Summary
כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.
Abstract
הניתוח של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) באמצעות הדור הבא רצפי (הגדרות) הפך להיות כלי רב ערך עבור הפיתוח לאונקולוגיה קלינית. עם זאת, היישום של שיטה זו הוא מאתגר עקב רגישות נמוכה שלה בניתוח הסכום עקבות של ctDNA בדם. יתר על כן, שיטת עשויה ליצור תוצאות false חיוביות ושליליות בניתוח רצף וזו שלאחריה. כדי לשפר את כדאיות והאמינות של זיהוי ctDNA במרפאה, כאן אנו מציגים טכניקה אשר מעשיר מוטציות נדירות עבור רצף, להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). ER-Seq יכולים להבחין מוטציה יחידה מחוץ נוקלאוטידים פראי-סוג של7 עונה 1 פרק 10, אשר הופכת כלי מבטיח כדי לזהות שינויים גנטיים בתדר נמוך מאוד, וכך יהיה שימושי מאוד בלימוד מחלת heterogenicity. בזכות מצדו של המתאם רצף ייחודי, שיטה זו מאפשרת שחזור יעיל של מולקולות ctDNA, בעוד בלתקן באותו זמן עבור שגיאות ההכפלה (antisense על תבונה). הבחירה שלנו של הגששים 1021 kb מעשיר את המדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות הגידול הנהג בגידולים 12. שיטה חסכונית ואוניברסלית זו מאפשרת הצטברות מוצלח באופן ייחודי של מידע גנטי. לאחר ביעילות סינון רקע שגיאה, ER-seq בדיוק לזהות מוטציות נדירות. באמצעות חקר מקרה, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט הוכחת בדיקה, בניית ספרייה, ועיצוב יעד ה-DNA לכידת מתודולוגיות, כולל ניתוח נתונים זרימת העבודה. כדי לבצע את שיטה זו בדרך כלל לוקח 1-2 ימים.
Introduction
הדור הבא רצפי (הגדרות), כלי רב עוצמה כדי לחקור את המסתורין של הגנום, יכול לספק כמות גדולה של מידע, אשר עלול לגלות שינויים גנטיים. היישום של המיתרים ניתוח במרפאה הפך נפוץ יותר, במיוחד עבור רפואה אישית. אחת המגבלות הגדול ביותר של המיתרים, אולם, הוא שיעור שגיאה גבוהה. למרות הוא סבור כי מתאים לומד מוטציות תורשתיות, הניתוח של מוטציות נדירות היא מוגבלת מאוד1,2, במיוחד כאשר ניתוח DNA המתקבל "ביופסיה נוזלי".
במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא ה-DNA ללא תא (cfDNA) הדם ישפך מתאי הגידול. ברוב המקרים, הכמות של ctDNA הוא נמוך ביותר, בו לבצע זיהוי וניתוח שלה מאוד מאתגר. עם זאת, ctDNA יש תכונות אטרקטיביות רבות: הניתוק הוא פולשנית, שניתן יהיה לזהותו בשלבים המוקדמים של הגידול, רמת ctDNA משקף יעילות טיפולית, ctDNA מכיל DNA מוטציות נמצאו בנגעים הראשי והן גרורתי 3 , 4 , 5. לפיכך, לאור ההתפתחות המהירה של המיתרים טכניקה, ניתוח, היישום של זיהוי ctDNA הפך אטרקטיבי יותר.
גישות שונות רצף מקביל בנפט כבר נעזרו ctDNA זיהוי אבל אף אחד גישות אלה התקבלו לשימוש שגרתית במרפאות בשל המגבלות שלהם: נמוך רגישות, חוסר צדדיות, ועלות גבוהה יחסית6 7, ,8. לדוגמה, רצף דופלקס, בהתבסס על תג המזהה הייחודי (UID), שוב ושוב מתקנת שגיאות ההכפלה קונצנזוס, ומתקן שגיאות רצף רוב. אולם, הכדאיות של שיטה זו הוא לאיבוד בשל העלות הגבוהה שלה נתונים נמוכה ניצול9,10. באופן דומה, קאפ-Seq שלה איטראציה משופרת,11,קאפ-אידו12, יש המעשיות גדול בזיהוי cfDNA, למרות הדיוק ואת אוניברסאליות של שיטות אלה זקוקים לשיפור.
כדי לענות על הצורך הנוכחי ctDNA מדויק זיהוי, ניתוח, פיתחנו אסטרטגיה חדשה להעשיר נדיר מוטציה רצף (ER-Seq). גישה זו משלבת את הדברים הבאים: רצף ייחודי מתאמי ביעילות לשחזר מולקולות ctDNA, עם תיקון שגיאות דו-כיוונית ואת היכולת להבחין בין מוטציה יחידה מתוך > נוקלאוטידים פראי-סוג 1 × 107 ; הגששים 1021 kb אשר להעשיר מדידה של אזורי היעד למעלה מ- 95% מוטציות הקשורות גידול של 12 גידולים, כולל סרטן הריאות, סרטן המעי הגס, סרטן הקיבה, סרטן השד, סרטן הכליה, סרטן הלבלב, סרטן הכבד, סרטן בלוטת התריס, סרטן צוואר הרחם, סרטן הוושט, סרטן רירית הרחם (טבלה 1); וסינון מסד נתונים בסיסי שהופך אותו יעיל וקל לזיהוי מוטציות נדירות בדיוק ב- ctDNA.
כדי לבנות מסד נתונים של תוכנית בסיסית, למצוא כל מוטציות מאת ER-Seq ממספר אותו סוג של דגימות (~ 1000 בהתחלה). מוטציות אלה אמיתית יש לאמת על ידי מספר שיטות זיהוי אמין וניתוח אחרים. בשלב הבא, לסכם את התבנית של מוטציות שווא, אשכול כל מוטציות שווא כדי לבנות את מסד הנתונים של התוכנית הבסיסית הראשונית. המשך להוסיף מוטציות שווא למצוא מן הניסויים הבאים רצף מסד נתונים זה. לכן, מסד נתונים בסיסית זה הופך מסד נתונים מורחב דינאמי, אשר משפר באופן משמעותי את רצף דיוק.
לעודד התקדמות הגידול אבחון וניטור, נציג אר-Seq, שיטה בעלות נמוכה האפשריים לצורך רכישת נתונים אוניברסלי. נציג חקר מקרה שגם עברה ניתוח ER-Seq, הממחיש את רמת הדיוק שלה לזיהוי מוטציות נדירות, היתכנות לשימוש במרפאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגימות הגידול דגימות דם התקבלו על-פי פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה של האנשים אוניברסיטת פקינג ' s בית החולים. בכתב הסכמה מדעת הושג מן המטופלים להשתמש דוגמאות שלהם. המשתתפים הוקרנו על פי הקריטריונים הבאים: נקבה, מתקדמים סרטן ריאות תא חדרים-קטן, מוטציה p.L858R EGFR שצוין על-ידי רצף סנגר הקודם, התקדמות המחלה בעקבות מפגש שני של EGFR ממוקד טיפול עם טרסבה, ו ER-Seq שכיסה ctDNA כדי לנתח את סיבת ההתנגדות ולמצוא תרופות חדשות היעד.
1. מיצוי DNA מהדם ההיקפי עבור cfDNA ו- DNA גנומי (gDNA)
- לאסוף 10 מ"ל של דם היקפיים בשפופרת איסוף, היפוך בעדינות למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים כדי לערבב. הימנע תא הטיה. ניתן לאחסן דגימות דם בצינור אוסף ב 6-37 מעלות צלזיוס עד 72 שעות.
- Centrifuge הצינור אוסף בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות מהשעה 16:00 (±150) x ג
- להעביר את תגובת שיקוע (פלזמה) מהצינור אוסף ארבעה mL 2 נקיים כראוי מתויג צנטריפוגה צינורות באמצעות pipet חד פעמיות מבלי להפריע השכבה גלולה (כדוריות דם לבנות).
- ML Transfer1 של התאים באמצעות pipet חד פעמיות נקי 2 מ ל כראוי מתויג צנטריפוגה שפופרת. התאים יכולים להיות מאוחסנים ב-20 ° C או קר לפני שלב 1.8.
- Centrifuge הפלזמה (מתוך שלב 1.3) 10 דקות ב 4 ° C, 16000 (±150) x ג
- העברת פלזמה לנקות צינורות צנטריפוגה מתויג כראוי כמו " פלזמה ", להשאיר ~0.1 מ"ל נפח שיורית בתחתית כדי למנוע זיהום. לאחסן הפלזמה ב-80 מעלות צלזיוס עד שלב 1.7.
- השתמש 3 מ"ל של פלסמה מהשלב 1.6 כדי לבודד cfDNA (ctDNA מכיל) באמצעות ערכת זמינים מסחרית, בעקבות היצרן ' הוראות s.
- µL 200 שימוש של כדוריות הדם הלבנות מהשלב 1.3 לבודד gDNA באמצעות ערכת זמינים מסחרית, בעקבות היצרן ' הוראות s.
הערה: שניהם ניתן לאחסן ב-20 ° C לפני השימוש cfDNA, gDNA. - להחיל פקדים איכות שונים עבור cfDNA ו- gDNA (טבלה 2). לבצע בקרת איכות על ידי שיטה סטנדרטית bioanalyzer לקבוע רמות של השפלה מדגם ו/או זיהום gDNA. ניתוח שיא של איכות cfDNA החילוץ אמור להופיע הדומה איור 1.
הערה: גודל השיא בבתים של cfDNA הוא בסביבות 170 bp. הערה כי להגדיל את כמות ה-DNA תגרום בספריה באיכות גבוהה עבור זיהוי יעיל של מוטציות נדירות cfDNA. אנו ממליצים על שימוש ng לפחות 30 cfDNA (30,000 עותקים).
2. ספריית הכנה
הערה: ביחס לספריית הבסיס בניה על ה-DNA מפוצלים, cfDNA קיימת בקטעים עם שיא גודל ~ 170 שואלת, לפיכך אינו צריך להיות מקוטעת.
- שבר הפקד מדגם (gDNA) על ידי sonication כדי לקבל 200-250 bp קטעים.
- µG 1 להכין מדגם gDNA ב µL 100 טריס-EDTA המאגר בצינור sonication נקי.
- להגדיר את התוכנית sonication 30 s s על ו-30 הנחה 12 מחזורים עבור סכום כולל של לפחות 12
- לאחר sonication, לאשר המוצר (5 µL) מכיל 200-250 bp קטעים על-ידי הפעלת ניתוח עם ג'ל agarose 2%-
- להעביר את כל המוצרים פיצול צינור 1.5 mL, דגירה עם 150 µL של beads מגנטי עבור 5 דקות לבחור השברים הנכון.
- להסיר את תגובת שיקוע על ידי לשים את הצינורית על מתלה מגנטי עבור 30 ס
- לשטוף את החרוזים עם 200 µL של 80% אתנול (הטרי) עם הצינורית נשאר על המדף מגנטי. תקופת דגירה של 30 s לפני הסרת את תגובת שיקוע. אני חוזר פעם.
- אוויר יבש את החרוזים עם המכסה צינור פתוח כשהוא נשאר על המדף מגנטי. הימנע חרוזים overdried כדי לוודא כי המטרה דנ א משחזרת טוב. Elute שברי DNA החרוזים על-ידי הוספת µL 32 10 מ מ טריס-HCl (pH 8) החרוזים לפתרון שברי DNA ואחריו כמת על ידי ספקטרוסקופיה UV/Vis.
הערה: לפחות 200 ng יש צורך הניסויים הבאים.
- סיום ההכנה התגובה
הערה: היצרן פעל ' s הוראה ולשנות כנדרש. שימוש 30 ננוגרם של cfDNA; µg 1 של gDNA של הפקד.- µL 7 להוסיף תגובה מאגר, 3 µL של התערובת אנזים 30 ננוגרם של cfDNA צינור ללא נוקלאז סטרילי, ולהוסיף ddH 2 O הנפח הכולל של 60 µL. בשפופרת נפרדים, להוסיף את הרכיבים הנ ל אבל עם µg 1 של gDNA במקום cfDNA.
- מיקס דגירה התערובת ב 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחריו 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב- thermocycler ללא המכסה מחומם. פנה/י מיד אל השלב הבא.
- מתאם מצדו
- להוסיף 30 µL של המיקס האב מצדו µL 1 של משפר מצדו, µL 4 המתאמים רצף ייחודי לתערובת מהשלב 2.2.
- Incubate ב- 20 ° C למשך 15 דקות thermocycler ללא המכסה מחומם.
- מערבולת resuspend את החרוזים מגנטי ולעזוב את החרוזים בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות לפני השלב הבא.
- להוסיף µL 87 של חרוזים מגנטי resuspended לתערובת כאמור; לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, ואז דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק.
- שטיפת ואוויר יבש את החרוזים כפי שמתואר בשלב 2.1.
- Elute המטרה הדנ א של החרוזים על-ידי הוספת 20 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-
- העשרה של DNA רסיסים מאתרים עם מתאם
- להוסיף 20 µL של ה-DNA מתאם מאתרים שברים, 5 µL של אינדקס פריימר/i7 (2.5 µL פריימר-P7 (מאי 10) ו- 2.5 µL של פריימר-P5 (10 בבוקר), למטרות רצף), 25µL של ספריית הגברה מיקס מאסטר, ו- ddH 2 O כדי הנפח הכולל של 50 µL-
- PCR להגביר את מתאם מאתרים הדנ א ואת המחזור התרמי כדלקמן: דנטורציה הראשונית ב 98 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ואחריו 8 מחזורים (cfDNA) או 4 מחזורים (gDNA) של חישול ° C 15 s, 65 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s) , ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות 60 s, ואז מחזיקים את הטמפרטורה ב-4 מעלות צלזיוס
- 45 להוסיף µL של beads מגנטי על תנאי ל- DNA מועשרת PCR כדי לקבל שברי רכשה.
- Elute DNA קטעים עם מתאמי ב 30 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-
- בקרת איכות ספריית
- בצע היצרן ' פרוטוקול s עבור ערכת מסחרית למדוד את מתאם מאתרים ריכוז ה-DNA. להשתמש את bioanalyzer כדי לקבוע את איכות דנ א.
3. ממוקד לכידת דנ א
הערה: היעד העשרה בוצעה באמצעות רצף מותאם אישית לכידת-בדיקה אשר תוכננה במיוחד עבור אזור היעד 1021 kb העשרה מכסה נהג סרטניים הקשורים ידוע מוטציות מ 12 סוגים שונים של גידולים. שינויים היצרן ' פרוטוקול s מפורטים השלבים הבאים-
- חסימת
- µg להוסיף 1.5 של איגוד ספריות (המספר המרבי של ספריות למאגר עבור cfDNA הוא 6, gDNA בת 20) משלב 2, 8 µL P5 Block(100P), µL 8 של P7 Block(100P) ו µL 5 של עריסה-1 DNA (µg 1/µL) בצינור סטרילי. יבש את התוכן של הצינור באמצעות רכז ואקום להגדיר ב-60 מעלות צלזיוס
- Hybridize הלכידה DNA רגשים עם הספריה.
- להוסיף הרכיבים הבאים כדי ברכבת התחתית שלב 3.1: 8.5 µL של המאגר הכלאה X 2, µL 2.7 של הכלאה משפר, ו- 1.8 µL של ddH נטולת נוקלאז 2 O.
- מיקס על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה ב thermomixer ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות
- בעקבות דגירה, מיד להוסיף 4 µL של בדיקה התאמה אישית. דגירה דוגמאות הצנטרפוגה תרמי ב 65 & #176; C עם מכסה מחומם ל 75 ° C עבור 4 h.
- DNA קטעים לכידת
- דגירה המטרה hybridized DNA עם חרוזים streptavidin ואחריו לשטוף את החרוזים להסיר את ה-DNA לא מאוגד. להשתמש בערכה מסחרי על פי יצרן ' s הוראות להגיע µL 20 הסופי של חרוזים resuspended עם ה-DNA שנתפסו קטעים.
- הגברה של ה-DNA שנתפסו קטעים
- ה-PCR לבצע שימוש המסחרי קיט עם 2 מיקרומטר עמוד השדרה oligonucleotides, על פי היצרן ' הוראות s.
- כאשר PCR התגובה הושלמה, להוסיף µL 45 של חרוזים תלויים ישירות על המוצר PCR ולהעשיר את שברי DNA היעד מוגבר קשור החרוזים מאת • תנאי עם 30 µL 10 מ מ טריס-HCl (pH 8)-
- לכמת שברי DNA עם ערכת כימות ספריה, לקבוע את אורך קטע הממוצע על ידי Bioanalyzer ( איור 2).
4. רצף
- רצף מרובב ספריות באמצעות 75 פועל מזווג-end bp על ברצף benchtop עבור נתונים הכולל 18 ח' המיוצר הוא עד 60 ג'יגה-בתים, 15 גר' נדרש עבור החולה מדגם cfDNA ו- 1G עבור שליטה דגימת gDNA.
5. נתוני ניתוח זרימת
הערה: איור 3 מציג את תהליך ניתוח עבודה כללית זרימה ונתונים. הפרמטרים לניתוח נתונים ופקודות מוצגים להלן.
- לסנן באיכות נמוכה קריאות ולתקן שגיאות, מיסוך של ה-UID באמצעות NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter לסנן -l 5 - q 0.5 -n 0.1 -T fastq1 - G-1 3-2 fastq2
realSeq(own)
פייתון bin/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2 -o פלט הפקודה dir -p קידומת -u 4 -s 7 - מ' 3 -i uidFile-פ - התייחסות הגנום hg19 (הגנום האנושי 19), אתר את התוצאות רצף תוך שימוש בזיכרון BWA (גירסה 0.7.12-r1039) ויישר מחדש עם הגנום ניתוח Toolkit (GATK) (גרסה 3.4-46-gbc02625).
bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-צנצנת
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-ידוע dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - אני cancerBam-אני normalBam
java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 IndelRealigner -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T-ידוע dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals מרווחי-אני cancerBam-אני normalBam - אשכול את הכפילויות בהתאם ה-UID והמיקום של השברים תבנית, אשר לתקן את השגיאה בסיסים לראשונה על ידי ה-PCR/רצף ולשנות את איכות הבסיס.
realSeq(own)
פייתון realSeq/bin/realSeq אשכול -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
קידומת -m 6 - ליישר מחדש את הכפילויות באשכולות על ידי BWA לזכור:
bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - לבצע את ההתכנסות המקומי ולאחריו ודרוש כיול מחדש של ציון איכות הבסיס באמצעות GATK (גרסה 3.4-46-gbc02625).
Loacal ההתכנסות: java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-ידוע dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 . אני cancerBam-אני normalBam
java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-hg19 IndelRealigner -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T-ידוע dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals מרווחי זמן-אני cancerBam-אני normalBam
למשובטים ניקוד איכות-הבסיס: java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - hg19 BaseRecalibrator -R צנצנת GenomeAnalysisTK.jar -T -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites הקוסמי - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct... 10 - אני בום -o grp java-d64-שרת - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-ג'אר GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-אני בום - BQSR grp -o... outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - עבור SNV (משתנה נוקלאוטיד יחיד) וקורא ויאסין (קטן הוספות או מחיקות), הדיוק של מוטציות בתדר נמוך עוד יותר אושר על ידי GSR (תמיכה טובה קורא) עם שניהם סטרנד ואחורה לקרוא זוגות ולסינון באמצעות קבוצת הביקורת (germline מוטציות) ומסד הנתונים של תוכנית בסיסית-
realDcaller(own)
פייתון realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - שתשמש בסיס דגימות פקד שהתקשרת CNV (עותק מספר וריאציות).
NCcnv(own)
פייתון NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk - Realigned לא ממופים, קליפים וקורא זוג צורמים להתקשר SV (וריאציות מבניות).
NCsv(own)
פייתון NCsv tmpdir -t - r hg19 outputdir -o - x התעתיק -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגששים 1021 kb היעד מועשר אזורים המשמשים ER-Seq מוצגים בטבלה 1, המכסה מעל 95% של מוטציות 12 גידולים נפוצים. מגוון רחב של רגשים אלו הופך תהליך זה החלים רוב חולי סרטן. בנוסף, מתאמי רצף ייחודי ואת ההקרנה מסד הנתונים הבסיסית שלנו מאפשרים לזהות מוטציות נדירות בדיוק.
בשל מאפיינים שונים של gDNA ו- cfDNA מופק דם היקפיים, יש מגוון רחב של איכות הנתונים, אשר נקבע על ידי מכשירים שונים ועל פקדים איכות שמוצג בטבלה 2. CfDNA שחולץ בהצלחה צריך להציג בגודל שיא של bp, כמו שנותחה על ידי bioanalyzer QC ~ 170 ובאיור איור 1. קטעים גדולים להצביע על זיהום של הדנ א, אשר אמור להופיע לא במוצר הסופי. DNA שחולצו מן החולה מדגם זה היה של איכות וכמות מספקת עבור מיון-Seq (cfDNA - 42.6 ng; gDNA - 3.426 µg).
לכידת DNA היעד באמצעות בדיקה אישית היה אז מוגבר על ידי ה-PCR. הגודל הממוצע פרגמנט הוערך על ידי הנתונים bioanalyzer ונציג עבור cfDNA של החולה ב איור 2A הראה לשיא בסביבות 320 ~ bp ו להקה ייחודית על agarose ג'ל. gDNA אמור להופיע כמו כתם על ג'ל agarose, כפי שמוצג באיור 2B. האיכויות של שתי הספריות היו מקובלים על רצף עוקבות.
לאחר רצף, ניתחנו את הנתונים לפי סדר לפי זרימת עבודה ב- 3B איור. כדי להמחיש את יתרונות שלנו Seq-ER לעומת השיטה המסורתית, ביצענו שני ניתוחים באמצעות באותה דגימת זרע. תוצאות מניתוחי שני מוצגים בטבלה 3 ובטבלה 4. הראינו כי ER-Seq משפר את עומק כיסוי-23% לעומת השיטה המסורתית (טבלה 3, קריאות 3214.3 ב ER-Seq vs קריאות נולד בניתוח מסורתי), אשר עקב שלה שחזור יעיל של מולקולות cfDNA, לכן במידה רבה שיפור הניתוח של מוטציות נדירות. גם ברור כי המתאמים רצף ייחודי בשימוש ER-Seq לאפשר בידול קל של כפילויות טבעי ו- PCR-induced (טבלה 3, 0 PCR המושרה משוכפלים לקרוא ב- ER-Seq). בנוסף, מצאנו בתוצאות הקורא כי ניתוח המבוסס על ER-Seq 100% עקבית לגילוי p.L858R EGFR, כי התדירות של זיהוי היה מעט גבוה יותר (2.7% לעומת 1.2%) כאשר לעומת ניתוח מסורתי (טבלה 4). חשוב, ניתוח ER-Seq מופעלת הגילוי של מוטציות אחרות תדירות נמוכה יחסית, כולל EGFR p.T790M (וריאציה תדירות 0.53%) (טבלה 4), זה ולא הוכר על ידי ניתוח מסורתי עקב רעש רקע גבוה.
איור 1. נציג cfDNA QC תוצאה של בהצלחה מבודד
הגרפים השמאלי, ציר X מציג גודל פרגמנט (bp), ציר Y מציין יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (פו). הגודל העיקרי של cfDNA הוא ~ 170 bp ויש אין שברים גדולים של זיהום. ג'ל אלקטרופורזה מדומה מוצג מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. דוגמה של ספריות QC מנותח.
ציר X מראה את גודל פרגמנט (bp) ומציין ציר Y את יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (פו). ג'ל אלקטרופורזה מדומה הוצגה בצד ימין של כל תרשים. (א) מדגם cfDNA החולה הגיע לשיא חדות אחרי זה היה מוגבר עם מתאמי. (B) מדגם gDNA שליטה הראו קטעים המתפלג עם שיא חדה אין, בלי דעה קדומה כלפי צד אחד. שתי דוגמאות היו מקובלים על רצף עוקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תזרים עבודה של ER-Seq.
זרימת עבודה כללית (A). (B) זרימת עבודה של ניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 2735 exons מן כל האזור אקסון של גנים 70 | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | עארף | כספומט |
| ATR | AURKA | AURKB | אקסל | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | לח ק | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | זיכרון DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ארג | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | גהס |
| HDAC1 | HDAC4 | דבורה שחר | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
טבלה 1. 1021 kb רגשים אזורי היעד מועשר.
אזורים אלה כללו: 2735 exons מן הגנים 170; אינטרונים, יזם אזורים ואזורי נקודת עצירה של גנים 24; 1122 exons של גנים הקשורים 847. אלה מכסים 95% של הגידול הקשורים הנהג מוטציות ואתרי יעד מוטציה בין הגידולים הנפוצים ביותר 12 (סרטן הריאות, סרטן המעי הגס, סרטן הקיבה, סרטן השד, סרטן הכליה, סרטן הלבלב, סרטן הכבד, סרטן בלוטת התריס, סרטן צוואר הרחם, סרטן הוושט, סרטן רירית הרחם).
| ה-DNA | תוצאה | אינדיקציה | האידיאל טווח |
| cfDNA | גודל פרגמנט | זיהוי של מקטע DNA הפצה | 168bp±20(a) |
| ריכוז | כימות מדויקת יותר דנ א | CfDNA סה כ ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | זיהוי של מזהמים כימיים (למשל, אתנול) | 1.50 – 2.2 |
| A260/A280 | זיהוי של חלבון מזהמים | 1.60 – 2.2 | |
| ריכוז | כימות דנ א | סה כ gDNA > 3ug |
בטבלה 2. ניתוח איכותי של cfDNA ו gDNA ו'נשלף מדם היקפי.
גודל השיא בבתים של cfDNA הוא סביב 170Bp. בקרת איכות צריך להתבצע על ידי שיטה סטנדרטית Bioanalyzer 2100 לקבוע רמות של זיהום הדגימה השפלה ו/או gDNA. ניתוח שיא האיכות של החילוץ cfDNA אמורה להופיע הדומה איור 1. שימו לב: גדלה כמות ה-DNA תגרום ספרייה עם איכות גבוהה יותר עבור זיהוי יעיל של מוטציות נדירות cfDNA. אנו ממליצים להשתמש ng לפחות 30 cfDNA (30,000 עותקים).
בטבלה 3. QC של ER-Seq מידע ניתוח וניתוח המידע המסורתיות.
גולת הכותרת אפור כהה מצביע על עלייה עומק כיסוי אירעה ב- ER-Seq לעומת שיטות מסורתיות; סימון אפור בהיר מציין אין PCR המושרה המשוכפלת לקריאה ב- ER-תת סעיף אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| ג'ין | Chr | התחל | סוף | cHGVS | pHGVS | פונקציה | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Var_freq מסורתי |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | שבידיך | 0.0270 | 0.0120 |
| כספומט | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | שבידיך | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
בטבלה 4. התוצאה הייעוד של ER-Seq מידע Analysנמצא וניתוח מסורתי מידע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיומה של מחזורי גידול דנ א (ctDNA) התגלה לפני יותר מ-30 שנה, אולם היישום של ניתוחים ctDNA הוא עדיין אינו שגרתי בפרקטיקה הקלינית. עניין היישום המעשי של שיטות ctDNA גדל עם התפתחות טכנולוגיות ctDNA זיהוי, ניתוח. הגידול ניטור עם ctDNA מציעה גישה מינימלית פולשנית להערכה של מחלה שיורית מיקרוסקופית, בתגובה טיפול ופרופילים הגידול מולקולרית תחת הרקע של גידול אבולוציה ו intratumoral הטרוגניות13, 14. שיפורים רגישות וסגוליות של ניתוח יקל על כל אלה יישומים15,16.
כתב יד זה, הצגנו ER-Seq, שיטה מבטיחה שמטרתו לשפר את רמת הרגישות של זיהוי ctDNA, תיק NSCLC כדוגמא. לעומת ניתוח מסורתי, היישום של מתאמי רצף ייחודי שלנו ב- ER-Seq לשפר באופן משמעותי את רגישות וספציפיות, המצוין על-ידי עלייה עומק כיסוי ויכולת לזהות מוטציות בתדר נמוך (כגון EGFR p. T790M (0.53%)). קיומו של T790M במדגם זה המטופל עשוי להיות גורם תורם טרסבה התנגדות ונתן תובנה איך לטפל טוב יותר את החולה, מציעה את השימוש מעכב EGFR הדור השלישי ספציפי עבור T790M, כגון AZD929117-20. עוד נקודה קריטית ב- ER-Seq אשר תורם רגישות וספציפיות שלה הוא ההקרנה מסד נתונים בסיסית, המאפשרת זיהוי מדויק של מוטציות בתדר נמוך ctDNA על-ידי סינון רעשי רקע.
למרות ER-Seq יש יתרונות רבים אשר הופכים אותו למועדף על שיטות מסורתיות, ישנם עדיין כמה אתגרים צריך להתגבר. אחד האתגרים הגדולים עבור מיון-Seq הוא הרמה נמוכה במיוחד של ctDNA קיים בדם. מוטציות אלה בתדר נמוך, רכישת מספקת תבנית ctDNA היא קריטית. מתאמי הייחודי שלנו להגדיל באופן משמעותי את קצב המיחזור של ctDNA, אבל הם עדיין צריכים להשתפר. אתגר נוסף על ER-Seq ועל כל את רצף טכניקות אחרות, היא המגבלה של כיסוי של אזורי היעד. בדיקה kb 1021 הנבחר שלנו מועשר אזורים, אשר יכול לכסות כ- 95% של מוטציות הקשורות הגידול, הן מקיפות יותר לעומת שאר שיטות מטוס קטן21,22,23. עם זאת, הגידול הטרוגניות הוכרה גם, כבר גילו יותר ויותר הגידול סמנים ביולוגיים, שיעור הכיסוי היחסית של הגששים שלנו מועשר אזורים ירידות. כדי לשרת טוב יותר ככלי אבחון מוקדם וניטור מחלות של גידול חולי, טכניקות רצף וניתוח מקיף יותר יש צורך. כיום, ER-Seq עדיין מסתמך על כמות גדולה של נתונים לזיהוי מוטציות בתדר נמוך. שיפור נוסף ניצול נתונים יכולה להיות חיובית עבור היישום של ER-תת סעיף.
כפי שצוין לעיל, קיימות מגבלות רבות המשויכות ER-Seq. עם זאת, טכניקה ייחודית ניתוח שלנו עדיין יש יתרונות רבים לעומת שיטות אחרות הבכירים בתחום זה. היתרונות והחסרונות של טכניקה זו ראויות יותר מחקר. הפוטנציאל של ER-Seq לשימוש קליני שגרתי יהיה בעל חשיבות רבה עבור רופאים קליני, לספק להם כלי רב עוצמה כדי לאבחן גידולים, צג הגידול dynamics והתגובה לטיפול. מוטציות הרומן הקשורים עם עמידות לטיפול ממוקד קונבנציונאלי על-ידי הניתוח שלנו עשויים להציע דרכים חדשות לטיפול בסרטן חולים עם מחלה מתקדמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על-ידי המכון Geneplus – בייג'ינג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
