अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर CtDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगाने
Summary
इस पांडुलिपि ctDNA, एर-Seq में कम आवृत्ति के उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस विधि दो के अपने अद्वितीय उपयोग-दिशात्मक त्रुटि सुधार, एक विशेष पृष्ठभूमि फिल्टर, और कुशल आणविक अधिग्रहण से अलग है ।
Abstract
परिचालित ट्यूमर डीएनए का विश्लेषण (ctDNA) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग (NGS) नैदानिक ऑन्कोलॉजी के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है. हालांकि, इस विधि के आवेदन रक्त में ctDNA की ट्रेस मात्रा का विश्लेषण करने में अपनी कम संवेदनशीलता के कारण चुनौतीपूर्ण है । इसके अलावा, विधि झूठी सकारात्मक और नकारात्मक परिणाम इस अनुक्रमण और बाद के विश्लेषण से उत्पन्न हो सकता है । व्यवहार्यता और क्लिनिक में ctDNA का पता लगाने की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यहाँ हम अनुक्रमण के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों को समृद्ध करती है, जो एक तकनीक मौजूद है, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध. एर Seq 1 x 107 वंय प्रकार न्यूक्लियोटाइड है, जो यह एक आशाजनक उपकरण के लिए अत्यंत कम आवृत्ति आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने और इस प्रकार के अध्ययन में बहुत उपयोगी हो जाएगा से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन भेद कर सकते है रोग heterogenicity । अद्वितीय sequencing एडाप्टर के बंधाव के आधार पर, इस विधि से ctDNA अणुओं की एक कुशल वसूली सक्षम बनाता है, जबकि एक ही समय में त्रुटियों के लिए सुधारना-द्विता (भावना और antisense). हमारा चयन १०२१ kb जांच के लक्ष्य क्षेत्रों है कि 12 ट्यूमर में ट्यूमर से संबंधित चालक उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर की माप को समृद्ध करता है । इस लागत प्रभावी और सार्वभौमिक विधि आनुवंशिक डेटा का एक अनूठा सफल संचय सक्षम बनाता है । के बाद कुशलता से बाहर पृष्ठभूमि त्रुटि फ़िल्टरिंग, एर seq ठीक दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगा सकते हैं । एक मामले का अध्ययन का उपयोग करना, हम एक विस्तृत जांच डिजाइन, पुस्तकालय निर्माण का प्रदर्शन प्रोटोकॉल वर्तमान, और लक्ष्य डीएनए कैप्चर के तरीके, जबकि भी डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह शामिल है । इस विधि को ले जाने के लिए प्रक्रिया सामान्यतया 1-2 दिन लेता है ।
Introduction
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS), जीनोम के रहस्यों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण, आनुवंशिक परिवर्तन प्रकट हो सकता है, जो जानकारी की एक बड़ी मात्रा में प्रदान कर सकते हैं । क्लिनिक में NGS विश्लेषण के आवेदन विशेष रूप से व्यक्तिगत चिकित्सा के लिए, अधिक आम हो गया है । NGS की सबसे बड़ी सीमाओं में से एक, तथापि, एक उच्च त्रुटि दर है । हालांकि यह विरासत में मिला उत्परिवर्तनों के अध्ययन के लिए उपयुक्त समझा जाता है, दुर्लभ उत्परिवर्तनों के विश्लेषण बहुत1,2सीमित है, खासकर जब एक “तरल बायोप्सी” से प्राप्त डीएनए का विश्लेषण ।
ट्यूमर डीएनए (ctDNA) परिचालित ट्यूमर कोशिकाओं से बहाया जाता है कि रक्त में सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) है । ज्यादातर मामलों में, ctDNA की मात्रा बेहद कम है, जो इसका पता लगाने और विश्लेषण बहुत चुनौतीपूर्ण बनाते हैं । हालांकि, ctDNA कई आकर्षक विशेषताएं हैं: इसका अलगाव न्यूनतम इनवेसिव है, यह ट्यूमर के विकास के प्रारंभिक दौर में पता लगाया जा सकता है, ctDNA स्तर चिकित्सकीय दक्षता को दर्शाता है, और ctDNA दोनों प्राथमिक और मेटास्टेटिक घावों में पाया डीएनए उत्परिवर्तनों शामिल 3 , 4 , 5. इसलिए, NGS तकनीक और विश्लेषण के तेजी से विकास को देखते हुए, ctDNA का पता लगाने के आवेदन और अधिक आकर्षक हो गया है ।
विभिन्न बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण दृष्टिकोण ctDNA का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया है लेकिन इन तरीकों में से कोई भी उनकी सीमाओं के कारण क्लीनिक में नियमित उपयोग के लिए स्वीकार किया गया है: कम संवेदनशीलता, बहुमुखी प्रतिभा की कमी है, और एक अपेक्षाकृत उच्च लागत6 ,7,8. उदाहरण के लिए, डुप्लेक्स अनुक्रमण, एक अनन्य पहचानकर्ता टैग (UID) के आधार पर, बार-बार आम सहमति में त्रुटियों को सुधारता है, अधिकांश sequencing त्रुटियों को सुधारने । हालांकि, इस पद्धति की व्यवहार्यता अपनी उच्च लागत और कम डेटा के उपयोग के कारण9,10खो दिया है । इसी प्रकार, छाया-Seq और इसके सुधारात्मक पुनरावृत्ति, छाया-इडस11,12, cfDNA डिटेक्शन में अधिक से अधिक व्यावहारिकता है, हालांकि इन पद्धतियों की सटीकता और सार्वभौमिकता में सुधार की आवश्यकता है ।
सटीक ctDNA का पता लगाने और विश्लेषण के लिए वर्तमान की जरूरत को पूरा करने के लिए, हम एक नई रणनीति विकसित, दुर्लभ उत्परिवर्तन अनुक्रमण (एर-Seq) को समृद्ध । यह प्रकिया निम्न को संयोजित करता है: अद्वितीय sequencing एडाप्टर ctDNA अणुओं को कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त करने के लिए, द्वि-दिशा त्रुटि सुधार और & #62 से बाहर एक एकल उत्परिवर्तन को अलग करने की क्षमता के साथ; 1 × 107 वाइल्ड-टाइप न्यूक्लियोटाइड; १०२१ kb की जांच जो लक्ष्य क्षेत्रों है कि ट्यूमर से संबंधित उत्परिवर्तनों के ९५% से अधिक कवर के माप को समृद्ध 12 ट्यूमर, फेफड़ों के कैंसर सहित, कोलोरेक्टल कैंसर, गैस्ट्रिक कैंसर, स्तन कैंसर, गुर्दे के कैंसर, अग्नाशय के कैंसर, लीवर कैंसर, थायराइड कैंसर, गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर, कैंसर, और एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा (तालिका 1); और आधारभूत डाटाबेस यह कुशल और ठीक ctDNA में दुर्लभ उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए आसान बनाने स्क्रीनिंग ।
एक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण, एर द्वारा सभी जीन उत्परिवर्तनों-Seq नमूनों की एक ही प्रकार के एक नंबर से मिल (~ १००० शुरुआत में) । इन वास्तविक उत्परिवर्तनों कई अंय विश्वसनीय जांच तरीकों और विश्लेषण से सत्यापित किया जाना चाहिए । अगले, झूठी उत्परिवर्तनों और क्लस्टर सभी झूठी उत्परिवर्तनों के पैटर्न को संक्षिप्त करने के लिए प्रारंभिक आधारभूत डाटाबेस का निर्माण । झूठी उत्परिवर्तनों इस डाटाबेस को अनुवर्ती अनुक्रमण प्रयोगों से पाया जोड़ने जारी है । इसलिए, यह आधार रेखा डेटाबेस गतिशील विस्तारित डेटाबेस, जो काफी sequencing सटीकता में सुधार करता है हो जाता है ।
ट्यूमर निदान और निगरानी में प्रगति को बढ़ावा देने के लिए, हम वर्तमान एर-Seq, सार्वभौमिक डेटा के अधिग्रहण के लिए एक कम लागत और व्यवहार्य विधि । हम एक मामले का अध्ययन है जो ईआर-Seq विश्लेषण से गुजरा, क्लिनिक में उपयोग के लिए दुर्लभ उत्परिवर्तनों और व्यवहार्यता का पता लगाने के लिए अपनी सटीकता का प्रदर्शन ।
Protocol
ट्यूमर नमूनों और रक्त के नमूनों को पेकिंग विश्वविद्यालय के पीपुल्स & #39; एस अस्पताल की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के अनुसार प्राप्त किया गया. मरीजों से उनके नमूनों का उपयोग करने के लिए ?…
Representative Results
Discussion
परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) के अस्तित्व से अधिक 30 साल पहले की खोज की थी, लेकिन ctDNA विश्लेषण के आवेदन अभी भी नैदानिक अभ्यास में नियमित नहीं है । ctDNA तरीकों के व्यावहारिक अनुप्रयोग में ब्याज ctDNA का पता लगाने और ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम Geneplus द्वारा समर्थित है-बीजिंग संस्थान ।
Materials
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
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