Summary
Эта рукопись описывает метод для обнаружения мутаций низкой частоты в ctDNA, ER-Seq. Этот метод отличается ее уникальной использование коррекции ошибок двунаправленный, Специальный фон фильтра и эффективной молекулярной приобретение.
Abstract
Анализ распространения опухоли ДНК (ctDNA) с помощью следующего поколения последовательности (НГС) стал ценным инструментом для развития клинической онкологии. Однако применение этого метода является сложной задачей из-за его низкой чувствительности при анализе трассировки количество ctDNA в крови. Кроме того этот метод может генерировать ложные положительные и отрицательные результаты из этой последовательности и последующего анализа. Чтобы улучшить возможности и надежность обнаружения ctDNA в клинике, здесь мы представляем технику, которая обогащает редкой мутации для виртуализации, обогатить редкой мутации последовательности (ER-Seq). ER-Seq можно отличить один мутации из 1 x 107 одичал тип нуклеотидов, что делает его перспективным инструментом для обнаружения крайне низкой частоты генетические изменения и таким образом будет весьма полезным при изучении heterogenicity болезни. Благодаря адаптеру уникальный последовательности перевязки этот метод позволяет эффективное восстановление ctDNA молекул, в то же время исправление ошибки двунаправленно (смысл и antisense). Наш выбор 1021 КБ зондов обогащает измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль водителя в 12 опухоли. Этот экономичный и универсальный метод позволяет уникально успешным накопления генетических данных. После эффективно отфильтровывать фон ошибка, ER-seq точно можно обнаружить редкой мутации. С помощью тематического исследования, мы представляем подробный протокол, демонстрируя зонд дизайн, строительство библиотеки и целевой ДНК захвата методологии, а также включая процесс анализа данных. Процесс для выполнения этого метода обычно занимает 1-2 дней.
Introduction
Следующего поколения последовательности (НГС), мощный инструмент для исследовать тайны генома, может предоставить большое количество информации, которая может выявить генетические изменения. Применение анализа NGS в клинике стало более распространенным, особенно для персонализированной медицины. Одним из величайших ограничений NGS, однако, является высокая погрешность. Хотя это считается подходит для изучения унаследованные мутации, является анализ редких мутаций значительно ограничены1,2, особенно когда анализа ДНК получены от «жидкий биопсии».
Циркулирующих опухоли ДНК (ctDNA) — свободных клеток ДНК (cfDNA) в крови, что является пролить от опухолевых клеток. В большинстве случаев количество ctDNA крайне низка, которые делают его обнаружения и анализа очень сложным. Однако, ctDNA имеет много привлекательных особенностей: его изоляция является малоинвазивной, он может быть обнаружен на ранних стадиях роста опухоли, ctDNA уровень отражает терапевтическую эффективность и ctDNA содержит мутаций ДНК, в первичных и метастатических поражений 3 , 4 , 5. Таким образом, учитывая быстрое развитие техники NGS и анализа, приложение обнаружения ctDNA стал более привлекательным.
Различные массивно параллельной последовательности подходы были использованы для обнаружения ctDNA, но ни один из этих подходов были приняты для обычного использования в клиниках из-за их ограничений: низкая чувствительность, отсутствие универсальности и относительно высокая стоимость6 ,,78. Например дуплекс последовательности, основываясь на теге уникальный идентификатор (UID), неоднократно исправляет ошибки в двунаправленно консенсус, выпрямлять большинство последовательности ошибок. Однако возможности этого метода теряется из-за ее высокой стоимости и низкого данных использования9,10. Аналогичным образом КАПП-Seq и ее улучшение итерации, КАПП-IDES11,12, имеют большей практичности в cfDNA обнаружения, хотя точность и универсальность этих методов нуждаются в улучшении.
Для удовлетворения текущих потребностей для точного ctDNA обнаружения и анализа, мы разработали новую стратегию, обогатить редкой мутации виртуализации (ER-Seq). Этот подход сочетает в себе следующее: уникальная последовательность адаптеры эффективно восстановить ctDNA молекулы, с коррекцией ошибок двунаправленный и способность различать одной мутации из > 1 × 107 одичал тип нуклеотидов; Зонды 1021 Кб, которые обогащают измерение целевых областей, которые охватывают более 95% мутаций связанных с опухоль от 12 опухолей, включая рак легких, колоректального рака, рак желудка, рак молочной железы, рак почки, поджелудочной железы, рак печени, рак щитовидной железы, Рак шейки матки, рак пищевода и рака эндометрия (Таблица 1); и основной базы данных скрининг, что делает его эффективным и легко точно обнаружить редкие мутации в ctDNA.
Для создания основной базы данных, найти все мутации гена, ER-Seq от ряда того же типа образцов (~ 1000 в начале). Эти реальные мутации должны быть проверены несколько других методов надежного обнаружения и анализа. Далее обобщить шаблон ложных мутаций и кластера все ложные мутации для создания первоначальной основной базы данных. Продолжайте добавлять накладные мутации, нашли от последующих последовательность экспериментов в этой базе данных. Таким образом этот основной базы данных становится динамической расширенной базы данных, что значительно повышает точность последовательности.
Для содействия прогрессу в опухоли диагностики и мониторинга, мы представляем ER-Seq, низкой стоимости и осуществимости метода для получения данных. Мы представляем тематическое исследование, которое прошли анализ ER-Seq, демонстрируя свою точность обнаружения редкой мутации и возможности для использования в клинике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
опухоли образцы и образцы крови были получены в соответствии с протоколом, утвержденным Комитет этики Пекинского университета людей ' s больницы. Письменное информированное согласие было получено от пациентов, чтобы использовать их образцы. Участникам были показаны по следующим критериям: девушки, расширенный Non-маленький мелкоклеточный рак, мутации p.L858R EGFR обозначается предыдущей последовательности Сэнгер, прогрессирование болезни после две сессии EGFR целевой терапии с эрлотиниб, и ER-Seq, который был применен к ctDNA, чтобы проанализировать причины сопротивления и найти новых целевых препаратов.
1. экстракции ДНК из периферической крови для геномной ДНК (геномная ДНК) и cfDNA
- собирать 10 мл периферической крови в коллекции трубки, инвертировать мягко вверх и вниз 6 - 8 раз в смесь. Избегайте Стрижка животных клеток. Образцы крови могут храниться в коллекции трубку 6-37 ° C до 72 часов.
- Центрифуга коллекции трубки при комнатной температуре в течение 10 мин на 1600 (±150) x г.
- Передачи супернатант (плазмы) из коллекции трубки четыре чистых 2 мл надлежащим образом маркированы пробирок с помощью одноразовой пипетки не нарушая слое гранул (белых кровяных клеток).
- Transfer1 мл клеток, надлежащим образом используя чистые одноразовые пипетки 2 мл маркировке пластиковых пробирок. Клетки можно хранить при температуре-20 ° C или холоднее перед шагом 1.8.
- Центрифуга плазмы (из шага 1.3) для 10 мин при температуре 4 ° C и 16000 (±150) x г.
- Передачи плазмы для очистки пробирок, правильно называть " плазмы ", оставьте ~0.1 мл остаточного объема внизу, чтобы избежать загрязнения. Хранить плазмы-80 ° c до шага 1.7.
- Использовать 3 мл плазмы от шага 1.6 для изоляции cfDNA (содержит ctDNA) использование коммерчески доступных комплект, после производитель ' s инструкции.
- Использование 200 мкл белых кровяных клеток из шага 1.3 изолировать геномная ДНК, использование коммерчески доступных комплект, после производитель ' s инструкции.
Примечание: Оба cfDNA и геномная ДНК может храниться при температуре-20 ° C перед использованием. - Применяются разные контроль качества для cfDNA и геномная ДНК (Таблица 2). Выполните контроль качества, стандартный метод bioanalyzer для определения уровня деградации образца и/или загрязнение геномная ДНК. Пик анализ качества cfDNA добычи должен появиться похож на рис. 1.
Примечание: Размер пик cfDNA составляет около 170 bp. Обратите внимание, что увеличение количества ДНК приведет к библиотеке высшего качества для эффективного обнаружения редкой мутации в cfDNA. Мы рекомендуем использовать по крайней мере 30 нг cfDNA (30.000 экземпляров).
2. Подготовка библиотека
Примечание: относительно строительства базовой библиотеки на фрагментированные ДНК, cfDNA существует в фрагментов с bp Размер ~ 170 пик и таким образом не нужно быть раздроблена.
Пример (геномная ДНК)- фрагмент элемента управления на sonication для получения фрагментов bp 200-250.
- Подготовить 1 мкг геномная ДНК образца в 100 мкл буфера Tris-ЭДТА в трубке чистой sonication.
- Установить программу sonication как 30 s на и 30 s off для 12 циклов в общей сложности 12 мин
- После sonication, подтвердите продукт (5 мкл) содержит фрагменты bp 200-250, выполнив анализ с 2% агарозном геле.
- Передавать все товары фрагментации новой 1,5 мл трубки и инкубировать с 150 мкл магнитной бусины для 5 минут, чтобы выбрать правильный фрагментов и.
- Удалить супернатант, поставив трубку на магнитные стойки для 30 s.
- Мыть бусины с 200 мкл 80% этанола (свежеприготовленные) с трубкой, оставаясь на магнитные стойки. Инкубируйте 30 s перед удалением супернатант. Повторить один раз.
- Воздух сухой бусины с крышкой трубки, открытые во время пребывания на магнитные стойки. Избегайте Пересушенный бусы, чтобы убедиться, что хорошо восстанавливает ДНК целевой. Элюировать ДНК фрагментов из бисера, добавив 32 мкл 10 мм трис-HCl (рН 8) бисер для устранения фрагментов ДНК, следуют по количественной оценке спектроскопия УФ-вид.
Примечание: по крайней мере 200 ng необходима для следующих экспериментов.
- Конец Prep реакции
Примечание: следуйте производитель ' s Инструкция и при необходимости измените. Использование 30 нг cfDNA; и 1 мкг геномная ДНК как элемент управления.- Добавить 7 мкл буфера реакции, 3 мкл фермента смеси, 30 нг cfDNA в стерильную пробирку нуклеиназы бесплатно и добавить ddH 2 O суммарный объем 60 мкл. В отдельном трубку, добавить выше компонентов, но с 1 мкг геномная ДНК вместо cfDNA.
- Смесь и инкубировать смеси при 20 ° C в течение 30 мин, затем 65 ° C для 30 мин в Термоциклер без крышки с подогревом. Немедленно приступить к следующему шагу.
- Адаптер лигирование
- Добавить 30 мкл лигирование мастер смеси, 1 мкл лигирование усилитель и 4 мкл уникальную последовательность адаптеров в смесь из шага 2.2.
- Инкубировать при 20 ° C 15 мин в Термоциклер без крышки подогревом.
- Вихрь Ресуспензируйте магнитные шарики и оставить бисер на комнатной температуре по крайней мере 30 мин перед следующим этапом.
- 87 мкл ресуспензированы магнитные шарики в ранее упомянутых смесь; Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз и затем инкубации при комнатной температуре за 5 мин.
- Мыть и воздуха сухой бисер, как описано в шаге 2.1.
- Элюировать ДНК целевой из бисера, добавив 20 мкл 10 мм трис-HCl (рН 8).
- Обогащения ДНК фрагментов лигируют с адаптером
- добавить 20 мкл адаптер лигируют ДНК фрагментов, 5 мкл индекс грунт/i7 (2,5 мкл грунт-P7 (10 вечера) и 2,5 мкл грунт-P5 (10 г), для целей последовательности), 25µL из Библиотека амплификации Мастер микс и ddH 2 O суммарный объем 50 мкл.
- PCR усиливает адаптер лигируют ДНК и тепловой цикл следующим: первоначальный Денатурация при 98 ° C на 45 сек, затем 8 циклов (cfDNA) или 4 циклов (геномная ДНК) отжига ° C 15 s, 65 ° C для 30 s, 72 ° C за 30 s) и окончательное расширение при 72 ° C для 60 s, а затем проведение температуры на 4 ° C.
- Добавить 45 мкл взвешенных магнитные бусы на ПЦР обогащенный ДНК для получения фрагментов приобретенных.
- Элюировать ДНК фрагментов с адаптерами в 30 мкл 10 мм трис-HCl (рН 8).
- Библиотека контроля качества
- следовать производитель ' протокол s для коммерческих комплект для измерения адаптер лигируют концентрации ДНК. Используйте bioanalyzer для определения качества ДНК.
3. Целевые захвата ДНК
Примечание: цели обогащения была выполнена с использованием пользовательской последовательности захвата зонд, который разработан специально для обогащения 1021 КБ целевого региона, охватывающих известных опухольассоциированных драйвер мутации от 12 различные типы опухолей. Изменения в производителя ' в следующих шагах подробно изложены протокол s.
- Блокирование
- Добавить 1,5 мкг Объединение библиотек (максимальное количество библиотек в пул для cfDNA-6, геномная ДНК — 20) из шага 2, 8 мкл P5 Block(100P), 8 мкл P7 Block(100P) и 5 мкл Cot-1 ДНК (1 мкг/мкл) в стерильную пробирку. Сухие содержимое тюбика, с помощью вакуума концентратор установлен на 60 ° с.
- Hybridize, захват ДНК зонды с библиотекой.
- 3.1: 8.5 мкл следующие компоненты для трубки из шага 2 X гибридизации буфера, 2.7 мкл гибридизации усилитель, и 1.8 мкл свободной от нуклеиназы ddH 2 O.
- Mix, закупорить вверх и вниз и инкубировать в thermomixer на 95 ° C в течение 10 мин.
- После инкубации, немедленно мкл 4 Custom зонда. Проинкубируйте образцы в тепловой циклователь на 65 & #176; C с крышкой, нагревают до 75 ° C в течение 4 ч.
- ДНК фрагментов захвата
- инкубировать гибридизированные ДНАО цели с бисером стрептавидина следуют стиральные шарики для удаления несвязанных ДНК. Используйте коммерческих комплект согласно данным производителя ' s инструкции для получения окончательного 20 мкл ресуспензированы бусы с захваченных ДНК фрагментов.
- Фрагменты амплификации ДНК, захваченных
- выполнять ПЦР с использованием коммерческих комплект с 2 мкм позвоночника олигонуклеотиды, по словам производителя ' s инструкции.
- Реакции PCR когда завершена, 45 мкл взвешенных бусины непосредственно на продукт PCR и обогатить усиливается целевых фрагментов ДНК, связаны с бисером элюирование с 30 мкл 10 мм трис-HCl (рН 8).
- Количественно фрагментов ДНК с комплектом библиотека количественной оценки и определить длину средняя фрагмент по Bioanalyzer ( рис. 2).
4. секвенирование
- последовательность мультиплексированных библиотек с использованием 75 работает в паре конец bp на benchtop секвенсор для 18 ч всего данных производится до 60 гигабайт, 15 G требуется для пациентов образцов cfDNA и 1G для управления геномная ДНК образца.
5. Рабочий процесс анализа данных
Примечание: Рисунок 3 показывает процесс анализа общей работы потока и данных. Ниже показаны параметры анализа данных и команд.
- Фильтр низкого качества чтения и исправить ошибки и маскировки UID, используя NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter фильтр - q 0.5 -l 5 - 0,1 n -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o выход dir -p префикс -u 4 -s 7 - м 3 -я uidFile-ф - Ссылка генома hg19 (генома человека 19), найдите последовательности результатов с использованием мем ВСБ (версия 0.7.12-r1039) и выровняйте с геном инструментарий анализа (GATK) (версия 3.4-46-gbc02625).
ВСБ мем -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -Л targetRegion-известный dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - я cancerBam-я normalBam
java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-банку GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-известный dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals интервалы-я cancerBam-я normalBam - Кластера дубликаты по UID и позицию шаблона фрагментов, которые будет исправить ошибку базы представленный ПЦР/последовательности и изменять базовые качества.
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq кластера -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion output_dir -o -p
префикс -m 6 - повторно выровнять кластерного дубликаты, BWA катализатор
ВСБ мем -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - выполняют местные перестройки, следуют рекалибровки показатель базового качества с помощью GATK (версия 3.4-46-gbc02625).
Loacal перестройки: java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-банку GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -Л targetRegion-известный dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Я cancerBam-я normalBam
java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-банку GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-известный dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals интервалы-я cancerBam-я normalBam
базовый показатель качества калибровка: java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - targetRegion -Л hg19 банку GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R - knownSites dbsnp - knownSites космические - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - я bam -o grp java-d64-сервер - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-банку GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-я БАМ - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - для SNV (единого нуклеотидом вариант) и INDEL (небольшие вставки или удаления) вызов, точность низкой частоты мутаций далее подтверждается GSR (хорошая поддержка читает) с обоими вперед и обратного стренги читать пар и фильтрации через контрольную группу (герминальных мутаций) и основной базой данных.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - использовать базовые образцы как элемент управления для вызова CNV (копия номер вариация).
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv--normgt normalBam--tumgt--repdb cancerBam repeatMarsk - Realigned не нанесенных на карту, клипы и Дискордантные пары читает для вызова SV (структурные изменения).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x Стенограмма -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Зонды 1021 Кб, обогащенный целевых регионов, используемые в ER-Seq приведены в таблице 1, которая охватывает более 95% мутаций гена в 12 распространенных опухолей. Широкий спектр этих датчиков делает этот процесс применимы для большинства больных раком. Кроме того наша уникальная последовательность адаптеры и базовой базы данных скрининга позволяют точно обнаружить редкой мутации.
Из-за различных свойств геномная ДНК и cfDNA, извлеченные из периферической крови есть широкий спектр качества данных, который определяется различных инструментов и контроль качества, показано в таблице 2. Успешно извлеченного cfDNA должно отображаться пик Размер ~ 170 bp, как анализирует bioanalyzer КК и показано в рисунке 1. Большие фрагменты указывают на загрязнение от genomic дна, которые не должны появляться в конечный продукт. ДНК, извлеченные из этого пациента образца был достаточного качества и количества для ER-Seq (cfDNA - 42,6 нг; геномная ДНК - 3,426 мкг).
Цель захвата ДНК с помощью пользовательских зонда был затем усиливается ПЦР. Размер Средняя фрагмент был оценен bioanalyzer и представитель данные для пациента cfDNA в рисунок 2A показан пик около ~ 320 bp и уникальной группы на геле агарозы. Геномная ДНК должен появиться как мазок на геле агарозы, как показано на рисунке 2B. Качества обеих библиотек были приемлемыми для последующего последовательности.
После виртуализации, данные были проанализированы в соответствии с рабочего потока на рисунке 3B. Чтобы проиллюстрировать преимущества наших ER-Seq по сравнению с традиционным методом, мы исполняли оба анализа с использованием того же образца. Результаты из обоих анализа приведены в таблице 3 и таблице 4. Мы показали, что ER-Seq улучшает глубину охвата на 23% по сравнению с традиционным методом (Таблица 3, 3214.3 читает в ER-Seq против 2475 читает в традиционный анализ), который был из-за его эффективного восстановления cfDNA молекул, таким образом значительно расширение анализ редких мутаций. Ясно также, что уникальная последовательность адаптеры, используемые в ER-Seq позволяют легко дифференциация природных и ПЦР индуцированной дублирования (Таблица 3, 0, индуцированной ПЦР дублируется читать в ER-Seq). Кроме того мы нашли в результаты вызова, что анализ, основанный на ER-Seq 100% последовательной для обнаружения p.L858R EGFR и что частота обнаружения был немного выше (2.7% против 1,2%), когда по сравнению с традиционным анализом (Таблица 4). Важно отметить, что анализ ER-Seq включено обнаружение других относительно низкой частоты мутаций, включая EGFR p.T790M (вариации частоты 0,53%) (Таблица 4), и это не была признана традиционного анализа из-за высокий фоновый шум.
Рисунок 1. Представитель КК результат из успешно изолированных cfDNA
Для левой диаграммы оси X показывает размер фрагментов (bp) и оси Y указывает относительный флуоресценции единиц (фу). Основной размер cfDNA-~ 170 bp и есть нет больших фрагментов загрязнения. Справа показано имитируемых электрофореза геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Пример библиотеки КК проанализированы.
Ось X показывает размер фрагментов (bp) и оси Y указывает относительный флуоресценции единиц (фу). Смоделированные электрофореза геля была показана на право каждого графа. (A) пациента cfDNA пример показал острый пик после того, как он был усилен с адаптерами. (B) контроля геномная ДНК образца показали равномерно фрагменты не острый пик и без предвзятости к одной стороне. Оба образца приемлемы для последующего последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. ER-Seq работы потока.
(A) Общие рабочего потока. (B) анализ работы потока данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 2735 экзонов региона экзона 70 генов | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | АРАФ | БАНКОМАТ НА ТЕРРИТОРИИ ОТЕЛЯ |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | БТК | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ЭРГ | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | ГНАС |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Таблица 1. 1021 КБ зонды обогащенного целевых регионов.
Эти регионы включены: 2735 экзонов от 170 генов; интронов, промоутер регионов и регионов останова из 24 генов; 1122 экзонов из 847 связанных генов. Они охватывают более 95% опухоли связанных драйвер мутации и целевой мутации сайты из 12 наиболее распространенных опухолей (рак легких, колоректального рака, рака желудка, рака молочной железы, рак почки, поджелудочной железы, рак печени, рак щитовидной железы, рак шейки матки, Рак пищевода и рака эндометрия).
| ДНК | Результат | Указание | Идеальный диапазон |
| cfDNA | Размер фрагментов | Идентификация фрагментов ДНК распределения | 168bp±20(a) |
| Концентрация | Более точное количественное определение ДНК | Общая cfDNA ≥30ng(b) | |
| Геномная ДНК | A260/A230 | Идентификация химических загрязнителей (например, этанол) | 1.50 – 2,2 |
| A260/A280 | Выявление белковых загрязнений | 1.60 – 2,2 | |
| Концентрация | Количественное определение ДНК | Общая геномная ДНК > 3ug |
Таблица 2. Анализ качества cfDNA и геномная ДНК, извлеченные из периферической крови.
Пик cfDNA площадью около 170Bp. контроль качества должен осуществляться стандартизованный метод для 2100 Bioanalyzer для определения уровней загрязнения деградации и/или геномная ДНК образца. Пик анализ качества добычи cfDNA должно выглядеть на рисунке 1. Обратите внимание, что возросло количество ДНК приведет к библиотеке с более высоким качеством для эффективного обнаружения редкой мутации в cfDNA. Мы рекомендуем использовать по крайней мере 30 нг cfDNA (30.000 экземпляров).
Таблица 3. QC ER-Seq информационного анализа и анализа традиционных информации.
Темно серый голы указывает на увеличение глубины охвата произошло в ER-Seq, по сравнению с традиционными методами; Изюминкой светло серый указывает не ПЦР индуцированной дублируется чтения в ER-след пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Джин | Chr | Начало | Конец | cHGVS | pHGVS | Функция | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Традиционный var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Миссенс | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Миссенс | Действия | 0.0270 | 0.0120 |
| БАНКОМАТ НА ТЕРРИТОРИИ ОТЕЛЯ | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | фреймшифт | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Миссенс | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Миссенс | Действия | 0.0053 | ——(0.0013) |
| WBT | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Миссенс | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Таблица 4. Результат вызова ER-Seq анализ информацииЭто и традиционный анализ информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существование циркулирующей ДНК опухоли (ctDNA) было обнаружено более 30 лет назад, однако применение ctDNA анализов до сих пор не рутинной в клинической практике. С развитием технологий для обнаружения ctDNA и анализа возрос интерес к практическому применению методов ctDNA. Опухоль мониторинг с ctDNA предлагает минимально инвазивной подход для оценки микроскопических остаточной болезни, ответ на терапию и опухоль молекулярные профили под фон опухоли эволюции и внутриопухолевых неоднородность13, 14. Улучшения в чувствительности и специфичности анализа будет способствовать все эти приложения15,16.
В этой рукописи мы ввели ER-Seq, перспективных методов, направленных на улучшение чувствительность обнаружения ctDNA, используя НМРЛ случай в качестве примера. По сравнению с традиционными анализа, применения нашей уникальной последовательности адаптеров в ER-Seq значительно улучшили свою чувствительность и специфичность, свидетельствует увеличение глубины охвата и способность обнаруживать низкой частоты мутаций (например EGFR p. T790M (0,53%)). Существование T790M в этом образце пациента может быть фактором, способствующим эрлотиниб сопротивления и дал понять, как лучше лечить Этот пациент, предполагая использование ингибитора третьего поколения EGFR конкретных для T790M, например AZD929117-20. Другой критической точки в ER-Seq, что способствует его чувствительности и специфичности является базовой базы данных проверки, которая облегчает точное обнаружение низкой частоты мутаций в ctDNA путем отфильтровывания фонового шума.
Хотя ER-Seq имеет много преимуществ, которые делают его превосходит традиционные методы, есть еще некоторые проблемы, которые необходимо преодолеть. Одна из основных задач для ER-Seq является крайне низкий уровень ctDNA в крови. Для этих низкой частоты мутаций приобретение достаточно шаблон ctDNA является критическим. Наш уникальный адаптеры значительно увеличить скорость переработки ctDNA, хотя они все еще нуждаются в улучшении. Еще одной проблемой для ER-Seq и для всех других методов секвенирования, является ограничение охвата целевых регионов. Наши выбранных 1021 КБ зонд обогатили регионов, которые могут охватывать около 95% мутаций, связанных с опухолью, носят более всеобъемлющий характер по сравнению с другими малых плоскости методы21,22,23. Однако как неоднородность опухоль была признана хорошо и были обнаружены все больше и больше опухоли биомаркеров, относительные показатели охвата скорость наши зонды обогатили регионов уменьшается. Чтобы лучше служить в качестве инструмента для ранней диагностики и мониторинга заболеваний пациентов опухоли, необходимы более всеобъемлющих методов секвенирования и анализа. В настоящее время ER-Seq по-прежнему опирается на большой объем данных для обнаружения низкой частоты мутаций. Дальнейшее совершенствование использования данных может быть благоприятным для применения ER-последующие
Как отмечалось выше, существуют многочисленные ограничения, связанные с ER-Seq. Однако наш уникальный анализ техники по-прежнему имеет много преимуществ по сравнению с другими методами Топ рейтинг в этой области. Плюсы и минусы этой методики заслуживают дальнейшего исследования. Потенциал ER-Seq для обычного клинического использования будет иметь большое значение для клинических врачей, предоставляя мощный инструмент для диагностики опухолей и монитор опухоли динамики и ответа на терапию. Новые мутации, связанные с сопротивлением для обычных и целенаправленной терапии, нашли наш анализ может предложить новые возможности лечения для больных раком с заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается Институтом Geneplus – Пекин.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
