Summary
Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.
Abstract
L'analisi del DNA del tumore (ctDNA) utilizzo di sequenziamento di nuova generazione (NGS) in circolo è diventata uno strumento prezioso per lo sviluppo di oncologia clinica. Tuttavia, l'applicazione di questo metodo è impegnativo a causa della sua bassa sensibilità nell'analizzare la quantità in tracce di ctDNA nel sangue. Inoltre, il metodo può generare risultati falsi positivi e negativi da questa analisi di sequenziamento e successiva. Per migliorare la fattibilità e l'affidabilità di rilevazione di ctDNA nella clinica, qui vi presentiamo una tecnica che arricchisce le mutazioni rare per il sequenziamento, arricchire rara mutazione sequenziamento (ER-Seq). ER-Seq può distinguere una singola mutazione fuori 1 x 107 nucleotidi di selvaggio-tipo, che lo rende uno strumento promettente per rilevare le alterazioni genetiche di frequenza estremamente bassa e quindi sarà molto utile nello studio heterogenicity di malattia. In virtù della legatura dell'adattatore unico sequenziamento, questo metodo consente un recupero efficiente di molecole ctDNA, mentre presso lo stesso tempo per correggere errori in entrambe le direzioni (senso e antisenso). La nostra selezione di sonde 1021 kb arricchisce la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni tumore-relativo driver in 12 tumori. Questo metodo economico e universale consente un accumulo in modo univoco successo dei dati genetici. Dopo il filtraggio efficiente errori in background, ER-seq può rilevare precisamente mutazioni rare. Utilizzando un caso di studio, presentiamo un protocollo dettagliato che dimostra sonda progettazione, la costruzione della libreria e metodologie di acquisizione del DNA bersaglio, mentre includendo anche il flusso di lavoro di analisi dei dati. Il processo per effettuare questo metodo in genere dura 1-2 giorni.
Introduction
Sequenziamento di nuova generazione (NGS), un potente strumento per indagare i misteri del genoma, in grado di fornire una grande quantità di informazioni, che possono rivelare alterazioni genetiche. L'applicazione dell'analisi NGS in clinica è diventato più comune, soprattutto per la medicina personalizzata. Una delle limitazioni più grandi di NGS, tuttavia, è un alto tasso di errore. Sebbene sia ritenuto opportuno per studiare le mutazioni ereditate, l'analisi di mutazioni rare è notevolmente limitato1,2, soprattutto quando l'analisi del DNA ottenuto da una "biopsia liquida".
Circolazione del tumore (ctDNA) il DNA è DNA libero (cfDNA) nel sangue che è sparso dalle cellule del tumore. Nella maggior parte dei casi, la quantità di ctDNA è estremamente bassa, che rendono la rilevazione e l'analisi molto impegnativo. Tuttavia, ctDNA ha molte caratteristiche interessanti: suo isolamento è minimamente invasiva, può essere individuata nelle prime fasi di crescita del tumore, il livello di ctDNA riflette l'efficienza del trattamento e ctDNA contiene mutazioni del DNA trovate in lesioni sia primari e metastatiche 3 , 4 , 5. quindi, dato il rapido sviluppo della tecnica NGS e analisi, l'applicazione di rilevazione di ctDNA è diventato più attraente.
Sequenziamento massivamente parallelo diversi approcci sono stati utilizzati per il rilevamento di ctDNA, ma nessuno di questi approcci sono stati accettati per uso sistematico in cliniche a causa delle loro limitazioni: bassa sensibilità, mancanza di versatilità e un costo relativamente elevato6 ,7,8. Ad esempio, il sequenziamento duplex, basato su un tag di identificatore univoco (UID), ripetutamente corregge gli errori nel consenso in modo bidirezionale, che rettifica la maggior parte degli errori di sequenziamento. Tuttavia, la fattibilità di questo metodo è persa a causa del suo alto costo e dati a bassa utilizzazione9,10. Allo stesso modo, CAPP-Seq e iterazione migliorata, CAPP-IDES11,12, hanno una maggiore praticità nel rilevamento di cfDNA, anche se l'accuratezza e l'universalità di questi metodi devono essere migliorati.
Per soddisfare l'esigenza attuale ctDNA accurato rilevamento e analisi, abbiamo sviluppato una nuova strategia, arricchire rara mutazione Sequencing (ER-Seq). Questo approccio combina le seguenti: schede di sequenziamento unico per recuperare in modo efficiente le molecole di ctDNA, con correzione di errore bidirezionale e la capacità di distinguere una singola mutazione su > 1 × 107 nucleotidi di selvaggio-tipo; sonde di 1021 kb che arricchiscono la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni da 12 tumori, tra cui il cancro del polmone, cancro colorettale, cancro gastrico, cancro al seno, cancro del rene, cancro del pancreas, cancro del fegato, cancro della tiroide, tumore-relativa cancro cervicale, cancro esofageo e carcinoma dell'endometrio (tabella 1); e database di riferimento di screening rende efficienti e facili da rilevare precisamente rare mutazioni in ctDNA.
Per creare un database di riferimento, è possibile trovare tutte le mutazioni di gene di ER-Seq da un numero dello stesso tipo di campioni (~ 1000 all'inizio). Queste mutazioni reale devono essere verificate da diversi altri metodi di rilevazione affidabili e analisi. Successivamente, riassumere il pattern di mutazioni false e tutte le mutazioni false per creare il database di previsione iniziale del cluster. Continuare ad aggiungere false mutazioni trovate da esperimenti di ordinamento successivo a questo database. Questo database di riferimento diventa quindi un database dinamico espanso, che migliora notevolmente la precisione di sequenziamento.
Per promuovere il progresso nella diagnosi del tumore e di monitoraggio, presentiamo ER-Seq, un metodo di basso costo e fattibile per l'acquisizione di dati universale. Presentiamo un caso di studio che hanno subito l'analisi ER-Seq, dimostrando l'esattezza per la rilevazione di mutazioni rare e fattibilità per l'utilizzo in clinica.
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Protocol
esemplari del tumore ed i campioni di sangue sono stati ottenuti secondo un protocollo approvato dal comitato etico di Pechino Università popolo ' s Hospital. Consenso informato è stato ottenuto dai pazienti di utilizzare i loro campioni. I partecipanti sono stati selezionati secondo i seguenti criteri: donna, avanzato Non a piccole cellule cancro ai polmoni, mutazione di EGFR p.L858R indicato dal precedente sequenziamento Sanger, progressione di malattia dopo due sessione di EGFR terapia con Erlotinib, mirata e ER-Seq, che è stato applicato a ctDNA per analizzare la causa della resistenza e trovare nuovi farmaci a bersaglio.
1. estrazione del DNA da sangue periferico per cfDNA e DNA genomico (gDNA)
- raccogliere 10 mL di sangue periferico in un tubo di raccolta, capovolgere delicatamente su e giù 6 - 8 volte per mescolare. Evitare il cesoiamento delle cellule. Campioni di sangue possono essere conservati nel tubo di raccolta a 6-37 ° C fino a 72 ore.
- Centrifugare la provetta di raccolta a temperatura ambiente per 10 min a 1600 (± 150) x g.
- Trasferire il surnatante (plasma) dal tubo di raccolta a quattro pulito 2 mL opportunamente etichettato provette da centrifuga utilizzando una pipetta monouso senza disturbare lo strato di pellet (globuli bianchi).
- Transfer1 mL di celle utilizzando una pipetta monouso pulito a un 2 mL opportunamente etichettati provetta da centrifuga. Le cellule possono essere conservati a-20 ° C o a temperature inferiori prima di passaggio 1.8.
- Centrifugare il plasma (dal punto 1.3) per 10 min a 4 ° C e 16000 (± 150) x g.
- Trasferire il plasma per pulire adeguatamente etichettati come due provette da centrifuga " plasma ", lasciare ~0.1 mL di volume residuo nella parte inferiore per evitare la contaminazione. Conservare il plasma a-80 ° C fino al punto 1.7.
- Uso 3 mL di plasma dal passaggio 1.6 per isolare cfDNA (contiene ctDNA) utilizzando un kit disponibile in commercio, seguendo il produttore ' istruzioni s.
- Uso 200 µ l di cellule bianche del sangue dal passaggio 1.3 per isolare gDNA utilizzando un kit disponibile in commercio, seguendo il produttore ' istruzioni s.
Nota: Entrambi cfDNA e gDNA possono essere conservati a-20 ° C prima dell'uso. - Applicare diversi controlli di qualità per cfDNA e gDNA (tabella 2). Eseguire il controllo di qualità di un metodo standardizzato per il bioanalyzer determinare i livelli di degradazione del campione e/o contaminazione gDNA. Analisi della qualità dell'estrazione cfDNA di picco dovrebbero apparire simile a Figura 1.
Nota: Le dimensioni di picco di cfDNA sono di circa 170 BP. nota che aumentando la quantità di DNA si tradurrà in una libreria di qualità superiore per un'efficace individuazione di mutazioni rare in cfDNA. Si consiglia di utilizzare almeno 30 ng cfDNA (30.000 copie).
2. Preparazione di biblioteca
Nota: per quanto riguarda la costruzione della libreria di base su DNA frammentato, cfDNA esiste in frammenti con un picco dimensione ~ 170 bp e così non ha bisogno di essere frammentati.
- Frammento il controllo campione (gDNA) mediante sonicazione per ottenere frammenti di bp 200-250.
- Preparare 1 µ g di campione gDNA in 100 µ l di tampone Tris-EDTA in una provetta pulita sonicazione.
- Impostare il programma di sonicazione come 30 s s on e 30 fuori per 12 cicli per un totale di 12 min.
- Dopo sonicazione, confermare il prodotto (5 µ l) contiene frammenti di 200-250 bp eseguendo un'analisi con gel di agarosio al 2%.
- Trasferire tutti i prodotti di frammentazione in una nuova provetta da 1,5 mL e incubare con 150 µ l di biglie magnetiche per 5 min selezionare i frammenti corretti.
- Rimuovere il surnatante mettendo il tubo su un rack magnetico per 30 s.
- Lavare le perle con 200 µ l di etanolo di 80% (preparata) con il tubo di soggiornare sul rack magnetico. Incubare per 30 s prima di rimuovere il surnatante. Ripetere un' volta.
- Le perle con il coperchio del tubo aperto mentre soggiornate sul rack magnetico asciugare all'aria. Evitare sovraessiccati perline per assicurarsi che il DNA bersaglio recupera bene. Eluire frammenti di DNA dalle perle aggiungendo 32 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8) per le perline per risolvere i frammenti di DNA seguiti da quantificazione di spettroscopia di UV/Vis.
Nota: almeno 200 ng è necessaria per i seguenti esperimenti.
- Fine Prep reazione
Nota: Segui produttore ' Istruzione s e modificare come necessario. Uso 30 ng di cfDNA; e 1 µ g di gDNA come il controllo.- Aggiungere 7 µ l di tampone di reazione, 3 µ l della miscela enzimatica, 30 ng di cfDNA in una provetta sterile privo di nucleasi e aggiungere ddH 2 O al volume totale di 60 µ l. In un tubo separato, aggiungere i componenti di cui sopra ma con 1 µ g di gDNA invece di cfDNA.
- Mix e incubare la miscela a 20 ° C per 30 min seguita da 65 ° C per 30 min in un termociclatore senza il coperchio riscaldato. Procedere immediatamente alla fase successiva.
- Adattatore legatura
- aggiungere 30 µ l di mix master legatura, 1 µ l del rinforzatore di legatura e 4 µ l delle schede di sequenziamento unico alla miscela dal passaggio 2.2.
- Incubate a 20 ° C per 15 min in un termociclatore senza il coperchio riscaldato.
- Vortex per risospendere le microsfere magnetiche e lasciare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min prima del passaggio successivo.
- µ L 87 dei branelli magnetici sedimento alla miscela precedentemente accennato; mescolare bene pipettando su e giù e poi incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Lavare e asciugare all'aria le perle come descritto nel punto 2.1.
- Eluire il DNA bersaglio dalle perline con l'aggiunta di 20 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Frammenti di arricchimento di DNA legati con adattatore
- aggiungere 20 µ l di DNA adattatore legato frammenti, 5 µ l di Primer Indice/i7 (2,5 µ l Primer-P7 (22) e 2,5 µ l di Primer-P5 (22), per scopi di sequenziamento), 25 µ l di mix master di amplificazione di biblioteca e ddH 2 O ad un volume totale di 50 µ l.
- PCR amplificare il DNA adattatore legato e ciclo termico come segue: denaturazione iniziale a 98 ° C per 45 s, seguita da 8 cicli (cfDNA) o 4 cicli (gDNA) di ricottura ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s) e un'estensione finale a 72 ° C per 60 s, poi tenendo la temperatura a 4 ° C.
- Aggiungere 45 µ l di biglie magnetiche sospese al DNA PCR-arricchita per ottenere frammenti acquisite.
- Frammenti di DNA eluire con adattatori in 30 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Libreria di controllo di qualità
- seguire il produttore ' protocollo di s per il kit commercio misurare adattatore legato concentrazione di DNA. Utilizzare il bioanalyzer per determinare la qualità del DNA.
3. Mirati acquisizione di DNA
Nota: arricchimento di destinazione è stato effettuato usando una sequenza personalizzata-sonda di cattura che è specificamente progettata per un'area di arricchimento di destinazione 1021 kb che coprono le mutazioni driver noto tumore-collegati da 12 diversi tipi di tumori. Modifiche il produttore ' protocollo s sono dettagliati di seguito.
- Blocco
- aggiungere 1,5 µ g di pool di librerie (numero massimo di librerie per piscina per cfDNA è 6, gDNA è 20) dal passaggio 2, 8 µ l di Block(100P) P5, 8 µ l di Block(100P) P7 e 5 µ l di DNA Cot-1 (1 µ g / µ l) in una provetta sterile. Asciugare il contenuto del tubo utilizzando un concentratore a vuoto impostato a 60 ° C.
- Hybridize l'acquisizione di DNA sonde con la libreria.
- Aggiungere i seguenti componenti per il tubo dal punto 3.1: 8,5 µ l di tampone di ibridazione di X 2, 2,7 µ l di esaltatore di ibridazione e 1,8 µ l di ddH nucleasi-free 2 O.
- Mix di pipettaggio su e giù e incubare in un thermomixer a 95 ° C per 10 min.
- a seguito di incubazione, immediatamente aggiungere 4 µ l di sonda Custom. Incubare i campioni in un termociclatore a 65 & n. 176; C con il coperchio riscaldato a 75 ° C per 4 h.
- Cattura frammenti di DNA
- Incubare il DNA dell'obiettivo ibridato con streptavidina perline seguite da lavare le perle per rimuovere il DNA non legato. Utilizzare il kit commerciale secondo produttore ' s istruzioni per ottenere un finale 20 µ l di sedimento perline con DNA acquisito frammenti.
- Frammenti di amplificazione del DNA acquisito
- eseguire PCR utilizzando commercio kit con oligonucleotidi di spina dorsale 2 µM, secondo produttore ' istruzioni s.
- Reazione di PCR the quando è completato, aggiungere 45 µ l di sospensione perline direttamente al prodotto PCR e arricchire i frammenti di DNA amplificati destinazione vincolati ai talloni eluizione con 30 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
- Quantificare i frammenti di DNA con il kit di quantificazione di libreria e determinare la lunghezza del frammento medio di Bioanalyzer ( Figura 2).
4. sequenziamento
- sequenza multiplexed librerie utilizzando 75 piste accoppiato-fine di bp su un sequencer di benchtop per 18 h. totale dei dati prodotti è fino a 60 Gigabyte, 15 G è necessario per il campione del paziente cfDNA e 1G per controllo campione gDNA.
5. flusso di lavoro analisi dati
Nota: nella figura 3 viene visualizzato il processo di analisi dati e flusso di lavoro generale. Parametri di analisi di dati e i comandi sono riportati di seguito.
- Filtro letture di bassa qualità e correggere errori e mascheramento dell'UID utilizzando NCfilter.
NCfilter(own)
NCfilter filtro -l 5 - q 0,5 -n 0,1 -T fastq1 - G -1 3-2 fastq2
realSeq(own)
python bin/realRealSeq fq1 MaskUID -1-2 fq2 -o uscita dir -p prefisso -u 4 -s 7 - m. 3 -i uidFile-f. - Hg19 di referenziamento genoma (genome umano 19), individuare i risultati di sequenziamento utilizzando mem BWA (versione 0.7.12-r1039) e riallineare con Genome Analysis Toolkit (GATK) (versione 3.4-46-gbc02625).
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-noto dbsnp —
allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - io cancerBam-io normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-noto dbsnp
- allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervalli-io cancerBam-io normalBam
I duplicati secondo l'UID e la posizione dei frammenti modello, che verrà corretto l'errore basi introdotte dalla PCR/sequenziamento e modificare la qualità di base del cluster - .
realSeq(own)
CLUSTER python realSeq/bin/realSeq - b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
prefisso -m 6 - ri-allineare i duplicati in cluster di BWA MEM.
BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 - eseguire un riallineamento locale seguito da una ricalibrazione del Punteggio di qualità base utilizzando GATK (versione 3.4-46-gbc02625).
Riallineamento sassarese: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-noto dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Io cancerBam-io normalBam
java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-noto dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalli-io cancerBam-io normalBam
base Punteggio di qualità ricalibrazione: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites cosmico - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ho java di grp -o bam-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-ho bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals - per SNV (variante del singolo-nucleotide) e chiamando il INDEL (piccoli inserimenti o eliminazioni), la precisione delle mutazioni a bassa frequenza è ulteriormente confermata da GSR (buon supporto legge) con entrambi strand e inversa di leggere coppie e filtrazione attraverso il gruppo di controllo (mutazioni germinali) e il database di riferimento.
realDcaller(own)
python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30 - usare i campioni della linea di base come un controllo per CNV (copia numero variazione) chiamate.
NCcnv(own)
python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk - Realigned non mappati, filmati e letture di coppia discordante di chiamare SV (variazioni strutturali).
NCsv(own)
python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x trascrizione -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam
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Representative Results
Le sonde di 1021 kb regioni arricchiti di destinazione utilizzato nell'ER-Seq sono riportate nella tabella 1, che copre oltre il 95% delle mutazioni di gene in 12 tumori comuni. La vasta gamma di queste sonde rende questo processo applicabile alla maggior parte dei malati di cancro. Inoltre, nostro unico sequenziamento adattatori e lo screening basale database rendono possibile rilevare mutazioni rare precisamente.
A causa delle diverse proprietà di gDNA e cfDNA estratte dal sangue periferico, c'è una gamma di qualità di dati, che è determinata da diversi strumenti ed i controlli di qualità indicati nella tabella 2. CfDNA Estratto con successo dovrebbe visualizzare una dimensione di picco di ~ 170 bp, come analizzata dalla bioanalyzer QC e illustrato nella Figura 1. Grandi frammenti indicano contaminazione da DNA genomic, che non dovrebbe apparire nel prodotto finale. DNA Estratto da questo campione del paziente era di sufficiente qualità e quantità per ER-Seq (cfDNA - 42,6 ng; gDNA - 3.426 µ g).
Cattura del target DNA usando una sonda personalizzata quindi è stato amplificato dalla PCR. La dimensione del frammento medio è stata valutata dai dati bioanalyzer e rappresentante per cfDNA di un paziente in Figura 2A ha mostrato un picco circa ~ 320 bp e una band unica su gel di agarosio. gDNA dovrebbe apparire come una macchia su un gel di agarosio, come mostrato nella Figura 2B. Le qualità di entrambe le librerie erano accettabili per il successivo sequenziamento.
Dopo l'ordinamento, i dati sono stati analizzati in ordine secondo il flusso di lavoro nella Figura 3B. Per illustrare i vantaggi del nostro ER-Seq contro il metodo tradizionale, abbiamo effettuato entrambe le analisi utilizzando lo stesso campione. Entrambe le analisi i risultati vengono visualizzati nella tabella 3 e tabella 4. Abbiamo mostrato che ER-Seq migliora la profondità di copertura del 23% rispetto al metodo tradizionale (tabella 3, 3214,3 letture in letture di 2475 vs ER-Seq in analisi tradizionale), che era a causa del relativo recupero efficiente di molecole cfDNA, così notevolmente migliorando l'analisi di mutazioni rare. È anche chiaro che le schede di sequenziamento univoco utilizzate in ER-Seq permettono facile differenziazione delle duplicazioni naturale e PCR-indotta (tabella 3, 0 PCR indotta duplicato leggere in ER-Seq). Inoltre, abbiamo trovato nei risultati della chiamata che analisi basata su ER-Seq era coerente per il rilevamento di EGFR p.L858R al 100% e che la frequenza di rilevazione è stato un po' più in alto (2,7% vs 1,2%) quando confrontato con l'analisi tradizionale (tabella 4). D'importanza, ER-Seq analisi abilitato il rilevamento di altre mutazioni relativamente bassa frequenza, tra cui p.T790M EGFR (variazione frequenza 0,53%) (Tabella 4), e questo non è stato riconosciuto dall'analisi tradizionale a causa del rumore di fondo elevato.
Figura 1. Rappresentanza cfDNA risultato QC di correttamente isolato
Per i grafici di sinistro, l'asse X Mostra la dimensione del frammento (bp) e l'asse Y indica unità relativa fluorescenza (FU). La dimensione primaria della cfDNA è ~ 170 bp e non ci sono alcun grosso frammento di contaminazione. Un gel di elettroforesi simulato è mostrato a destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Esempio di librerie QC analizzati.
L'asse X Mostra la dimensione del frammento (bp) e l'asse Y indica le unità di fluorescenza relativa (FU). Un gel di elettroforesi simulato è stato mostrato sulla destra di ogni grafico. Campione di pazienti cfDNA (A) ha mostrato un picco acuto dopo esso è stato amplificato con adattatori. (B) controllo gDNA campione ha mostrato frammenti uniformemente distribuiti con nessun picco acuto e nessun pregiudizio verso un lato. Entrambi i campioni erano accettabili per la sequenza successiva. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Flusso di lavoro di ER-Seq.
(A) il flusso di lavoro generale. (B) il flusso di lavoro di analisi di dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 2735 esoni da tutta la regione di essone di 70 geni | |||||||||
| ABL1 | ABL2 | AKT1 | AKT2 | AKT3 | ALK | APC | AR | ARAF | ATM |
| ATR | AURKA | AURKB | AXL | BAP1 | BCL2 | BRAF | BRCA1 | BRCA2 | BRD2 |
| BRD3 | BRD4 | BTK | C11orf30 | C1QA | C1S | CBL | CCND1 | CCND2 | CCND3 |
| CCNE1 | CD274 | CDH1 | CDK13 | CDK4 | CDK6 | CDK8 | CDKN1A | CDKN1B | CDKN2A |
| CDKN2B | CHEK1 | CHEK2 | CRKL | CSF1R | CTNNB1 | DDR1 | DDR2 | DNMT3A | EGFR |
| EPHA2 | EPHA3 | EPHA5 | ERBB2 | ERBB3 | ERBB4 | ERCC1 | GRE | ESR1 | EZH2 |
| FAT1 | FBXW7 | FCGR2A | FCGR2B | FCGR3A | FGFR1 | FGFR2 | FGFR3 | FGFR4 | FLCN |
| FLT1 | FLT3 | FLT4 | FOXA1 | FOXL2 | GAB2 | GATA3 | GNA11 | GNAQ | GNAS |
| HDAC1 | HDAC4 | HGF | AUTORITÀ REGISTRAZIONE INTEGRITÀ | IDH1 | IDH2 | IGF1R | IL7R | ||
Tabella 1. 1021 kb sonde regioni Target arricchito.
Queste regioni incluse: 2735 esoni da 170 geni; introni, regioni promotore e punto di interruzione da 24 geni; 1122 esoni da 847 geni correlati. Questi coprono oltre 95% del tumore relativi driver mutazioni e siti di mutazione di destinazione dai 12 più comuni tumori (cancro ai polmoni, cancro colorettale, cancro gastrico, cancro al seno, cancro del rene, cancro del pancreas, cancro del fegato, cancro della tiroide, cancro cervicale, cancro esofageo e carcinoma dell'endometrio).
| DNA | Risultato | Indicazione | Gamma di ideale |
| cfDNA | Dimensione del frammento | Identificazione della distribuzione del frammento di DNA | 168bp±20(a) |
| Concentrazione | Più accurata quantificazione del DNA | Totale cfDNA ≥30ng(b) | |
| gDNA | A260/A230 | Identificazione dei contaminanti chimici (per esempio, etanolo) | 1.50 – 2,2 |
| A260/A280 | Identificazione dei contaminanti di proteina | 1,60 – 2,2 | |
| Concentrazione | Quantificazione del DNA | Totale gDNA > 3ug |
Tabella 2. Analisi della qualità di cfDNA e gDNA estratti da sangue periferico.
Le dimensioni di picco di cfDNA sono di circa 170Bp. controllo di qualità devono essere eseguite da un metodo standardizzato per il 2100 Bioanalyzer determinare i livelli di contaminazione del campione di degradazione e/o gDNA. Analisi della qualità dell'estrazione cfDNA di picco dovrebbero apparire simile a Figura 1. Nota che ha aumentato la quantità di DNA si tradurrà in una libreria con una qualità superiore per un'efficace individuazione di mutazioni rare in cfDNA. Si consiglia di utilizzare almeno 30 ng cfDNA (30.000 copie).
Tabella 3. Il controllo di qualità di ER-Seq informazioni analisi e analisi dell'informazione tradizionale.
Il momento culminante grigio scuro indica un aumento di profondità di copertura si è verificato in ER-Seq rispetto ai metodi tradizionali; un punto culminante grigio chiaro indica nessun PCR indotta lettura duplicato in ER-segg. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gene | Chr | Inizio | Fine | cHGVS | pHGVS | Funzione | caseAltIsHot | ER-Seq var_freq | Var_freq tradizionale |
| TP53 | 17 | 7577534 | 7577535 | c.746G > T | p.R249M | Missenso | HighFreq | 0.0400 | 0.0378 |
| EGFR | 7 | 55259514 | 55259515 | c.2573T > G | p.L858R | Missenso | Actionable | 0.0270 | 0.0120 |
| ATM | 11 | 108203618 | 108203619 | c.7919delC | p.T2640Ifs*6 | frameshift | ND | 0.0169 | 0,0180 |
| PTCH1 | 9 | 98221917 | 98221918 | c.2851G > T | p.D951Y | Missenso | ND | 0.0154 | 0,0260 |
| EGFR | 7 | 55249070 | 55249071 | c.2369C > T | p.T790M | Missenso | Actionable | 0,0053 | ——(0.0013) |
| RB1 | 13 | 49039151 | 49039152 | c.2230A > T | p.I744F | Missenso | ND | 0. 0036 | ——(0.0014) |
Tabella 4. Il risultato della chiamata di ER-Seq informazioni Analysè e tradizionale analisi delle informazioni.
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Discussion
L'esistenza di circolazione del tumore DNA (ctDNA) è stato scoperto più di 30 anni fa, tuttavia l'applicazione di analisi di ctDNA è ancora non di routine nella pratica clinica. Interesse per l'applicazione pratica dei metodi di ctDNA sono aumentata con lo sviluppo di tecnologie per il rilevamento di ctDNA e analisi. Monitoraggio del tumore con ctDNA offre un approccio mini-invasivo per la valutazione della malattia residua microscopica, risposta alla terapia e profili molecolari del tumore sotto lo sfondo di tumore evoluzione e intratumoral eterogeneità13, 14. Miglioramenti nella sensibilità e specificità dell'analisi faciliterà tutte queste applicazioni15,16.
In questo manoscritto, abbiamo introdotto ER-Seq, un promettente metodo volto a migliorare la sensibilità del rilevamento di ctDNA, usando un caso NSCLC come esempio. Rispetto ai tradizionale analisi, l'applicazione dei nostri dispositivi unici sequenziamento in ER-Seq ha migliorato significativamente la sua sensibilità e specificità, indicato da un aumento di profondità di copertura e la capacità di rilevare le mutazioni di bassa frequenza (ad esempio EGFR p. T790M (0,53%)). L'esistenza di T790M in questo campione può essere un fattore che contribuisce alla resistenza di Erlotinib e ha dato come meglio trattare questo paziente, suggerendo l'uso di un inibitore EGFR di terza generazione specifico per T790M, ad esempio AZD929117-20. Un altro punto critico in ER-Seq che contribuisce alla sua sensibilità e la specificità è la proiezione di database basale, che facilita il rilevamento preciso di bassa frequenza di mutazioni in ctDNA filtrando il rumore di fondo.
Anche se ER-Seq ha molti vantaggi che lo rendono superiore ai metodi tradizionali, ci sono ancora alcune sfide che devono essere superati. Una delle principali sfide per ER-Seq è il livello estremamente basso di ctDNA presente nel sangue. Per quelle mutazioni di bassa frequenza, l'acquisizione di sufficienti modello ctDNA è fondamentale. I nostri adattatori unici aumentano significativamente il tasso di riciclo di ctDNA, anche se hanno ancora bisogno di essere migliorata. Un'altra sfida per ER-Seq e per tutte le altre tecniche di sequenziamento, è la limitazione della copertura delle regioni di destinazione. La nostra sonda selezionata 1021 kb arricchita regioni, che può coprire circa il 95% delle mutazioni tumore-relativa, sono più completi rispetto ad altri metodi di piccolo-aereo21,22,23. Tuttavia, come eterogeneità del tumore è stato ben riconosciuto e più biomarcatori di tumore sono stati scoperti, il tasso di copertura relativa delle nostre sonde arricchito diminuzioni di regioni. Per meglio servire come strumento per la diagnosi precoce e il monitoraggio delle malattie dei pazienti del tumore, sono necessarie tecniche di sequenziamento e analisi più complete. Attualmente, ER-Seq si basa ancora su un volume elevato di dati per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza. Ulteriore miglioramento di utilizzazione di dati potrebbe essere favorevole per l'applicazione di ER-segg.
Come discusso in precedenza, esistono molte limitazioni connesse con ER-Seq. Tuttavia, la nostra tecnica di analisi unica ancora ha molti vantaggi rispetto ad altri metodi di alto livello in questo campo. I pro e i contro di questa tecnica merita ulteriore ricerca. Il potenziale di ER-Seq per uso clinico sistematico sarà di grande importanza per i medici clinici, fornendo loro un potente strumento per diagnosticare i tumori, monitor tumore dinamiche e risposta alla terapia. Nuove mutazioni associate a resistenza alla terapia convenzionale e mirata trovata dalla nostra analisi potrebbero offrire nuove prospettive di trattamento per i pazienti con malattia avanzata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è supportato da Geneplus – Beijing Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51105 | DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA |
| Quant-iT dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | Measure cfDNA concentration |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32853 | Measure library concentration |
| Agilent DNA 1000 Reagents | Agilent | 5067-1504 | Measure cfDNA and library fragments |
| The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645L | Library Preparation |
| Agencourt SPRIselect Reagent | Beckman | B23317 | DNA fragment screening and purification |
| Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML | Sigma | 93283 | Dissolution |
| xGen Lockdown Probes | IDT | —— | xGen Custom Probe |
| Human Cot-1 DNA | Life | 15279-011 | Targeted DNA capture |
| Dynabeads M-270 Streptavidin | Life | 65305 | Targeted DNA capture |
| xGen Lockdown Reagents | IDT | 1072281 | Targeted DNA capture |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | KAPA | KK2602 | post-capture PCR enrichment libraries |
| KAPA Library Quantification Kit | KAPA | KK4602 | Measure library concentration |
| NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles) | illumina | FC-404-2002 | Sequence |
| Centrifuge5810 | eppendorf | 5810 | |
| Nanodrop8000 | Thermo Scientific | 8000 | Measure gDNA concentration |
| Qubit 2.0 | Invitrogen | Quantify | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | ||
| ThermoMixer C | eppendorf | Incubation | |
| 16-tube DynaMagTM-2 Magnet | Life | 12321D | |
| Concentrator plus | eppendorf | ||
| PCR | AB | simplyamp | |
| QPCR | AB | 7500Dx | |
| NextSeq 500 | illumina |
References
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