Summary
Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.
Abstract
De analyse van de circulerende tumor DNA (ctDNA) met behulp van de volgende generatie sequencing (NGS) uitgegroeid tot een waardevol instrument voor de ontwikkeling van klinische oncologie. De toepassing van deze methode is echter uitdagend vanwege de lage gevoeligheid in het analyseren van de trace hoeveelheid ctDNA in het bloed. De methode kan bovendien valse positieve en negatieve resultaten genereren uit deze sequencing en de daaropvolgende analyse. Ter verbetering van de haalbaarheid en de betrouwbaarheid van ctDNA detectie in de kliniek, presenteren hier we een techniek die zeldzame mutaties voor het rangschikken, verrijken zeldzame mutatie Sequencing (ER-Seq verrijkt). ER-Seq kunt onderscheiden een enkele mutatie uit 1 x 107 wild-type nucleotiden, die het maakt een veelbelovend instrument te detecteren van genetische wijzigingen van de extreem lage frequentie en dus zeer nuttig bij het bestuderen van de ziekte heterogenicity zal zijn. Op grond van de adapter van de unieke sequencing afbinding laat deze methode een efficiënt herstel van ctDNA moleculen, terwijl bij de dezelfde tijd corrigeren voor fouten bidirectionally (betekenis en antisense). Onze selectie van 1021 kb sondes verrijkt de meting van doelregio's die betrekking hebben op meer dan 95% van de tumor-gerelateerde stuurprogramma mutaties in 12 tumoren. Deze kosteneffectieve en universele methode kan een uniek succesvolle accumulatie van genetische gegevens. Na het efficiënt filteren achtergrond fout, kan ER-seq juist zeldzame mutaties detecteren. Met behulp van een case study, presenteren we een gedetailleerd protocol demonstreren sonde ontwerp, bouw van de bibliotheek, en target DNA vangen methodologieën, terwijl ook de data-analyse-workflow. Het proces uit te voeren deze methode meestal duurt 1-2 dagen.
Introduction
Volgende-generatie sequencing (NGS), een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van de mysteries van het genoom, bieden een grote hoeveelheid informatie die genetische veranderingen onthullen kan. De toepassing van NGS analyse in de kliniek heeft meer gemeengoed, vooral voor gepersonaliseerde geneeskunde geworden. Een van de grootste beperkingen voor NGS, is echter een hoge foutenpercentage. Hoewel dit geschikt voor studeren erfelijke mutaties wordt geacht, is de analyse van zeldzame mutaties sterk beperkt1,2, vooral wanneer een "vloeibare biopsie" analyseren DNA verkregen.
Circulerende tumor is DNA (ctDNA) DNA cel-vrij (cfDNA) in het bloed dat van tumorcellen vergoten. In de meeste gevallen is de hoeveelheid ctDNA extreem laag, waardoor de detectie- en analysemethoden zeer uitdagend. CtDNA heeft echter vele aantrekkelijke kenmerken: de isolatie is minimaal invasieve, dit kan worden gedetecteerd in de vroege stadia van tumorgroei, het ctDNA niveau weerspiegelt therapeutische efficiëntie en ctDNA bevat DNA mutaties gevonden in zowel de primaire als de metastatische laesies 3 , 4 , 5. Daarom, gezien de snelle ontwikkeling van de techniek van het NGS en analyse, de toepassingvan ctDNA detectie geworden aantrekkelijker.
Verschillende massaal parallelle sequencing benaderingen hebben gebruikt voor de detectie van de ctDNA maar geen enkele van deze benaderingen hebben al geaccepteerd voor routinegebruik in klinieken als gevolg van hun beperkingen: lage gevoeligheid, gebrek aan veelzijdigheid en een relatief hoge kosten6 ,7,8. Bijvoorbeeld, corrigeert dubbelzijdig sequencing, op basis van een unieke identificatiecode (UID), herhaaldelijk fouten in de consensus bidirectionally, sequencing van de meeste fouten te verhelpen. De haalbaarheid van deze methode is echter verloren vanwege de hoge kosten en lage gegevens gebruik9,10. Evenzo wel CAPP-Seq en haar betere iteratie, IDES-CAPP11,12, grotere bruikbaarheid detectie van de cfDNA, de nauwkeurigheid en de universaliteit van deze methoden moeten worden verbeterd.
Om te voldoen aan de huidige behoefte aan nauwkeurige ctDNA detectie- en analysemethoden, ontwikkelden we een nieuwe strategie, verrijken zeldzame mutatie Sequencing (ER-Seq). Deze aanpak combineert het volgende: unieke sequencing adapters efficiënt herstellen ctDNA moleculen, met bidirectionele foutcorrectie en de mogelijkheid om te onderscheiden van een enkele mutatie van > 1 × 107 wild-type nucleotiden; 1021 kb sondes die een verrijking van de meting van doelregio's die betrekking hebben op meer dan 95% van de tumor-gerelateerde mutaties van 12 tumoren, met inbegrip van longkanker, darmkanker, maagkanker, borstkanker, nierkanker, pancreatic kanker, leverkanker, schildklierkanker, baarmoederhalskanker, slokdarmkanker en endometrium carcinoom (tabel 1); en basislijn database screening waardoor het efficiënt en gemakkelijk te ontdekken juist zeldzame mutaties in ctDNA.
Om te bouwen van een basislijn-database, vinden alle genmutaties door ER-Seq van een aantal soortgelijke monsters (~ 1000 aan het begin). Deze echte mutaties moeten worden geverifieerd door verscheidene andere betrouwbare detectiemethoden en analyse. Vervolgens het patroon van valse mutaties samenvatten en cluster alle valse mutaties om te bouwen van de eerste basislijn-database. Doorgaan met het toevoegen van valse mutaties gevonden uit latere sequencing experimenten naar deze database. Daarom wordt deze basislijn-database een dynamische uitgebreide database, die aanzienlijk verbetert de nauwkeurigheid van de sequencing.
Ter bevordering van de vooruitgang in de tumor diagnose en toezicht, presenteren we ER-Seq, een low-cost en haalbare methode voor de verwerving van universele gegevens. We presenteren een case study die onderging ER-Seq analyse, demonstreren de juistheid ervan voor het opsporen van zeldzame mutaties en haalbaarheid voor gebruik in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
specimens van de tumor en bloedmonsters werden verkregen volgens een protocol goedgekeurd door de ethische commissie van Peking University mensen ' s ziekenhuis. Schriftelijke geïnformeerde toestemming was verkregen van de patiënten te gebruiken hun monsters. Deelnemers werden vertoond volgens de volgende criteria: vrouw, geavanceerde Non-Small Cell Lung Cancer, EGFR p.L858R mutatie aangegeven door de vorige Sanger Sequencing, progressie van de ziekte na twee zitting van EGFR gerichte therapie met Erlotinib, en ER-Seq die is toegepast op de ctDNA te analyseren van de oorzaak van de weerstand en het vinden van nieuwe doel drugs.
1. DNA-extractie uit perifeer bloed voor cfDNA en genomic DNA (gDNA)
- verzamelen van 10 mL van perifeer bloed in de buis van een collectie, omkeren zachtjes op en neer 6 - 8 keer te mengen. Vermijd het scheren van de cel. Bloedmonsters kunnen worden opgeslagen in de collectie buis bij 6-37 ° C voor maximaal 72 uur.
- Centrifugeren van de buis van de collectie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 1600 (±150) x g.
- Overbrengen van de bovendrijvende substantie (plasma) uit de collectie buis naar vier schoon 2 mL adequaat geëtiketteerd centrifuge buizen met behulp van een wegwerp pipet zonder verstoring van de pellet laag (witte bloedcellen).
- Transfer1 mL van de cellen met behulp van een schone Wegwerp pipet een 2 ml adequaat geëtiketteerd centrifugebuis. De cellen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C of kouder vóór stap 1.8.
- Centrifugeren van het plasma (uit stap 1.3) voor 10 min bij 4 ° C en 16000 (±150) x g.
- Transfer het plasma schoon centrifuge buizen correct geëtiketteerd als " plasma ", laat ~0.1 mL restvolume onderaan om verontreiniging te voorkomen. Bewaren van de plasma-80 ° c tot stap 1.7.
- 3 mL plasma uit stap 1.6 kunt isoleren cfDNA (bevat ctDNA) met behulp van een commercieel beschikbare kit, na de fabrikant ' s instructies.
- Gebruik 200 µL van witte bloedcellen uit stap 1.3 te isoleren met behulp van een commercieel beschikbare kit, na de fabrikant gDNA ' s instructies.
Opmerking: Beide cfDNA en gDNA kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C vóór gebruik. - Toepassen verschillende kwaliteitscontroles voor cfDNA en gDNA (tabel 2). Kwaliteitscontrole uitvoeren door een gestandaardiseerde methode voor de bioanalyzer om te bepalen van de niveaus van de afbraak van de steekproef en/of gDNA besmetting. Piek analyse van de kwaliteit van cfDNA extractie moet lijken op Figuur 1.
Opmerking: De grootte van de piek van de cfDNA is ongeveer 170 bp. opmerking dat verhogen van de hoeveelheid DNA in een hogere kwaliteit-bibliotheek voor de doeltreffende opsporing van zeldzame mutaties in cfDNA resulteren zal. We raden ten minste 30 ng cfDNA (30.000 exemplaren).
2. Bibliotheek voorbereiding
Opmerking: met betrekking tot de bouw van de base bibliotheek van gefragmenteerde DNA, cfDNA bestaat uit fragmenten met een piek grootte ~ 170 bp en hoeft dus niet te worden gefragmenteerd.
- Fragment het besturingselement monster (gDNA) met het ultrasoonapparaat te verkrijgen van 200-250 bp fragmenten.
- Bereiden 1 µg voor gDNA sample in 100 µL van Tris-EDTA-buffer in een buis schoon ultrasoonapparaat.
- Het ultrasoonapparaat programma instellen als 30 s op en 30 s uit voor 12 cycli voor een totaal van 12 min.
- Na ultrasoonapparaat, bevestigen het product (5 µL) bevat 200-250 bp fragmenten door het uitvoeren van een analyse met 2% agarose gel.
- Overbrengen van alle fragmentatie producten naar een nieuwe 1,5 mL-buis en incubeer met 150 µL van magnetische kralen voor 5 min om te selecteren van de juiste fragmenten.
- De bovendrijvende vloeistof verwijderen door de buis op een magnetische rek voor 30 s.
- Wassen de kralen met 200 µL van 80% ethanol (vers bereid) met de buis op het magnetische rek te blijven. Incubeer gedurende 30 s voordat u het supernatant verwijdert. Eenmaal herhaald.
- Lucht drogen de kralen met de buis deksel open tijdens uw verblijf op het magnetische rek. Vermijd overdried kralen om ervoor te zorgen dat het doel van DNA goed herstelt. Elueer DNA-fragmenten uit de kralen door 32 µL van 10 mM Tris-HCl (pH 8) toe te voegen aan de parels om te lossen van de DNA-fragmenten gevolgd door kwantificering van UV/Vis-spectroscopie.
Opmerking: minstens 200 ng is nodig voor de volgende experimenten.
- Einde Prep reactie
Opmerking: Volg fabrikant ' s instructie en wijzig waar nodig. Gebruik 30 ng van cfDNA; en 1 microgram van gDNA als het besturingselement.- Toevoegen 7 µL van reactie buffer, 3 µL van het enzym mix, 30 ng van cfDNA in een steriele nuclease-gratis buis, en ddH 2 O aan de totale hoeveelheid 60 µL toevoegen. In een aparte buis, de bovenstaande componenten toevoegen maar met 1 microgram van gDNA in plaats van cfDNA.
- Mix en Incubeer het mengsel bij 20 ° C gedurende 30 minuten gevolgd door 65 ° C gedurende 30 minuten in een thermocycler zonder het deksel verwarmd. Ga direct naar de volgende stap.
- Adapter afbinding
- toevoegen 30 µL van de afbinding master mix, 1 µL van de afbinding enhancer en 4 µL van de unieke sequencing-adapters aan het mengsel uit stap 2.2.
- Incubate bij 20 ° C gedurende 15 min. in een thermocycler zonder het deksel verwarmd.
- Vortex resuspendeer de magnetische kralen en laat u de kralen bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten voor de volgende stap.
- Voeg 87 µL van de geresuspendeerde magnetische kralen aan de eerder genoemde mengsel; meng goed door pipetteren omhoog en omlaag en vervolgens uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
- Wassen en lucht drogen de parels zoals beschreven in stap 2.1.
- Elueer de DNA-doelstelling van de kralen door toevoegen van 20 µL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Verrijking van DNA-fragmenten afgebonden met adapter
- toevoegen 20 µL van adapter afgebonden DNA fragmenten, 5 µL van Index Primer/i7 (2,5 µL Primer-P7 (10 pM) en 2,5 µL van Primer-P5 (10 pM), voor sequencing doeleinden), 25µL van bibliotheek amplificatie master mix en ddH 2 O tot een totaal volume van 50 µL.
- PCR versterken de adapter afgebonden DNA en thermische cyclus als volgt: eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 45 s, gevolgd door 8 cycli (cfDNA) of 4 cycli (gDNA) van het gloeien ° C gedurende 15 s, 65 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s) , en de uiteindelijke extensie bij 72 ° C gedurende 60 s, dan houdt de temperatuur bij 4 ° C.
- Toevoegen 45 µL van zwevende magnetische kralen aan de DNA PCR-verrijkt om verworven fragmenten.
- Elueer DNA fragmenten met adapters in 30 µL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- De controle van de kwaliteit van de bibliotheek
- Volg de fabrikant ' s-protocol voor de commerciële kit voor het meten van de adapter afgebonden DNA-concentratie. Gebruik de bioanalyzer om te bepalen van de kwaliteit van de DNA.
3. Gerichte DNA vastleggen
Opmerking: Target verrijking werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste volgorde vastleggen-sonde die speciaal bedoeld is voor een 1021 kb doel verrijking regio die betrekking hebben op bekende tumor-geassocieerde stuurprogramma mutaties van 12 verschillende soorten tumoren. Wijzigingen aan de fabrikant ' s-protocol worden beschreven in de volgende stappen uit.
- Toevoegen 1,5 µg blokkeren bibliotheken te bundelen (maximum aantal bibliotheken aan adresgroep voor cfDNA is 6, gDNA 20) uit stap 2, 8 µL van P5 Block(100P), 8 µL van P7 Block(100P) en 5 µL van Cot-1 DNA (1 µg/µL) in een steriele buis. Droog de inhoud van de tube met behulp van een vacuüm concentrator ingesteld op 60 ° C.
- Hybridize de opname van DNA-sondes met de bibliotheek.
- Voeg de volgende onderdelen aan de buis uit stap 3.1: 8,5 µL van 2 X kruising buffer, 2.7 µL van hybridisatie enhancer, en 1,8 µL van ddH nuclease-gratis 2 O.
- Mix door pipetteren op en neer en broeden in een thermomixer bij 95 ° C gedurende 10 minuten
- Na incubatie, voeg onmiddellijk 4 µL van de aangepaste sonde. Incubeer monsters in een thermische cycler op 65 & #176; C met deksel verwarmd tot 75 ° C gedurende 4 h.
- DNA fragmenten vastleggen
- broeden gehybridiseerde doelDNA met daar kralen gevolgd door het wassen van de kralen als u wilt verwijderen niet-afhankelijke DNA. Gebruik de commerciële kit volgens fabrikant ' s instructies om een definitieve 20 µL van de geresuspendeerde kralen met vastgelegde DNA fragmenten.
- Versterking van de vastgelegde DNA fragmenten
- uitvoeren van PCR met behulp van de commerciële kit met 2 µM ruggengraat oligonucleotides, volgens fabrikant ' s instructies.
- Wanneer de PCR reactie is voltooid, 45 µL van zwevende kralen rechtstreeks toevoegen aan het PCR product en verrijken van de versterkte target-DNA-fragmenten gebonden aan de kralen door elutie met 30 µL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Kwantificeren van de DNA-fragmenten met de library kwantificering kit en het bepalen van de lengte van de gemiddelde fragment door het Bioanalyzer ( Figuur 2).
4. sequencing
- reeks multiplexed bibliotheken met behulp van 75 bp gekoppeld-end runs op een benchtop sequencer voor 18 h. totale geproduceerde gegevens maximaal 60 Gigabytes is, 15 G is vereist voor patiënt monster cfDNA en 1G voor controle monster gDNA.
5. data analyse werkstroom
Opmerking: Figuur 3 toont de algemene stroom en data analyse werkproces. Data analyse gebruikte parameters en opdrachten staan hieronder.
- Filteren van lage kwaliteit leest en corrigeren voor fouten en maskeren van UID met behulp van NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filteren -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o output dir -p voorvoegsel -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f. - Referencing genoom hg19 (menselijk genoom 19), zoek de resultaten van de sequencing met behulp van de BWA (versie 0.7.12-r1039) mem en uitlijnen met genoom analyse Toolkit (GATK) (versie 3.4-46-gbc02625).
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-bekend dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - ik cancerBam-ik normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp bekend
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervallen-ik cancerBam-ik normalBam - Cluster de duplicaten volgens de UID en de positie van de sjabloon fragmenten, die de fout bases geïntroduceerd door PCR/sequentiebepaling en wijzigen van de basis kwaliteit zal corrigeren.
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq CLUSTER -b unmarkdup_sort_merge.bam - o chipRegion -o output_dir -p
-m 6 voorvoegsel - opnieuw uitlijnen de geclusterde duplicaten door BWA mem.
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - uitvoeren van een lokale herschikking, gevolgd door een herijking van de score van de basis kwaliteit met behulp van GATK (versie 3.4-46-gbc02625).
Loacal herschikking: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-bekend dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Ik cancerBam-ik normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals bekend intervallen-ik cancerBam-ik normalBam
basis-kwaliteitsscore herijking: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kosmische - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ik bam -o grp java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T jar PrintReads-ik bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - voor SNV (single-nucleotide variant) en INDEL (kleine invoegingen of verwijderingen) telefoneren, wordt de nauwkeurigheid van de lagefrequentie-mutaties verder bevestigd door GSR (goede ondersteuning leest) met beide voorwaartse en omgekeerde onderdeel Lees pairs en filtratie door middel van de controlegroep (germline mutaties) en de database van de basislijn.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - basislijn monsters gebruiken als een besturingselement voor CNV (kopie nummer variatie) roeping.
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv normgt--normalBam--tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk - Realigned unmapped, clips en disharmonische paar leest Bel SV (structurele variaties).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - o hg19 -o outputdir - x transcript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 1021 kb sondes verrijkt doelregio's gebruikt in de ER-Seq staan vermeld in tabel 1, welke boekomslagen meer dan 95% van de genmutaties in 12 gemeenschappelijke tumoren. Het brede scala van deze sondes maakt dit proces van toepassing voor een meerderheid van kankerpatiënten. Bovendien, maken onze unieke sequencing adapters en basislijn database screening het mogelijk te detecteren zeldzame mutaties juist.
Als gevolg van de verschillende eigenschappen van de gDNA en cfDNA geëxtraheerd uit perifeer bloed, is er een scala aan de kwaliteit van de gegevens, die wordt bepaald door de verschillende instrumenten en kwaliteitscontroles in tabel 2aangegeven. Succesvol uitgepakte cfDNA moet de grootte van een piek van ~ 170 bp, als geanalyseerd door de bioanalyzer QC en getoond in Figuur 1weergegeven. Grote glasscherven geven verontreiniging van genomic DNA, die niet in het eindproduct moet verschijnen. DNA geëxtraheerd uit deze patiënt monster was van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng; gDNA - 3.426 µg).
Doel DNA vastleggen met behulp van een aangepaste sonde werd vervolgens versterkt door PCR. De gemiddelde fragment grootte werd beoordeeld door de gegevens van het bioanalyzer en vertegenwoordiger voor een patiënt cfDNA in figuur 2A toonden een piek rond ~ 320 bp en een unieke band op agarose gel. gDNA moet worden weergegeven als een uitstrijkje op een agarose gel, zoals weergegeven in figuur 2B. De kwaliteiten van beide bibliotheken waren voor de latere sequencing uitbouw aanvaardbaar.
Na sequencing, was de gegevens geanalyseerd in volgorde volgens de workflow in figuur 3B. Ter illustratie van de voordelen van onze ER-Seq ten opzichte van de traditionele methode, wij beide analyses met behulp van hetzelfde monster uitgevoerd. Resultaten van beide analyses worden weergegeven in tabel 3 en tabel 4. We toonden dat ER-Seq dekking diepte met 23 verbetert % in vergelijking met de traditionele methode (tabel 3, 3214.3 leest in ER-Seq vs 2475 leest in traditionele analyse), die te wijten aan haar efficiënt herstel van cfDNA moleculen, dus sterk was het verbeteren van de analyse van zeldzame mutaties. Het is ook duidelijk dat de unieke sequencing adapters gebruikt in ER-Seq eenvoudig differentiatie van natuurlijke en PCR-geïnduceerde duplicaties inschakelen (tabel 3, 0 PCR geïnduceerde gedupliceerd Lees in ER-Seq). Daarnaast vonden we in de aanroepende resultaten dat analyse op basis van ER-Seq 100% consistente voor EGFR p.L858R detectie was en dat de frequentie van detectie een beetje hoger (2,7% vs 1,2%) wanneer was vergeleken met traditionele analyse (tabel 4). Nog belangrijker is, ER-Seq analyse ingeschakeld voor de opsporing van andere mutaties van de relatief lage-frequentie, met inbegrip van EGFR p.T790M (variatie frequentie 0,53%) (Tabel 4), en dit werd niet erkend door traditionele analyse als gevolg van hoge achtergrondruis.
Figuur 1. Representatieve QC resultaat van succesvol geïsoleerde cfDNA
Voor de linker grafieken, de X-as geeft fragment grootte (verder bp) en de Y-as geeft de relatieve fluorescentie eenheden (FU's). De primaire grootte van cfDNA is ~ 170 bp en er zijn geen grote glasscherven besmetting. Een gesimuleerde Elektroforese van het gel wordt weergegeven aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Voorbeeld van bibliotheken QC geanalyseerd.
De X-as geeft de grootte van het fragment (bp) en de Y-as geeft de relatieve fluorescentie eenheden (FU's). Een gesimuleerde Elektroforese van het gel werd getoond aan de rechterkant van elke grafiek. (A) patiënten cfDNA monster een scherpe piek toonde nadat het werd versterkt met adapters. (B) gDNA controlemonster toonde gelijkmatig verdeelde fragmenten met geen scherpe piek en geen bias naar één kant. Beide monsters waren acceptabel voor het latere rangschikken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. ER-Seq werk Flow.
(A) algemene workflow. (B) Data analyse werkstroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 2735 exons uit alle regio's de exon van 70 genen | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabel 1. 1021 kb sondes verrijkt doelregio's.
Deze regio's opgenomen: 2735 exons van 170 genen; introns, promotor regio's onderbrekingspunt van 24 genen; 1122 exons uit 847 verwante genen. Deze dekking van meer dan 95% van de tumor gerelateerde stuurprogramma mutaties en doel mutatie sites van de 12 meest voorkomende tumoren (longkanker, darmkanker, maagkanker, borstkanker, nierkanker, pancreatic kanker, leverkanker, schildklierkanker, baarmoederhalskanker, slokdarmkanker en endometrium carcinoom).
| DNA | Resultaat | Indicatie | Ideaal bereik |
| cfDNA | De grootte van het fragment | Identificatie van DNA Fragment distributie | 168bp±20(a) |
| Concentratie | Nauwkeuriger DNA kwantificering | Totaal cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identificatie van chemische contaminanten (bijvoorbeeld ethanol) | 1,50-2.2 |
| A260/A280 | Identificatie van eiwit contaminanten | 1,60-2.2 | |
| Concentratie | Kwantificering van DNA | Totale gDNA > 3ug |
Tabel 2. De analyse van de kwaliteit van cfDNA en gDNA geëxtraheerd uit perifere bloed.
De grootte van de piek van de cfDNA is rond 170Bp. kwaliteitscontrole moet worden uitgevoerd door een gestandaardiseerde methode voor de 2100 Bioanalyzer om te bepalen van de verontreinigingsniveaus monster afbraak en/of gDNA. Piek analyse van de kwaliteit van de cfDNA-extractie moet lijken op figuur 1. Merk op dat DNA bedrag verhoogd zal resulteren in een bibliotheek met een hogere kwaliteit voor de doeltreffende opsporing van zeldzame mutaties in cfDNA. Het is raadzaam om met behulp van ten minste 30 ng cfDNA (30.000 exemplaren).
Tabel 3. De QC van ER-Seq informatieanalyse en traditionele informatieanalyse.
De donkere grijze markering geeft aan de verhoging van de diepte van een dekking is opgetreden in de ER-Seq vergeleken met traditionele methoden; een licht grijze hoogtepunt geeft geen PCR geïnduceerde gedupliceerde lezen in ER-Seq. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Gen | Chr | Start | Einde | cHGVS | pHGVS | Functie | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Traditionele var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | Beroep | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | Frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | Beroep | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabel 4. Het resultaat van de roeping van ER-Seq informatie Analysis en traditionele informatieanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bestaan van circulerende tumor DNA (ctDNA) werd ontdekt meer dan 30 jaar geleden, maar de toepassing van ctDNA analyses nog niet routinematig in de klinische praktijk is. Belangstelling voor de praktische toepassing van ctDNA methoden is toegenomen met de ontwikkeling van technologieën voor ctDNA-detectie- en analysemethoden. Tumor monitoring met ctDNA biedt een minimaal invasieve benadering voor de beoordeling van microscopische residuele ziekte, reageren op therapie, en de Moleculaire profielen van de tumor onder de achtergrond van de tumor evolutie en intratumoral heterogeniteit13, 14. Verbeteringen in de gevoeligheid en de specificiteit van de analyse vergemakkelijkt alle deze toepassingen15,16.
In dit manuscript introduceerden we ER-Seq, een veelbelovende methode ter verbetering van de gevoeligheid van ctDNA de detectie, met behulp van een NKCLK geval als voorbeeld. Vergeleken met traditionele analyse, verbeterd de toepassing van onze adapters uniek rangschikkend in ER-Seq aanzienlijk zijn gevoeligheid en specificiteit, aangegeven door een verhoging van de diepte van dekking en een mogelijkheid om te detecteren lagefrequentie-mutaties (zoals EGFR p. T790M (0,53%)). Het bestaan van T790M in deze patiënt steekproef kan een bijdragende factor Erlotinib weerstand, en gaf inzicht in hoe beter behandelen deze patiënt, suggereert het gebruik van een derde generatie EGFR-remmer specifiek voor T790M, zoals AZD929117-20. Een ander kritisch punt in de ER-Seq dat aan de gevoeligheid en de specificiteit bijdraagt is de basislijn database screening, dat de nauwkeurige detectie van lagefrequentie-mutaties in ctDNA vergemakkelijkt door het uitfilteren van achtergrondgeluiden.
Hoewel ER-Seq vele voordelen, waarmee u gemakkelijker superieur aan de traditionele methoden heeft, zijn er nog sommige uitdagingen die moeten worden overwonnen. Een van de belangrijkste uitdagingen voor ER-Seq is de extreem lage niveau van ctDNA in het bloed aanwezig. Voor deze lagefrequentie-mutaties is het verwerven van voldoende sjabloon ctDNA van cruciaal belang. Onze unieke adapters aanzienlijk verhogen de recycle van ctDNA, maar ze nog moeten worden verbeterd. Een andere uitdaging voor ER-Seq en voor alle andere sequencing technieken, is de beperking van de dekking van doelregio's. Onze geselecteerde 1021 kb sonde verrijkt regio's, die kan beslaan ongeveer 95% van tumor-gerelateerde mutaties, zijn meer uitgebreid vergeleken met andere kleine-vliegtuig methoden21,22,23. Echter, zoals de heterogeniteit van de tumor is goed erkend en meer en meer tumor biomerkers ontdekt, de relatieve dekkingsgraad van onze sondes verrijkt dalingen van de regio's. Om beter te dienen als een instrument voor vroegtijdige diagnose en de monitoring van de ziekten van patiënten van de tumor, zijn meer uitgebreide sequentie en analyse technieken nodig. Momenteel, is ER-Seq nog steeds afhankelijk van een hoog volume van gegevens voor het opsporen van lagefrequentie-mutaties. Verdere verbetering van de gegevens gebruik zou gunstig zijn voor de toepassing van ER-Seq.
Zoals hierboven is besproken, bestaat er veel beperkingen ER-Seq is gekoppeld. Onze unieke analysetechniek heeft echter nog vele voordelen in vergelijking met andere top-ranking-methoden op dit gebied. De voors en tegens van deze techniek verdienen nog verder onderzoek. Het potentieel van ER-Seq voor routinematige klinisch gebruik zullen van groot belang voor de klinische artsen, hen te voorzien van een krachtig hulpmiddel voor de diagnose van tumoren en de dynamiek van de tumor van de monitor en de respons op therapie. Nieuwe mutaties geassocieerd met resistentie tegen conventionele en gerichte therapie gevonden door onze analyse mogelijk bieden nieuwe mogelijkheden van behandeling voor kankerpatiënten met gevorderde ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door Geneplus-Beijing Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
