Summary
Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.
Abstract
Tümör DNA (ctDNA) yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak dolaşan analiz klinik Onkoloji gelişimi için değerli bir araç haline gelmiştir. Ancak, bu yöntem uygulama ctDNA kan eser miktarda analiz onun düşük duyarlılık nedeniyle zordur. Ayrıca, yöntem bu sıralama ve sonraki analiz yanlış pozitif ve negatif sonuçlar oluşturabilir. Fizibilite ve ctDNA algılama klinikte güvenilirliğini artırmak için burada sıralama, nadir mutasyon sıralama (ER-Seq) zenginleştirmek için nadir mutasyonlar zenginleştiren bir tekniği mevcut. ER-Seq son derece düşük frekanslı genetik değişiklikleri algılamak için umut verici bir araçtır ve böylece hastalık heterogenicity okumak çok yararlı olacak tek bir mutasyon 1 x 107 vahşi tipi nükleotit, dışarı ayırabilirsiniz. Benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı'nın ligasyonu sayesinde bu yöntem aynı zaman hataları uzmanlığından (anlam ve Antisens) için düzeltme iken, ctDNA molekülleri, verimli bir kurtarma sağlar. 1021 kb sondalar bizim seçim kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştiren 12 tümör tümör ile ilgili sürücü mutasyonların % 95'i. Bu maliyet-etkin ve evrensel yöntem genetik veri benzersiz olarak başarılı bir birikimi sağlar. Verimli bir şekilde arka planda hata filtreleme sonra ER-seq nadir mutasyonlar tam olarak algılayabilir. Bir örnek çalışma kullanarak, sonda tasarım, Kütüphane yapı ve hedef DNA yakalama yöntemleri, veri analizi iş akışı da dahil olmak üzere süre gösteren ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Genellikle bu yöntem taşımak için işlem 1-2 gün sürer.
Introduction
Yeni nesil sıralama (NGS), soykırım, sırlarını araştırmak için güçlü bir araç genetik değişiklikler ortaya çıkarabilir bilgi büyük miktarda sağlayabilir. NGS analizde klinik uygulama özellikle kişiselleştirilmiş tıp daha yaygın hale gelmiştir. NGS, en büyük sınırlamaları ancak, yüksek hata oranı biridir. Eğitim devralınan mutasyonlar için uygun sayılır, özellikle DNA analiz "sıvı biyopsisi" elde edilen nadir mutasyon analizi büyük ölçüde sınırlı1,2, olsa da.
Tümör dolaşan DNA (ctDNA) boş hücre DNA (cfDNA) tümör hücreleri döken kan var. Çoğu durumda ctDNA onun algılama ve analiz zorlayıcı olun son derece düşük miktarıdır. Ancak, ctDNA çok çekici özelliklere sahiptir: onun yalıtım minimal invaziv, tümör büyüme erken dönemlerinde algılanabilir, ctDNA düzeyi terapötik etkinlik yansıtır ve ctDNA içeren birincil ve metastatik lezyonlar bulunan DNA mutasyonları 3 , 4 , 5. bu nedenle, hızlı bir gelişme NGS tekniği ve analiz göz önüne alındığında, başvuru ctDNA algılama daha cazip oldu.
Farklı kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar ctDNA tespiti için kullanılan ama bu yaklaşımlardan hiçbiri kliniklerde sınırlamaları nedeniyle rutin kullanım için kabul edildi: düşük duyarlılık, çok yönlülük eksikliği ve nispeten yüksek maliyetli6 ,7,8. Örneğin, bir benzersiz tanımlayıcı etiketi (UID), temel çift yönlü sıralama Art arda sıralama hatalarının en takviyeli-fikir birliği uzmanlığından hataları düzeltir. Ancak, bu yöntemin fizibilite düşük veri kullanımı9,10ve yüksek maliyet nedeniyle kaybolur. Doğruluk ve evrensellik bu yöntemlerin geliştirilmesi gerekir rağmen benzer şekilde, CAPP Seq ve geliştirilmiş, yineleme, CAPP-IDE11,12, büyük pratiklik cfDNA algılama var.
Doğru ctDNA algılama ve çözümlemesi geçerli ihtiyacını karşılamak için yeni bir strateji, nadir mutasyon zenginleştirmek (ER-Seq) sıralama geliştirdi. Bu yaklaşım aşağıdaki birleştirir: Çift yönlü hata düzeltmesi ve dışarı-in tek bir mutasyon ayırt yeteneği ile ctDNA molekülleri verimli bir şekilde kurtarmak için benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı > 1 × 107 vahşi tipi nükleotit; kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştirmek 1021 kb probları %95 12 tümörler akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, dahil olmak üzere, gelen tümör ile ilgili mutasyonların Rahim ağzı kanseri, yemek borusu kanseri ve rahim Karsinomu (tablo 1); ve verimli ve nadir mutasyonlar ctDNA içinde tam olarak algılamak kolay hale temel veritabanı eleme.
Temel veritabanı oluşturmak için ER-Seq tarafından tüm gen mutasyonlarının örnekleri (~ 1000 başına) aynı türde bir dizi bulmak. Bu gerçek mutasyonlar diğer çeşitli güvenilir algılama yöntemleri ve analiz tarafından doğrulanması gerekir. Daha sonra yanlış mutasyonların desen özetlemek ve tüm yanlış mutasyonlar ilk temel veritabanı oluşturmak için küme. Yanlış mutasyonlar sonraki sıralama deneylerden buldum bu veritabanına eklemeye devam edin. Bu nedenle, bu temel veritabanı sıralama doğruluğu önemli ölçüde artıran bir Dinamik Genişletilmiş veritabanı olur.
Tümör tanısı ve takibi devam teşvik etmek, ER-Seq, evrensel veri edinimi için düşük maliyetli ve uygulanabilir bir yöntem mevcut. Biz ER-Seq analizi, uygulanan bir vaka nadir mutasyonlar ve fizibilite kullanmak için klinikte algılama doğruluğunu gösteren mevcut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
tümör örnekleri ve kan örnekleri Etik Komitesi, Pekin Üniversitesi insanlar tarafından onaylanmış bir protokolüne göre elde ' s hastane. Yazılı Onam saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için hastalardan elde edildi. Katılımcılar aşağıdaki kriterlere göre ekranlı: erkek, Gelişmiş sigara-küçük hücreli akciğer kanseri, EGFR p.L858R mutasyon belirtilen önceki Sanger sıralama tarafından hastalık ilerleme EGFR iki oturumu takip hedefli tedavi Erlotinib ile ve ER-ctDNA direnç nedeninin çözümlemek ve yeni hedef uyuşturucu bulmak için uygulanan Seq.
1. DNA çekme--dan cfDNA ve genomik DNA (gDNA) için periferik kan
- periferik kan toplama tüp 10 mL toplamak, yavaşça yukarı ve aşağı 6 - 8 kez için tersine çevirin karıştırın. Hücre kesme önlemek. Kan örnekleri saklanabilir toplama tüp 6-37 ° c ilâ 72 saat.
- Toplama tüp, oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi 1600'de (±150) x g.
- Dört temiz 2 mL uygun şekilde santrifüj tüpleri Pelet Katmanı (beyaz kan hücreleri) bozmadan bir tek kullanımlık damlalıklı kullanarak etiketli koleksiyonu tüpünden süpernatant (plazma) transfer.
- Transfer1 mL 2 ml temiz tek kullanımlık damlalıklı uygun kullanarak hücre santrifüj tüpü etiketli. Hücreler saklı-20 ° c veya daha önce adım 1.8 daha soğuk olabilir.
- (Kimden adım 1.3) plazma 4 ° C'de 10 dakika ve 16000 (±150) için santrifüj kapasitesi g. x
- Transfer düzgün olarak etiketli santrifüj tüpleri temizlemek için plazma " plazma ", kirlenmesini önlemek için alt kısmında kalan birim ~0.1 mL bırakın. Adım 1,7 kadar plazma-80 ° C'de depolayın.
- Plazma adım 1.6 3 mL cfDNA (içeren ctDNA) belirlemek için kullanın üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak ' s yönergeleri.
- Kullanım 200 µL üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak gDNA yalıtmak için adım 1.3 beyaz kan hücrelerinin ' s yönergeleri.
Not: Her ikisi de cfDNA ve gDNA-20 ° c kullanmadan önce saklanabilir. - CfDNA ve gDNA (Tablo 2) için farklı kalite denetimleri uygulanır. Kalite kontrol için örnek yıkımı ve/veya gDNA kirlenme düzeylerini belirlemek bioanalyzer standart bir yöntem yerine getirilir. CfDNA ayıklama kalitesini analizini tepe şekil 1 ' e benzer görünmelidir.
Not: CfDNA en yüksek boyutu yaklaşık 170 olduğunu bp. Not cfDNA nadir mutasyonların etkili tespiti için daha yüksek bir kalite kitaplığındaki DNA miktarını artırarak sonuçlanır. En az 30 ng cfDNA (30.000 kopya) kullanmanızı öneririz.
2. Kütüphane hazırlık
Not: temel Kütüphane inşaat parçalanmış DNA ile ilgili olarak cfDNA en yüksek boyut ~ 170 bp ile parçaları bulunmaktadır ve böylece birleştirilmesi gerekmez.
- Parça denetimi örneği (gDNA) tarafından sonication 200-250 bp parçaları elde etmek için.
- Hazırlamak 1 µg Tris-EDTA arabelleği bir temiz sonication tüp 100 µL gDNA örneğinin.
- Sonication programı 30 küme s 12 dk. toplam 12 döngüleri için kapalı açık ve 30 s
- Ürün (5 µL) içeren 200-250 bp parçaları % 2 özel jel ile bir analiz çalıştırarak sonication sonra onaylamak.
- Tüm parçalanma ürünleri için yeni bir 1,5 mL tüp aktarmak ve 150 µL doğru parçaları seçmek 5 min için manyetik boncuklar ile kuluçkaya.
- Süpernatant kaldırmak için 30 manyetik bir raf üzerinde tüp koyarak s.
- Manyetik raf kalan tüp boncuk 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ile yıkayın. 30 için kuluçkaya süpernatant kaldırmadan önce s. Bir kez yineleyin.
- Hava kuru manyetik raf kalırken açık tüp kapaklı boncuk. DNA hedef de kurtarır emin olmak için overdried boncuk kaçının. DNA parçaları boncuk boncuk miktar tarafından UV/Vis spektroskopisi tarafından takip DNA parçalarının gidermek için 10 mm Tris-HCl (pH 8) 32 µL ekleyerek elute.
Not: en az 200 ng aşağıdaki deneyler için gerekli.
- Son hazırlık tepki
Not: takip üretici ' s öğretim ve gerektiği gibi değiştirin. CfDNA kullanım 30 ng; ve gDNA denetim olarak 1 µg. CfDNA steril nükleaz ücretsiz tüp,- eklemek 7 µL tepki arabelleği, enzim karışımı 30 3 µL ng ve GKD 2 O 60 µL toplam hacmi ekleyin. Ayrı bir tüp içinde yukarıdaki bileşenleri eklemek ama gDNA cfDNA yerine 1 µg.
- Mix ve karışımı 30 dk 65 ° C 30 dk içinde bir thermocycler için ısıtmalı kapağı takip için 20 ° C'de kuluçkaya. Hemen bir sonraki adıma devam.
- Bağdaştırıcısı ligasyonu
- ekleyin 30 µL ligasyonu ana karışımı, 1 µL ligasyonu artırıcı ve 4 µL karışıma benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı adım 2.2.
- Incubate bir thermocycler ısıtmalı kapağı olmadan içinde 15 dakika 20 ° C'de.
- Manyetik boncuklar resuspend ve boncuklar, oda sıcaklığında en az 30 dk önce bir sonraki adım için bırakmak için girdap.
- 87 µL resuspended manyetik boncuklar daha önce sözünü ettiğimiz karışıma ekleyin; de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın ve sonra 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya
- Yıkama ve hava kuru boncuk adım 2.1 içinde açıklandığı gibi.
- 10 mm Tris-HCl (pH 8) 20 µL ekleyerek boncuk DNA hedeften elute.
- Bağdaştırıcısıyla bakmaksızın zenginleştirme DNA parçalarının
- Ekle 20 µL bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA parçaları, dizin astar/i7 5 µL (2.5 µL astar-P7 (10 pM) ve astar-P5 (10 pM), 2,5 µL sıralama amaçları için), 25µL, Kütüphane amplifikasyon ana mix ve GKD 2 O toplam hacmiyle 50 µL.
- PCR yükseltmek bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA ve termal döngüsü aşağıdaki gibi: 45 için 98 ° C'de ilk denatürasyon ardından 8 döngüsü (cfDNA) veya 4 döngüleri (gDNA) tavlama 15 ° C, s, s, 65 ° C 30 s, 30 72 ° C s) ve son bir uzantısı 60 72 ° C'de s sonra sıcaklık 4'te holding ° C.
- Alınan parçaları almak için PCR zenginleştirilmiş DNA için askıya alınmış manyetik boncuklar eklemek 45 µL.
- Elute DNA parçaları 10 mm Tris-HCl (pH 8) 30 µL bağdaştırıcılarla.
- Kütüphane kalite kontrol
- üretici takip ' s protokolü için bağdaştırıcı ölçmek ticari teçhizat bakmaksızın DNA toplama. Bioanalyzer DNA kalitesini belirlemek için kullanın.
3. Hedef DNA yakalama
Not: hedef zenginleştirme bilinen tümör ilişkili sürücü mutasyonlar 12 kapsayan bir 1021 kb hedef zenginleştirme bölge için bir özel sıra yakalama-sonda özel olarak tasarlanmış kullanarak gerçekleştirilen yapıldı. tümör farklı türleri. Üretici değişiklikler ' s protokolü aşağıdaki adımları ayrıntılı.
- Kütüphaneler havuz engelleme
- eklemek 1.5 µg (havuzu cfDNA için kitaplıklarına en fazla sayısı 6, gDNA 20) adım 2, P5 Block(100P), P7 Block(100P) 8 µL ve karyolası-1 DNA'ın 5 µL 8 µL (1 µg/µL) steril bir tüp. 60 dakikaya ayarla vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüp içeriğini kuru ° C.
- DNA yakalama probları ile kütüphane Hybridize.
- 3.1: 8.5 µL 2 X hibridizasyon arabellek, hibridizasyon artırıcı, ve 1.8 µL GKD nükleaz ücretsiz 2 O. 2.7 µL adım tüpünden için aşağıdaki bileşenleri ekleyin
- Mix tarafından yukarı ve aşağı pipetting ve bir thermomixer 10 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya
- Kuluçka hemen özel yoklama, 4 µL ekleyin. 65 ve #17, termal cycler örneklerinde kuluçkaya6; C kapak ile ısıtılan 75 ° c 4 h için
- DNA parçaları yakalama
- streptavidin boncuk boncuk ilişkisiz DNA çıkarmak için yıkama tarafından takip ile melezleşmiştir hedef DNA kuluçkaya. Üretici göre ticari setini kullanın ' resuspended boncuk yakalanan DNA ile son 20 µL almak için s yönergeleri parçaları.
- Yakalanan DNA amplifikasyon parçaları
- gerçekleştirmek ticari kullanarak PCR kiti 2 µM omurga oligonucleotides ile üretici göre ' s yönergeleri.
- Ne zaman PCR reaksiyon tamamlandığında, askıya alınan boncuk 45 µL PCR ürüne doğrudan ekleme ve boncuk için 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile 30 µL elüsyon tarafından bağlı güçlendirilmiş hedef DNA parçalarının zenginleştirmek.
- Sayısal Kütüphane miktar kiti ile DNA parçalarının ve Bioanalyzer ( Şekil 2) ortalama parça boyla belirlemek.
4. sıralama
- sıra multiplexed 18 h. toplam veri üretilen 60 gigabayt için 75 bp eşleştirilmiş uç ishal üstünde bir benchtop sequencer kullanarak kütüphaneleri, 15 G hasta örnek cfDNA ve 1 G için denetim örnek gDNA için gerekli.
5. veri analizi iş akışı
Not: şekil 3 genel iş akışı ve veri analiz süreci görüntüler. Veri analiz parametrelerini ve komutları aşağıda gösterilir.
- Filtre düşük kaliteli okuma ve hataları ve NCfilter kullanarak UID maskeleme için doğru.
NCfilter(own)
NCfilter filtre -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o çıkış dir -p önek -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f. - Referencing genom hg19 (insan genomu 19), BWA (sürüm 0.7.12-r1039) mem kullanarak sıralama sonuçları bulun ve genom analizi Toolkit (GATK) (sürüm 3.4-46-gbc02625) yeniden hizalayın.
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp bilinen —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - ı cancerBam-ı normalBam
java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp bilinen
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam - Küme UID ve üsleri PCR/sıralama tarafından tanıtıldı ve temel kalite değiştirmek hata düzeltmek üzere şablon parçaları konumunu göre çoğaltmaları.
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq - p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir küme
-m 6 önek - BWA mem. tarafından kümelenmiş çoğaltmaları yeniden Hizala
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - temel kalite puanı GATK (sürüm 3.4-46-gbc02625) kullanarak ayarlamayı tarafından takip yerel bir yeniden düzenlenmesi gerçekleştirmek.
Loacal yeniden düzenlenmesi: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals bilinen -nt 10 -CancerBam-ı normalBam
java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals bilinen aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam
temel kalite puanı ayarlamayı: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kozmik - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ben bam -o grp java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T kavanoz PrintReads-ben bam - BQSR CTP -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - (tek nükleotid varyant) SNV ve INDEL (küçük eklemelerin veya silmelerin) arama için düşük frekans mutasyonlar doğruluğunu daha da GSR (iyi destek okur) tarafından her ikisi ile doğrulanır ileriye ve geriye doğru strand çiftleri ve filtrasyon kontrol grubu (germline mutasyonlar) ve temel veritabanı aracılığıyla okuyun.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - KNV (kopya numarası varyasyon) çağrıları yapmak için bir denetim olarak temel örnekleri kullanır.
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion KNV--normgt normalBam tumgt--cancerBam--repdb repeatMarsk - klipler ve SV (yapısal farklılıklar) aramak için uyumsuz çift okuma eşlenmemiş, Realigned.
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transkript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ER-Seq içinde kullanılan zenginleştirilmiş hedef bölgeleri tablo 1' de gösterilen 1021 kb probları hangi kapakları 12 ortak tümörler gen mutasyonlarının % 95'den fazla. Bu sondalar çeşitli kanser hastalarının çoğunluğu için geçerli bu işlem sağlar. Ayrıca, bizim benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı ve temel veritabanı tarama nadir mutasyonlar kesin olarak tespit etmek mümkün kılar.
GDNA ve periferik kan çıkarılan cfDNA farklı özellikleri nedeniyle, veri kalitesi, kalite denetimleri tablo 2' de gösterilen ve farklı aygıtlar tarafından belirlenen bir dizi vardır. Başarıyla ayıklanan cfDNA ~ 170 bioanalyzer QC tarafından analiz olarak kan basıncı ve gösterildiği şekil 1' in en yüksek boyutu görüntülenmelidir. Büyük parçaları son üründe görünmemesi gereken genomik DNA kirlenme gösterir. Bu hasta örneğinden çıkarılan DNA'sı yeterli kalite ve miktar için ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng; gDNA - 3,426 µg).
Özel bir sonda kullanarak hedef DNA yakalama sonra PCR tarafından güçlendirilmiş. Ortalama parça boyutu için bir hastanın cfDNA bir tepe civarında ~ 320 gösterdi 2A rakam olarak bioanalyzer ve temsilcisi verileri tarafından değerlendirilmiştir bp ve özel jel üzerinde benzersiz bir grup. gDNA olarak bir özel jel üzerinde bir smear şekil 2Biçinde gösterildiği gibi görünmesi gerekir. Her iki kütüphane kaliteleri sonraki sıralama için kabul edilebilir.
Sonra sıralama, veri sırayla şekil 3Biş akışında göre analiz edildi. Bizim ER Seq geleneksel yöntem karşı avantajları göstermek için aynı örnek kullanarak her iki analizler yapılır. Her iki analizleri sonuçlarını tablo 3 ve tablo 4gösterilir. ER-Seq 23 cfDNA molekülleri, onun verimli kurtarma nedeniyle olduğu böylece büyük ölçüde geleneksel yöntem ile (tablo 3, ER-Seq vs 2475 okuma geleneksel analiz 3214.3 okur), göre % kapsama derinliği artırır gösterdi nadir mutasyon analizi geliştirilmesi. Bu da ER-Seq içinde kullanılan benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı kolay doğal ve PCR kaynaklı mükerrer farklılaşma etkinleştirmek açıktır (tablo 3, PCR indüklenen 0 çoğaltılamaz okumak ER-Seq içinde). Ayrıca, arama sonuçlarında ER-Seq üzerinde dayalı analiz % 100 EGFR p.L858R algılama için tutarlı ve algılama sıklığını biraz daha yüksek (% 2.7 vs % 1.2) iken geleneksel analiz (tablo 4) ile karşılaştırıldığında olduğunu bulduk. Önemlisi, ER-Seq analiz EGFR p.T790M (varyasyon frekans %0,53) dahil olmak üzere diğer nispeten düşük frekanslı mutasyonların algılama etkin (Tablo 4), ve bu yüksek arka plan gürültü nedeniyle geleneksel analiz tarafından tanınmadı.
Şekil 1. Temsilcisi QC sonuç, başarılı bir şekilde izole cfDNA
Sol grafiklerde parça boyutu (bp) X eksenini gösterir ve Y ekseni göreli Floresans birimleri (FU) gösterir. ~ 170 birincil büyüklüğünde cfDNA bp ve kirlenme büyük parçaları yok. Bir simüle Elektroforez jel sağ tarafta gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Örnek kütüphaneleri analiz QC.
X ekseni parça boyutu (bp) gösterir ve Y ekseni göreli Floresans birimleri (FU) gösterir. Bir simüle Elektroforez jel her grafik sağdaki gösterildi. (A)hastanın cfDNA örnek bağdaştırıcıları ile güçlendirilmiş sonra keskin bir tepe gösterdi. (B) denetim gDNA örnek gösterdi eşit olarak dağıtılmış parçaları ile hiçbir keskin tepe ve hiçbir önyargı bir yana doğru. Her iki örnekleri için sonraki sıralama kabul edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. ER-Seq iş akışı.
(A)genel iş akışı. (B) veri analizi iş akışı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 2735 ekzonlar 70 genlerin tüm exon bölgesinden | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tablo 1. 1021 kb zenginleştirilmiş hedef bölgeleri sondalar.
Bu bölgeler dahil: 2735 ekzonlar üzerinden 170 genler; intron, organizatörü bölgeler ve 24 genler bölgelerden kesme noktası; 1122 ekzonlar 847 ilgili genler üzerinden. Bunlar kapak tümör % 95'i ile ilgili sürücü mutasyonlar ve hedef mutasyon siteleri 12 en sık görülen tümörler (akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, serviks kanseri, Kanser özofagus ve rahim Karsinom).
| DNA | Sonuç | Gösterge | İdeal aralığı |
| cfDNA | Parça boyutu | DNA parçası dağıtım tanımlaması | 168bp±20(a) |
| Konsantrasyon | Daha doğru DNA miktar | Toplam cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Kimyasal kirleticiler (örneğin, etanol) tanımlaması | 1,50-2.2 |
| A260/A280 | Protein kirletici madde tanımlaması | 1.60-2.2 | |
| Konsantrasyon | DNA miktar | Toplam gDNA > 3ug |
Tablo 2. Kalite analiz cfDNA ve gDNA periferik kan ayıklanır.
CfDNA en yüksek boyutu 170Bp. olduğunu kalite kontrol örnek yıkımı ve/veya gDNA kirlenme düzeylerini belirlemek 2100 Bioanalyzer için standart bir yöntemi tarafından gerçekleştirilmesi. CfDNA ayıklama kalitesini analizini tepe şekil 1' e benzer görünmelidir. DNA miktarı artmış Not cfDNA nadir mutasyonların etkili tespiti için daha kaliteli bir kitaplıkla neden olur. En az 30 ng cfDNA (30.000 kopya) kullanmanızı öneririz.
Tablo 3. ER-Seq bilgi analiz ve geleneksel bilgi analiz QC.
Koyu gri vurgulamak ER-Seq geleneksel yöntemlere göre bir kapsama derinlik artış meydana gösterir; bir ışık gri vurgulamak yok PCR ER-Seq. yinelenen read indüklenen gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Gen | CHR | Başlat | Bitiş | cHGVS | pHGVS | İşlevi | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Geleneksel var_freq |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | Dava | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | Dava | 0.0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tablo 4. ER-Seq bilgi analiz arama sonucuolduğunu ve geleneksel bilgi analizi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CtDNA analizleri hala değil rutin klinik uygulamada uygulamadır ancak tümör DNA (ctDNA) dolaşan varlığını daha 30 yıl önce keşfedilmiştir. İlgi ctDNA yöntemleri pratik uygulama geliştirme teknolojileri ctDNA algılama ve çözümleme ile artmıştır. Tümör ctDNA ile izleme mikroskopik rezidüel hastalığı, tedavisi ve tümör moleküler profilleri altında arka plan tümör gelişimi ve intratumoral heterojenlik13Yanıt değerlendirilmesi için minimal invaziv bir yaklaşım sunuyor, 14. Duyarlılık ve özgüllük analiz iyileştirmeler tüm bu uygulamaları15,16kolaylaştıracaktır.
Bu makale, ER-Seq, NSCLC davayı örnek olarak kullanarak ctDNA algılama, duyarlılığını iyileştirme amaçlı bir umut verici yöntemi tanıttı. Geleneksel analizi ile karşılaştırıldığında, ER-Seq bizim benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı uygulanması, duyarlılık ve özgüllük bir kapsama derinlik artış ve düşük frekans mutasyonlar (EGFR p gibi algılamak için bir yetenek ile gösterilen, belirgin bir biçimde iyileştirilmiş T790M (%0,53)). T790M varlığını bu hasta örneğinde Erlotinib direnç bir faktör olabilir ve daha iyi T790M, AZD929117-20 gibi belirli bir üçüncü nesil EGFR inhibitörü kullanımına düşündüren bu hastayı tedavi etmeyi bir anlayış verdi. Bir diğer kritik nokta, duyarlılık ve özgüllük katkıda bulunan ER Seq da arka plan gürültü süzme yoluyla ctDNA düşük frekans mutasyonların tam algılama kolaylaştırır temel veritabanı tarama olduğu.
ER-Seq geleneksel yöntemleri için üstün kılan pek çok avantajı olmasına rağmen hala aşılması gereken bazı sorunlar vardır. ER-Seq için büyük zorluklardan biri ctDNA kanda mevcut son derece düşük düzeydir. Bu düşük frekanslı mutasyonlar için yeterli şablonu ctDNA edinimi önemlidir. Gelişmiş olması ihtiyaçları olsa bizim benzersiz bağdaştırıcıları önemli ölçüde ctDNA, geri dönüşüm oranını artırmak. Başka bir sorun ve tüm diğer sıralama teknikleri, ER-Seq için hedef bölgeleri kapsamında kısıtlamasıdır. Bizim seçilen 1021 kb sonda bölgeler, tümör ile ilgili mutasyonların yaklaşık % 95 kapağı olabilir, diğer küçük uçak yöntemleri21ile,22,23göre daha kapsamlı zenginleştirilmiş. Ancak, tümör heterojenite iyi tanınan ve daha fazla ve daha fazla tümör biyolojik keşfedildi gibi bizim probları göreli kapsama oranı bölgelerde düşüşler zenginleştirilmiş. Erken tanı ve hastalık tümör hastalarının izlenmesi için bir araç olarak daha iyi hizmet vermek için daha kapsamlı sıralama ve analiz teknikleri ihtiyaç vardır. Şu anda, ER-Seq hala yüksek miktarda veri düşük frekanslı mutasyonlar algılamak için kullanır. Veri kullanımı daha da geliştirilmesi ER-devamı. uygulama için uygun olabilir
Yukarıda da açıklandığı gibi ER-Seq ile ilgili birçok sınırlamalar adlı biri yok. Ancak, bizim benzersiz analiz tekniği hala bu alandaki diğer üst rütbeli yöntemleri ile karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. Artılarını ve eksilerini bu tekniği daha da araştırma hak. ER-Seq potansiyel rutin klinik kullanım için klinik doktorlar, tümörler ve monitör tümör dinamikleri ve tedaviye yanıt teşhis etmek için güçlü bir araç sağlayarak için büyük öneme sahip olacaktır. Roman mutasyonlar bizim analiz tarafından bulundu geleneksel ve hedeflenmiş tedavi direnci ile ilişkili tedavi gelişmiş hastalığı olan kanser hastaları için yeni yollar sunuyor olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Geneplus – Beijing Enstitüsü tarafından desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
- Kennedy, S. R., et al. Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing. Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).
- Shendure, J., Ji, H.
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, (2014).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
- Diaz, L. A. Jr, Bardelli, A. Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA. J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).
- Su, Z., et al. A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer. J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).
- Kukita, Y., et al. High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients. DNA Res. 22, 269-277 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy. Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).
- Schmitt, M. W., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).
- Newman, A. M., et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nat. Med. 20, 548-554 (2014).
- Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).
- Alix-Panabières, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. Circulating tumor cells and circulating tumor DNA. Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Youn, A., Simon, R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kobayashi, S., et al. EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).
- Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Jänne, P. A. Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).
- Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas. Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).
- Leary, R. J., et al. Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med. 2, (2010).
- Forshew, T., et al. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq. Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).
