Summary
Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.
Abstract
A análise de DNA do tumor (ctDNA) usando o sequenciamento de próxima geração (NGS) em circulação tornou-se uma valiosa ferramenta para o desenvolvimento da oncologia clínica. No entanto, a aplicação deste método é um desafio devido à sua baixa sensibilidade ao analisar a quantidade de rastreamento de ctDNA no sangue. Além disso, o método pode gerar resultados falsos positivos e negativos a partir desta análise de sequenciamento e subsequente. Para melhorar a viabilidade e a confiabilidade da deteção de ctDNA na clínica, aqui apresentamos uma técnica que enriquece raras mutações por sequenciamento, enriquecer a rara mutação sequenciamento (ER-Seq). ER-Seq pode distinguir uma única mutação fora 1 x 107 nucleotídeos de tipo selvagem, que o torna uma ferramenta promissora para detectar alterações genéticas extremamente baixa frequência e, portanto, será muito útil no estudo de heterogenicity doença. Em virtude da ligadura do adaptador exclusivo de sequenciamento, esse método permite uma recuperação eficiente de moléculas de ctDNA, ao mesmo tempo corrigindo para erros bidirecionalmente (sentido e antisentido). Nossa seleção de sondas 1021 kb enriquece a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações em 12 tumores relacionados ao tumor motorista. Esse método cost-effective e universal permite uma acumulação excepcionalmente bem sucedida dos dados genéticos. Depois de forma eficiente filtragem de erro de fundo, ER-seq precisamente pode detectar mutações raras. Usando um estudo de caso, apresentamos um protocolo detalhado demonstrando sonda design, construção de biblioteca e metodologias de captura de DNA alvo, enquanto incluindo também o fluxo de trabalho de análise de dados. O processo para realizar este método normalmente leva 1-2 dias.
Introduction
Sequenciamento de próxima geração (NGS), uma poderosa ferramenta para investigar os mistérios do genoma, pode fornecer uma grande quantidade de informações, que podem revelar alterações genéticas. A aplicação da análise NGS na clínica tornou-se mais comum, especialmente para a medicina personalizada. Uma das maiores limitações da NGS, no entanto, é uma taxa de erro elevada. Embora considera-se adequado para estudar as mutações herdadas, a análise de mutações raras é extremamente limitada1,2, especialmente quando analisar o DNA obtido de uma biópsia"líquida".
Tumor de circulação DNA (ctDNA) é sem célula DNA (cfDNA) no sangue que é derramado de células tumorais. Na maioria dos casos, a quantidade de ctDNA é extremamente baixa, que tornam sua deteção e da análise muito desafiador. No entanto, o ctDNA tem muitas características atraentes: seu isolamento é minimamente invasivo, ele pode ser detectado na fase inicial de crescimento do tumor, o nível de ctDNA reflete a eficiência terapêutica e ctDNA contém as mutações de DNA encontradas em lesões primárias e metastáticas 3 , 4 , 5. portanto, tendo em conta o rápido desenvolvimento da técnica NGS e análise, a aplicação da deteção de ctDNA tornou-se mais atraente.
Sequenciamento em paralelo diferentes abordagens têm sido utilizadas para a deteção de ctDNA, mas nenhuma dessas abordagens foram aceites para uso rotineiro em clínicas devido às suas limitações: baixa sensibilidade, falta de versatilidade e um custo relativamente alto6 ,7,8. Por exemplo, sequenciamento de frente e verso, baseado em uma marca de identificador exclusivo (UID), repetidamente corrige erros em bidirecionalmente o consenso, a maioria dos erros de sequenciamento de rectificação. No entanto, a viabilidade desse método é perdida devido ao seu alto custo e utilização de dados baixa9,10. Da mesma forma, CAPP-Seq e sua iteração melhorada, CAPP-IDES11,12, têm maior praticidade na detecção de cfDNA, embora a precisão e a universalidade desses métodos precisam ser melhoradas.
Para atender a necessidade atual para detecção de ctDNA precisos e análise, desenvolvemos uma nova estratégia, enriquecer a rara mutação de sequenciamento (ER-Seq). Esta abordagem combina o seguinte: adaptadores de sequenciamento exclusivo para recuperar com eficiência ctDNA moléculas, com correção de erro bidirecional e a capacidade de distinguir uma única mutação de > 1 × 107 nucleotídeos de tipo selvagem; sondas de 1021 kb que enriquecem a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações relacionados ao tumor de 12 tumores, incluindo câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de colo uterino, câncer de esôfago e carcinoma de endométrio (tabela 1); e triagem de banco de dados de base tornando-o eficiente e fácil de detectar precisamente mutações raras em ctDNA.
Para construir um banco de dados de base, encontre todas as mutações do gene por ER-Seq de um número do mesmo tipo de amostras (~ 1000 no início). Estas mutações reais devem ser verificadas por vários outros métodos de deteção de confiança e análise. Em seguida, resumem o padrão de mutações falsas e todas as mutações falsas para criar o banco de dados de base inicial de cluster. Continue a adicionar falsas mutações encontradas de experimentos subsequentes sequenciamento a esse banco de dados. Portanto, esse banco de dados de base torna-se uma dinâmico expandido de banco de dados, que melhora significativamente a precisão de sequenciamento.
Para promover o progresso na monitorização e diagnóstico de tumor, apresentamos ER-Seq, um método de baixo custo e viável para a aquisição de dados universais. Apresentamos um estudo de caso que foi submetido a análise de ER-Seq, demonstrando sua exatidão para detectar mutações raras e viabilidade para uso na clínica.
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Protocol
amostras de tumor e amostras de sangue foram obtidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê ética de Peking University povo ' ' s Hospital. Obteve-se consentimento escrito dos pacientes para usar suas amostras. Os participantes foram selecionados de acordo com os seguintes critérios: fêmea, avançado de câncer de pulmão de células não pequenas, mutação de EGFR p.L858R indicado pelo anterior de sequenciamento Sanger, progressão da doença após dois sessão de EGFR alvo terapia com Erlotinib, e Que foi aplicado a ctDNA para analisar a causa da resistência e encontrar novas drogas alvo ER-Seq.
1. extração de DNA de sangue periférico para cfDNA e o DNA genômico (gDNA)
- coletar 10 mL de sangue periférico em um tubo de coleta, inverter suavemente para cima e para baixo 6 - 8 vezes para misturar. Evite a distorção da célula. Amostras de sangue podem ser armazenadas no tubo de coleta a 6-37 ° C por até 72 horas.
- Centrifugar o tubo de coleta em temperatura ambiente por 10 min a 1600 (150) x g.
- Transferir o sobrenadante (plasma) do tubo da coleção para quatro 2ml limpo adequadamente rotulados tubos de centrífuga, usando uma pipeta descartável sem perturbar a camada de sedimento (glóbulos brancos).
- ML de Transfer1 das células usando uma pipeta descartável limpo para um 2ml adequadamente rotulados tubo de centrifugação. As células podem ser armazenadas a-20 ° C ou mais frio antes passo 1.8.
- Centrífuga plasma (etapa 1.3) por 10 min a 4 ° C e 16000 (150) x g.
- Transferir o plasma para limpar tubos de centrífuga correctamente rotulados como " plasma ", embora ~0.1 mL de volume residual no fundo para evitar a contaminação. Armazenar o plasma a-80 ° C até o passo 1.7.
- Use 3 mL de plasma da etapa 1.6 para isolar cfDNA (contém ctDNA) usando um kit disponível comercialmente, seguindo o fabricante ' instruções de s.
- Uso 200 µ l de células brancas do sangue da etapa 1.3 para isolar gDNA usando um kit disponível comercialmente, seguindo o fabricante ' instruções de s.
Nota: Os dois cfDNA e gDNA podem ser armazenadas a-20 ° C antes do uso. - Aplicar controles de qualidade diferentes para cfDNA e gDNA (tabela 2). Execute o controle de qualidade através de um método padronizado para o bioanalyzer determinar níveis de degradação de amostra e/ou contaminação gDNA. Análise do pico da qualidade de extração de cfDNA deve aparecer semelhante à Figura 1.
Nota: O tamanho do pico de cfDNA é de cerca de 170 BP nota que aumentando a quantidade de DNA irá resultar em uma biblioteca de qualidade superior para a detecção eficaz de mutações raras no cfDNA. Recomendamos o uso de pelo menos 30 ng cfDNA (30.000 cópias).
2. Preparação de biblioteca
Nota: construção de biblioteca de base no DNA fragmentado, cfDNA existe em fragmentos com um pico tamanho ~ 170 bp e, portanto, não necessita de ser fragmentado.
Amostra de- fragmento do controle (gDNA) pelo sonication para obter fragmentos de bp 200-250.
- Preparar 1 µ g de amostra gDNA em 100 µ l de tampão Tris-EDTA em um tubo limpo sonication.
- Definir o programa de sonication como 30 s no e 30 s fora durante 12 ciclos para um total de 12 min.
- Após sonication, confirmar o produto (5 µ l) contém fragmentos de 200-250 bp executando uma análise com gel de agarose 2%.
- Todos os produtos da fragmentação de transferência para um novo tubo de 1,5 mL e incubar com 150 µ l de grânulos magnéticos por 5 min selecionar os fragmentos corretos.
- Remover o sobrenadante, colocando o tubo em um rack magnético para 30 s.
- Lave os grânulos com 200 µ l de etanol a 80% (preparado na hora) com o tubo ficar na prateleira magnética. Incubar durante 30 s antes de remover o sobrenadante. Repetir uma vez.
- Ar secar as contas com a tampa do tubo aberta enquanto estiver hospedado no rack magnético. Evite o superaquecimento de grânulos para certificar-se de que o alvo do DNA se recupera bem. Eluir os fragmentos de DNA de grânulos adicionando 32 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8) aos talões para resolver os fragmentos de DNA seguidos de quantificação por espectroscopia UV/Vis.
Nota: pelo menos 200 ng é necessário para os experimentos seguintes.
- Fim Prep reação
Nota: Siga fabricante ' instrução s e modifique conforme necessário. Uso 30 ng de cfDNA; e 1 µ g de gDNA como o controle.- Adicionar 7 µ l de tampão de reação, 3 µ l da mistura da enzima, 30 ng de cfDNA em um tubo estéril de nuclease-livre e adicionar ddH 2 O volume total de 60 µ l. Em um tubo separado, adicione os componentes acima mas com 1 µ g de gDNA em vez de cfDNA.
- Mix e incubar a mistura a 20 ° C por 30 min, seguido de 65 ° C por 30 min em um thermocycler sem a tampa aquecida. Dirijam-se para a próxima etapa.
- Adaptador ligadura
- Adicionar 30 µ l do mix mestre da ligadura, 1 µ l do realçador de ligadura e 4 µ l dos adaptadores de sequenciamento exclusivo para a mistura da etapa 2.2.
- Incubar a 20 ° C por 15 min em um thermocycler sem a tampa aquecida.
- Vortex Resuspenda as esferas magnéticas e deixar as contas em temperatura ambiente pelo menos 30 min antes da próxima etapa.
- Adicionar 87 µ l dos grânulos magnéticos ressuspensão à mistura previamente mencionado; misture bem pipetando para cima e para baixo e então incubar a temperatura ambiente por 5 min.
- Lavagem e ar seco os grânulos, conforme descrito no passo 2.1.
- Eluir o alvo do DNA da missanga, adicionando 20 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Fragmentos de enriquecimento de DNA ligados com adaptador
- Adicionar 20 µ l de adaptador ligado DNA fragmentos, 5 µ l de índice Primer/i7 (2,5 µ l Primer-P7 (22:00) e 2,5 µ l de Primer-P5 (22:00), para fins de sequenciamento), 25 µ l de biblioteca amplificação mestre mix e ddH 2 O para um volume total de 50 µ l.
- PCR amplifica o adaptador ligado DNA e ciclo térmico da seguinte forma: desnaturação inicial a 98 ° C por 45 s, seguido de 8 ciclos (cfDNA) ou 4 ciclos (gDNA) de recozimento ° C por 15 s, 65 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) e uma extensão final a 72 ° C, durante 60 s e, em seguida, mantendo a temperatura em 4 ° C.
- Adicionar 45 µ l de suspensão magnéticos grânulos ao DNA PCR-enriquecido para obter fragmentos adquiridos.
- Fragmentos de DNA eluir com adaptadores em 30 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Controle de qualidade da biblioteca
- siga o fabricante ' protocolo de s para o kit comercial medir o adaptador ligado a concentração de DNA. Use o bioanalyzer para determinar a qualidade do DNA.
3. Alvo de captura de DNA
Nota: enriquecimento de destino foi realizado usando uma sequência personalizada captura-sonda, que é projetada especificamente para uma região de enriquecimento do alvo 1021 kb cobrindo mutações de motorista conhecido tumor-associado de 12 diferentes tipos de tumores. Modificações para o fabricante ' protocolo s são detalhados nas etapas a seguir.
- Adicionar 1,5 µ g de bloqueio de pool de bibliotecas (número máximo de bibliotecas para piscina para cfDNA 6, gDNA 20) da etapa 2, 8 µ l de Block(100P) P5, 8 µ l de Block(100P) P7 e 5 µ l de berço-1 DNA (1 µ g / µ l) em um tubo estéril. Secar o conteúdo do tubo usando um concentrador de vácuo fixado em 60 ° C.
- Cruzar a captura de DNA probes com a biblioteca.
- ,
- Adicione os seguintes componentes para o tubo de passo 3.1: 8,5 µ l de tampão de hibridização de X 2, 2,7 µ l de potenciador de hibridação e 1,8 µ l de nuclease livre ddH 2 O.
- Mix de pipetagem para cima e para baixo e incubá-los em uma thermomixer a 95 ° C por 10 min.
- Após incubação, imediatamente adicione 4 µ l de sondar o costume. Incubar as amostras em um termociclador em 65 & #176. o; C com tampa aquecida a 75 ° C por 4 h.
- Captura de fragmentos de DNA
- Incubar o ADN alvo hibridizado com grânulos streptavidin seguidos lavando as contas para retirar DNA desacoplado. Use o kit comercial de acordo com o fabricante ' instruções de s para obter um final 20 µ l de ressuspensão grânulos com DNA capturado fragmentos.
- Fragmentos de amplificação do DNA capturado
- realizar PCR usando o comercial kit com 2 oligonucleotides de espinha dorsal µM, de acordo com o fabricante ' instruções de s.
- Reação de PCR o quando for concluída, adicionar 45 µ l de suspensão grânulos diretamente para o produto do PCR e enriquecer os fragmentos de DNA alvo amplificado vinculados aos talões por eluição com 30 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Quantificar os fragmentos de DNA com o kit de quantificação de biblioteca e determinar o comprimento do fragmento de média pelo Bioanalyzer ( Figura 2).
4. sequenciamento
- sequência multiplexado bibliotecas usando 75 bp emparelhado-participante executa em um sequenciador de bancada para dados de Total de 18 h. produzidos são até 60 Gigabytes, 15 G é necessário para a amostra do paciente cfDNA e 1g para controle amostra gDNA.
5. fluxo de trabalho de análise de dados
Nota: a Figura 3 exibe o processo de análise de dados e fluxo de trabalho geral. Parâmetros de análise de dados e comandos são mostrados abaixo.
- Filtrar leituras de baixa qualidade e corrigir erros e mascaramento de UID usando NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filtro -l 5 - q 0.5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq fq1 MaskUID -1-2 fq2 -ó saída dir -p prefixo -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f. - Hg19 do genoma de referência (genoma humano 19), localize os resultados de sequenciamento usando mem BWA (versão 0.7.12-r1039) e realinhar com Genome Analysis Toolkit (GATK) (versão 3.4-46-gbc02625).
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conhecido dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - eu cancerBam-eu normalBam
java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conhecido dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervalos-eu cancerBam-eu normalBam
As duplicatas de acordo com o UID e a posição dos fragmentos do modelo, que irá corrigir o erro bases introduziram por PCR/sequenciamento e modificar a qualidade da base de cluster - .
realSeq(own)
python realSeq/bin/realSeq de CLUSTER -p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -ó output_dir
prefixo -m 6 - re-alinhar as duplicatas em cluster pela BWA Madame
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - realizar um realinhamento local, seguido de uma recalibração de contagem de base de qualidade usando GATK (versão 3.4-46-gbc02625).
Realinhamento de localizar: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conhecido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -CancerBam-eu normalBam
java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conhecido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalos-eu cancerBam-eu normalBam
base recalibração de qualidade-Pontuação: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites cósmica - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - eu java de grp -o bam-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-eu bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - para SNV (single-nucleotide variante) e chamando INDEL (pequenas inserções ou exclusões), a precisão das mutações de baixa frequência é ainda mais confirmada pelo GSR (bom suporte lê) com ambos frente e verso vertente ler pares e filtração através do grupo de controle (mutações do germline) e banco de dados de base.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - usar amostras de base como um controle para ligar CNV (variação de número de cópia).
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv..--normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk - Realigned desmapeada, clipes e leituras de pares discordantes chamar SV (variações estruturais).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -ó outputdir x - transcrição -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
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Representative Results
As sondas de 1021 kb regiões-alvo enriquecido usadas em ER-Seq são mostradas na tabela 1, que abrange mais de 95% das mutações gene em 12 tumores comuns. A vasta gama de tais sondas torna este processo aplicável para a maioria dos pacientes com câncer. Além disso, nosso exclusivo sequenciamento adaptadores e triagem de banco de dados de base tornam possível detectar mutações raras precisamente.
Devido às diferentes propriedades de gDNA e cfDNA extraído do sangue periférico, há uma gama de qualidade de dados, que é determinada pelos diferentes instrumentos e controles de qualidade, mostrados na tabela 2. CfDNA com êxito extraído deve exibir um tamanho máximo de ~ 170 bp, como analisado por bioanalyzer QC e mostrado na Figura 1. Grandes fragmentos indicam contaminação de DNA genômico, o que não deve aparecer no produto final. DNA extraído da amostra doente era suficiente qualidade e quantidade para ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng; gDNA - 3.426 µ g).
Captura de DNA alvo usando uma sonda personalizada então foi amplificada por PCR. O tamanho do fragmento média foi avaliado pelos dados de bioanalyzer e representante para cfDNA de um paciente na Figura 2A mostrou um pico em ~ 320 bp e uma única banda no gel de agarose. gDNA deve aparecer como uma mancha em um gel de agarose, conforme mostrado na Figura 2B. As qualidades de ambas as bibliotecas eram aceitáveis para o sequenciamento subsequente.
Após o sequenciamento, os dados foram analisados em ordem de acordo com o fluxo de trabalho na Figura 3B. Para ilustrar as vantagens de nosso ER-Seq versus o método tradicional, foram realizadas duas análises usando a mesma amostra. Os resultados de ambas as análises são mostrados na tabela 3 e tabela 4. Nós mostramos que ER-Seq melhora a profundidade da cobertura de 23% em comparação com o método tradicional (tabela 3, 3214,3 leituras em leituras de 2475 vs ER-Seq na análise tradicional), que foi devido a sua recuperação eficiente de moléculas de cfDNA, assim, extremamente melhorar a análise de mutações raras. É também evidente que os adaptadores de sequenciamento exclusivo usados em ER-Seq permitam fácil diferenciação de duplicações naturais e induzida por PCR (tabela 3, 0 induzido por PCR duplicado ler em ER-Seq). Além disso, encontramos nos resultados da chamada que análise baseada em ER-Seq era 100% consistente para a deteção de p.L858R EGFR e que a frequência da deteção era um pouco mais alto (2,7% vs 1,2%) quando comparado com a análise tradicional (tabela 4). Importante, ER-Seq análise permitiu a detecção de outras mutações relativamente baixa-frequência, incluindo EGFR p.T790M (variação frequência 0,53%) (Tabela 4), e isto não foi reconhecido pela análise tradicional devido ao ruído de fundo elevado.
Figura 1. Representante do QC resultado de sucesso isolado cfDNA
Para os gráficos à esquerda, eixo X mostra o tamanho do fragmento (bp) e o eixo Y indica unidades de fluorescência relativo (FU). O tamanho principal do cfDNA é ~ 170 bp e não há nenhum fragmento grande de contaminação. Um gel de eletroforese simulado é mostrado à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo de bibliotecas QC analisado.
Eixo X mostra o tamanho do fragmento (bp) e o eixo Y indica as unidades de fluorescência relativo (FU). Um gel de eletroforese simulado foi mostrado à direita de cada gráfico. (A) de amostra de paciente cfDNA mostrou um pico afiado depois que ele foi amplificado com adaptadores. (B) amostra de controlo gDNA mostrou fragmentos uniformemente distribuídos com nenhum pico afiado e sem viés em direção a um lado. Ambas as amostras eram aceitáveis para sequenciamento subsequente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fluxo de trabalho de ER-Seq.
Fluxo de trabalho geral do (A). (B) fluxo de trabalho de análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 2735 exões de toda a região do exon de 70 genes | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | ERG | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | HRAS | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabela 1. 1021 kb sondas regiões-alvo enriquecido.
Estas regiões incluídas: 2735 exões de 170 genes; os intrões, promotor e regiões de ponto de interrupção de 24 genes; 1122 exões de 847 genes relacionados. Estas cobrem mais de 95% do tumor relacionados a mutações de motorista e sites de destino mutação desde os 12 mais comuns tumores (câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer cervical, câncer de esôfago e carcinoma endometrial).
| DNA | Resultado | Indicação | Faixa ideal |
| cfDNA | Tamanho do fragmento | Identificação da distribuição do fragmento de DNA | 168bp±20(a) |
| Concentração | Quantificação de DNA mais precisa | CfDNA total ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identificação de contaminantes químicos (por exemplo, etanol) | 1,50 2.2 – |
| A260/A280 | Identificação de contaminantes de proteína | 1,60 2.2 – | |
| Concentração | Quantificação de DNA | GDNA total > 3ug |
Tabela 2. Análise da qualidade de cfDNA e gDNA extraído do sangue periférico.
O tamanho do pico de cfDNA é em torno de 170Bp... controle de qualidade deve ser realizada por um método padronizado para 2100 Bioanalyzer determinar os níveis de contaminação de degradação e/ou gDNA de amostra. Análise do pico da qualidade da extração cfDNA deve aparecer semelhante à Figura 1. Nota que o aumento da quantidade de DNA irá resultar em uma biblioteca com uma qualidade superior para a detecção eficaz de mutações raras no cfDNA. Nós recomendamos usar pelo menos 30 ng cfDNA (30.000 cópias).
Tabela 3. O QC de ER-Seq análise de informações e análise de informação tradicional.
O destaque de cinza escuro indica um aumento de profundidade de cobertura ocorreu em ER-Seq em comparação com métodos tradicionais; um leve destaque cinzento indica nenhuma PCR induzido leitura duplicada em ER-Seq. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gene | Chr | Início | Final | cHGVS | pHGVS | Função | caseAltIsHot | Var_freq ER-Seq | Var_freq tradicional |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missense | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missense | Acionáveis | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | Frameshift | ND | 0.0169 | 0.0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missense | ND | 0.0154 | 0.0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missense | Acionáveis | 0,0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missense | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabela 4. O resultado da chamada de ER-Seq informações Analysé e análise de informação tradicional.
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Discussion
A existência de circular de DNA do tumor (ctDNA) foi descoberta há mais de 30 anos atrás, no entanto, a aplicação de análises ctDNA é ainda não é rotina na prática clínica. Interesse na aplicação prática dos métodos de ctDNA aumentou com o desenvolvimento de tecnologias para a detecção de ctDNA e análise. Tumor de monitoramento com ctDNA oferece uma abordagem minimamente invasiva para a avaliação de doença residual microscópica, resposta à terapia e perfis molecular do tumor sob o fundo do tumor evolução e intratumoral heterogeneidade13, 14. Melhorias na sensibilidade e especificidade de análise irão facilitar todas essas aplicações15,16.
Neste manuscrito, introduzimos ER-Seq, um método promissor, destinado a melhorar a sensibilidade de detecção de ctDNA, usando um caso NSCLC como exemplo. Em comparação com a análise tradicional, a aplicação de nossos adaptadores de sequenciamento exclusivo em ER-Seq melhorou significativamente sua sensibilidade e especificidade, indicado por um aumento de profundidade de cobertura e uma habilidade para detectar mutações de baixa frequência (por exemplo, EGFR p. T790M (0,53%)). A existência de T790M nesta amostra de paciente pode ser um fator contribuinte para a resistência de Erlotinib e deu o insight sobre como melhor tratar este paciente, sugerindo a utilização de um inibidor do EGFR terceira geração específica para T790M, tais como AZD929117-20. Outro ponto crítico em ER-Seq que contribui para a sua sensibilidade e a especificidade é a triagem de banco de dados de base, o que facilita a detecção precisa de baixa frequência de mutações em ctDNA, filtrando o ruído de fundo.
Embora ER-Seq tem muitas vantagens que o tornam superior aos métodos tradicionais, ainda existem alguns desafios que precisam ser superados. Um dos principais desafios para ER-Seq é o nível extremamente baixo de ctDNA presente no sangue. Para essas mutações de baixa frequência, a aquisição de ctDNA de modelo suficiente é crítica. Nossos exclusivos adaptadores aumentam significativamente a taxa de reciclagem de ctDNA, embora eles ainda precisam ser melhorados. Outro desafio para ER-Seq e para todas as outras técnicas em sequência, é a limitação de cobertura de regiões-alvo. Nossa sonda selecionado 1021 kb enriquecido regiões, que pode cobrir cerca de 95% das mutações relacionados ao tumor, são mais abrangentes em comparação com outros métodos de avião de pequeno porte21,22,23. No entanto, como a heterogeneidade do tumor tem sido bem reconhecida e cada vez mais biomarcadores de tumor foram descobertos, a taxa de cobertura relativa de nossas sondas enriquecido diminui de regiões. Para melhor servir como uma ferramenta para o diagnóstico precoce e o monitoramento de doença dos pacientes do tumor, são necessárias técnicas de sequenciamento e análise mais abrangentes. Atualmente, ER-Seq ainda depende de um alto volume de dados para a detecção de mutações de baixa frequência. Reforço da utilização de dados pode ser favorável para a aplicação do ER-Seq
Como discutido acima, existem muitas limitações associadas com ER-Seq. No entanto, nossa técnica de análise original ainda tem muitas vantagens em comparação com outros métodos de alto escalão neste campo. Os prós e os contras desta técnica merecem mais pesquisa. O potencial de ER-Seq para uso clínico de rotina será de grande importância para os médicos clínicos, proporcionando-lhes uma ferramenta poderosa para diagnosticar tumores e monitor tumor dinâmica e resposta à terapia. Novela mutações associadas com resistência à terapia convencional e alvo encontrada pela nossa análise podem oferecer novas vias de tratamento para pacientes com câncer com doença avançada.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Instituto Geneplus – Beijing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
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