائق من الأورام الأكثر شيوعاً 12 (سرطان الرئة، سرطان القولون والمستقيم، سرطان المعدة، سرطان الثدي، سرطان الكلي، سرطان البنكرياس، سرطان الكبد، سرطان الغدة الدرقية، وسرطان عنق الرحم، سرطان المريء، وسرطان بطانة الرحم).
| الحمض النووي | النتيجة | إشارة | مجموعة مثالية |
| كفدنا | حجم جزء | تحديد توزيع "جزء من الحمض النووي" | 168bp±20(a) |
| تركيز | تقدير حجم الحمض النووي أكثر دقة | مجموع ≥30ng(b) كفدنا | |
| جدنا | A260/A230 | تحديد الملوثات الكيميائية (مثل الإيثانول) | 1.50 – 2.2 |
| A260/A280 | تحديد الملوثات البروتين | 1.60-2.2 | |
| تركيز | تقدير حجم الحمض النووي | مجموع جدنا > 3ug |
الجدول 2. تحليل نوعية من كفدنا وجدنا المستخرجة من "الدم المحيطي".
أقصى حجم كفدنا حول 170Bp. ينبغي إجراء مراقبة الجودة بطريقة موحدة بيواناليزير 2100 لتحديد مستويات التلوث تدهور و/أو جدنا بعينه. يجب أن تظهر ذروة تحليل نوعية استخراج كفدنا مشابهة الشكل 1. علما بأن زيادة كمية الحمض النووي سيؤدي في مكتبة مع أعلى جودة لفعالية الكشف عن الطفرات النادرة في كفدنا. ونحن نوصي باستخدام على الأقل 30 نانوغرام كفدنا (000 30 نسخة).
الجدول 3. QC ER-Seq تحليل المعلومات وتحليل المعلومات التقليدية.
تسليط الضوء على اللون الرمادي الداكن يشير إلى حدوث زيادة عمق تغطية في ER-Seq مقارنة بالأساليب التقليدية؛ تسليط الضوء على ضوء رمادي يشير إلى لا بكر فعل القراءة المكررة في ما يليها ER الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الجينات | لجنة حقوق الإنسان | بدء تشغيل | نهاية | تشجفس | فجفس | الدالة | كاسيلتيشوت | ER-Seq var_freq | Var_freq التقليدية |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > ر | p.R249M | مغلطه | هيغفريق | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > ز | p.L858R | مغلطه | القابلة للتنفيذ | 0.0270 | 0.0120 |
| أجهزة الصراف الآلي | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | فراميشيفت | وفيات المواليد | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > ر | p.D951Y | مغلطه | وفيات المواليد | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > ر | p.T790M | مغلطه | القابلة للتنفيذ | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > ر | p.I744F | مغلطه | وفيات المواليد | 0-0036 | ——(0.0014) |
الجدول 4. نتيجة استدعاء ER-تسلسل المعلوماتهو، و "تحليل المعلومات التقليدية".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واكتشفت وجود تعميم الورم الحمض النووي (كتدنا) أكثر من 30 عاماً، لكن لا يزال غير روتينية في الممارسة السريرية من تطبيق تحليلات كتدنا. تزايد الاهتمام في التطبيق العملي لأساليب كتدنا مع تطوير تكنولوجيات للكشف عن كتدنا والتحليل. رصد الورم مع كتدنا يقدم نهجاً كسبها لتقييم الداء المتبقي مجهرية، استجابة للعلاج، وملامح الجزيئية الورم تحت خلفية الورم تطور و intratumoral التغايرية13، 14. وسيسهل التحسينات في الحساسية والنوعية لتحليل جميع هذه التطبيقات15،16.
وفي هذه المخطوطة، قدمنا ER-Seq، وسيلة واعدة تهدف إلى تحسين الحساسية للكشف عن كتدنا، باستخدام حالة NSCLC كمثال. وبالمقارنة مع التحليل التقليدي، تطبيق لدينا محولات تسلسل فريدة من نوعها في ER-Seq تحسنت بشكل ملحوظ حساسية وخصوصية، وأشارت إلى حدوث زيادة عمق تغطية وقدرة على الكشف عن الطفرات التردد المنخفض (مثل ف EGFR. T790M (0.53 في المائة)). وجود T790M في هذه العينة المريض قد يكون عاملاً مساهما في مقاومة ارلوتينيب، ويعطي نظرة ثاقبة كيفية أفضل علاج هذا المريض، مما يشير إلى استخدام مثبط EGFR الجيل الثالث محددة من أجل T790M، مثل AZD929117-20. آخر نقطة حرجة في ER-Seq يسهم بحساسية وخصوصية هو فحص قاعدة بيانات خط الأساس، مما يسهل الكشف عن دقة منخفضة التردد الطفرات في كتدنا عن طريق تصفية ضجيج الخلفية.
وبالرغم من ER-Seq العديد من المزايا التي تجعلها متفوقة على الطرق التقليدية، إلا أنه لا تزال هناك بعض التحديات التي يجب التغلب عليها. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه ER-Seq هو مستوى منخفض للغاية من كتدنا الموجودة في الدم. لهذه الطفرات منخفضة التردد، اقتناء كافية قالب كتدنا أمر بالغ الأهمية. لدينا محولات فريدة من نوعها إلى حد كبير زيادة معدل إعادة تدوير كتدنا، على الرغم من أنها لا تزال بحاجة إلى تحسين. تحد آخر ER Seq، وجميع التقنيات الأخرى التسلسل، هو الحد تغطية المناطق المستهدفة. لدينا التحقيق المحدد 1021 كيلو بايت أثري المناطق، التي يمكن أن تغطي حوالي 95% طفرات المتصلة بالورم، هي أكثر شمولاً بالمقارنة مع سائر أساليب الطائرة الصغيرة21،،من2223. بيد التغايرية الورم قد اعترف جيدا وتم اكتشاف المزيد والمزيد من المؤشرات الحيوية الورم، معدل التغطية النسبية لنا المسابير أثري النقصان المناطق. لتقديم خدمة أفضل كأداة للتشخيص المبكر ورصد الأمراض من مرضى الأورام، هناك حاجة إلى تقنيات التسلسل وتحليل أكثر شمولاً. في الوقت الراهن، ER-Seq لا تزال تعتمد على حجم كبير من البيانات للكشف عن الطفرات ذات التردد المنخفض. مواصلة تحسين الاستفادة من البيانات يمكن أن تكون ملائمة لتطبيق ما يليها ER
كما نوقش أعلاه، توجد العديد من القيود المقترنة ER-Seq. ومع ذلك، لدينا أسلوب تحليل فريدة لا يزال لديه العديد من المزايا مقارنة مع غيرها من أساليب كبار في هذا الميدان. إيجابيات وسلبيات هذه التقنية تستحق المزيد من البحث. إمكانات ER-Seq للاستخدام السريري الروتيني ستكون ذات أهمية كبيرة للأطباء السريرية، وتزويدهم بأداة قوية لتشخيص الأورام ومراقبة ديناميات الورم واستجابة للعلاج. رواية الطفرات المرتبطة بمقاومة للعلاج التقليدي والمستهدفة وجدت حسب تحليلنا قد توفر سبلاً جديدة لعلاج مرضى السرطان مرض متقدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل معهد جينيبلوس – بكين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
