Summary
Este papel instrui os usuários de scanners de microtomografia computadorizada (µCT) na vivo como anestesiar, corretamente, posicionar e restringir o membro posterior de um rato para o mínimo movimento durante a geração de imagens de alta resolução da tíbia. O resultado é imagens de alta qualidade que podem ser processadas para quantificar com precisão a microarquitetura óssea.
Abstract
O uso de na vivo microtomografia computadorizada (µCT) é uma ferramenta poderosa, que envolve a imagem não-destrutiva de estruturas internas em alta resolução em modelos animais vivos. Isto permite imagens repetidas de roedores a mesma ao longo do tempo. Esse recurso não só reduz o número total de roedores necessários em um projeto experimental e reduzindo a variação entre sujeitos que pode surgir, mas também permite que os pesquisadores avaliar respostas longitudinais ou ao longo da vida para uma intervenção. Para adquirir imagens de alta qualidade que podem ser processadas e analisadas com mais precisão quantificar resultados da microarquitetura óssea, usuários de scanners de µCT na vivo devem corretamente anestesiar o rato e posição e restringir o membro posterior. Para fazer isso, é imperativo que o rato ser anestesiada para um nível de relaxamento completo, e que o pedais reflexos são perdidos. Estas orientações podem ser modificadas para cada rato individual, como a taxa de metabolismo de isoflurano pode variar dependendo do tamanho da estirpe e corpo. A técnica apropriada para aquisição de imagens na vivo µCT permite uma medição exata e consistente da microarquitetura do osso dentro e através de estudos.
Introduction
O uso de na vivo microtomografia computadorizada (µCT) é uma ferramenta poderosa, que envolve a imagem não-destrutiva de estruturas internas em alta resolução usando modelos de roedores. A natureza não-destrutiva de µCT na vivo permite múltiplas imagens de roedores a mesma ao longo do tempo. Esse recurso não só reduz o número total de roedores necessários em um projeto experimental e reduzindo a variação entre sujeitos que pode surgir, mas também permite que os pesquisadores a entender as respostas a longo prazo para uma intervenção. Com o uso repetido na vivo µCT, experimentos em camundongos e ratos têm elucidado alterações do desenvolvimento para microarquitetura nos ossos e ossos densidade mineral (BMD) ao longo de períodos de vida útil 1,2,3 ,4,5,6,7,8 , bem como a resposta da saúde óssea para intervenções como dieta 9,10, ovariectomia 7,11 e agentes farmacológicos 8,12,13. BMD e microarquitetura óssea em locais específicos do esqueletos, nomeadamente a tíbia proximal, fêmur e vértebras lombares, são indicativos da saúde óssea em geral e do risco de sustentar uma fratura e então são as principais medidas quando quantificando respostas para um intervenção.
Aquisição de imagens in vivo µCT envolve bidimensionais projeções de raios-x, sendo adquiridas em vários ângulos, como a fonte de raios-x e detector giram em torno do animal sob investigação 14,15. A qualidade da imagem resultante é dependente de muitos fatores, incluindo, mas não limitado a: selecionados parâmetros de aquisição (i.e., resolução espacial, raio-x tensão, amperagem, passo de rotação, filtro aplicado, tempo de exposição), limitações da µCT scanner (ou seja, baseada em scanner de artefatos como artefatos de anel ou poeira que causam efeitos de volume estrias ou parcial) e o posicionamento adequado e contenção do animal. Os dois antigos desses fatores podem ser manipulados em algum grau pelo usuário, dependendo da máquina de digitalização específico, objetivos do estudo e as correções necessárias para otimizar a função do scanner ou o processamento de imagens adquiridas. O último desses fatores, o posicionamento adequado do roedor antes da digitalização, é possível independentemente das scanner com base em limitações ou os parâmetros de aquisição que são selecionados para atingir um objectivo de estudo específico. Enquanto muitas publicações envolvendo na vivo de imagem foram publicadas na literatura 14,15,16,17, estilo clássico manuscrito é tal que detalhada "como" informações Não pode ser incluída. Portanto, o objetivo do presente artigo e o vídeo-guia é preencher esse vazio. Aqui nosso objetivo instruir os usuários de scanners de µCT na vivo como anestesiar um rato e a posição e a restringir o membro posterior para produzir imagens de alta qualidade que podem ser analisadas com mais precisão quantificar resultados da microarquitetura óssea.
Evitar obstruções do feixe de raios-x através de objetos que não sejam os membros traseiros são imperativas para quantificar o BMD mais precisa e os valores da microarquitetura óssea. Como os raios x passam através de objetos e tecidos de diferentes espessuras e densidades, alguns dos raios x são absorvidos (ou seja, atenuado) pelos materiais passam por. Desde que a densidade da massa medida de uma amostra é afetada pela sua espessura e a presença e espessuras dos tecidos circundantes, é imperativo que os espectros de calibração utilizados para determinar a densidade óssea mineral são verificados da mesma maneira. Portanto, se o feixe de raios-x é a passagem de objetos (ou seja, a cauda) antes ou depois de passar pela região de interesse, esses objetos irão absorver algumas das energias de raio-x e irão interferir com a transmissão de imagem adquirida. Além disso, estes exames seria muito difícil simular ao digitalizar os phantoms que devem se assemelham a exames de amostra. Como resultado, estas diferenças de atenuação levam a imprecisão na avaliação das medições de densidade óssea mineral do osso. Assim, para facilidade e precisão, recomenda-se limitar o número de obstáculos entre a fonte de raios-x, detector de interesse e raio-x da região.
Avaliação longitudinal da estrutura óssea de uma intervenção em modelos pré-clínicos envolvem a anestesia repetida do animal para limitar seus movimentos durante a verificação de protocolos. Existem vários métodos de anestesia geral para subjugar os animais submetidos a um exame µCT, incluindo anestesia injetável e inalantes 1,2,4,5,6, 12. ao contrário de inalantes anestésicos como o isoflurano, anestesia geral repetida usando anestésicos injetáveis causar uma redução no peso corporal, tolerância cirúrgica e mudanças significativas para outros parâmetros fisiológicos em roedores, especificamente ratos e cobaias, sugerir significativas contra-indicações de repetido uso 18,19,20. Enquanto o isoflurano é altamente volátil e permite a rápida indução e recuperação, agentes anestésicos injetáveis produzem níveis variados de anestesia e tempo sob anestesia varia de acordo com a cepa, sexo, composição corporal, estado de jejum e ciclo circadiano do animal. Anestésicos injetáveis também representam barreiras adicionais para seu uso como eles são altamente regulamentados pelos órgãos de direcção nacionais. Anestesia por inalação, no entanto, envolve a entrega direta no sistema respiratório; Este método permite para uma mais rápida indução e recuperação tempo e melhor controlam sobre o comprimento e a profundidade da anestesia19,20. Limitações para o método de anestesia por inalação envolvem sua exigência para vaporização de equipamentos especializados e algumas mudanças de frequência cardíaca e pressão arterial durante a indução, manutenção e recuperação 18,19.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo Animal conta Comissão de Brock University e conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho canadense de cuidado Animal 21.
1. anestesia usando gás de isoflurano
- Pre-encha a câmara de incubação de vidro acrílico com qualidade O2 a uma taxa de fluxo contínuo de cerca de 1-2 L/min de uma máquina de anestésica (complementar a Figura 1).
- Transferir o rato com a cauda de câmara de incubação primeiro e feche a tampa de câmara de incubação para criar um selo hermético.
- Comece a encher a câmara de incubação com isoflurano veterinária-série em 3-4% v/v dissolvido em O2 a uma taxa de fluxo contínuo de 1-2 L/min (complementar a Figura 1).
Cuidado: Gases anestésicos de resíduos podem afetar adversamente a manipuladores. Um sistema de limpador (ou seja, um filtro de carvão ou diretamente em uma capa das emanações de gases de escape) deve estar sempre no lugar. - Quando o rato não é mais capaz de suportar, transferir o rato para uma máscara facial ou cone de nariz receberam isoflurano 1-3% dissolvido em O2 com um caudal de 1-2 L/min. ratos principalmente respirar através de seu nariz e assim, enquanto o nariz é coberto pela máscara facial ou nariz cone, haverá entrega de anestesia suficiente.
- Aplica oftálmica lubrificação para as delicadas membranas dos olhos para protegê-los de qualquer gás de escape de isoflurano.
Nota: Verifique se a lubrificação oftálmica está sem antibiótico, como isso pode afetar os resultados de uma intervenção. - Medir palpebral (olho piscando de resposta à estimulação suave da abertura palpebral) e pedal reflexos (retirada das patas em resposta a beliscar); com o aumento da profundidade da anestesia, reflexo palpebral irá estar ausente antes de pedalar reflexos (complementar Figura 2).
- Quando é atingido um nível adequado de anestesia e o rato perdeu reflexos palpebrais e pedais, manter o rato em 0,5-2% de isoflurano dissolvido em O2 com um caudal de 1-2 L/min.
- Monitore continuamente a taxa de respiração do rato ao longo do processo, mantendo uma constante visual no rato diretamente com um sistema de monitoramento interno ou através do live-vídeo alimentar (complementar a Figura 3).
2. posicionamento e contenção do membro Hind rato
- Coloque o rato em posição supina no scanner de fibra de carbono (complementar a Figura 4).
- Conter o pé direito em um maleável, espuma de tubo, com os dedos, estendendo-se fora da extremidade do tubo. Aplica cera dental para segurar o pé firmemente dentro da espuma e fita o tubo fechado hermeticamente. Certifique-se que o diâmetro do tubo segurando o pé é suficiente para se encaixar firmemente o tubo plástico.
- Introduza o tubo plástico do scanner de raios-x (complementar a Figura 5).
- Estenda o membro posterior de ratos até é tenso. Não excesso estenda a perna para que não provoquem nenhum dano para o rato (complementar a Figura 5) como isto pode induzir movimento involuntário dos membros devido a respiração com dificuldade.
- Puxe a perna esquerda (não-verificado o membro posterior) juntamente com a cauda fora do campo de visão digitalização e para o torso, longe da perna estendida a ser digitalizado.
- Segura a perna esquerda (não-verificado o membro posterior) e a cauda na posição usando fita adesiva. Não use nada mais ou menos pegajosa (i.e., fita adesiva ou fita de pintor) como estes materiais também irão prejudicar o rato quando eles são removidos (fita adesiva) ou não fornecer uma preensão forte o suficiente (fita de pintor) (complementar a Figura 6).
- Fixe o corpo do rato para a posição para os quadris, ombros e cabeça com a fita adesiva. Fixe a máscara facial ou cone de nariz para o rato (complementar a Figura 6).
Nota: Borre o lado adesivo da fita adesiva para remover a sua capacidade de manter a pele do rato. Não borre as extremidades da fita adesiva para que podem ser firmemente preso à cama de digitalização. - Embrulhe o rato em vet-filme para limitar a perda de calor (complementar a Figura 6).
Nota: Quando sob anestesia geral, ratos perdem calor rapidamente devido a sua grande superfície de corpo peso ratio 19,20. - Monitore continuamente a taxa de respiração do rato ao longo do processo, mantendo uma constante visual no rato (seja diretamente ou através de um vídeo ao vivo-alimentar).
Nota: Aqui configurar leva 5 min, aquisição de varredura é dependente da configuração de aquisição e tempo de recuperação é de 60 minutos. - Proceda para adquirir as imagens µCT.
Nota: As especificações exatas para aquisição de varredura são específicas para cada scanner tipo, sistema de software e a pergunta de pesquisa específica, no entanto, várias publicações metodológicas existem em toda a literatura 1,2 , 9.
3. recuperação da anestesia
- Depois na vivo µCT digitalização for concluída, interromper o fluxo de isoflurano para o rato, mas manter um fluxo de 1-2 L/min de O2.
- Quando o rato recupera o controle motor (1-2 min), removê-lo do respirador e permitir que ele recupere individualmente em uma gaiola parcialmente colocada sobre uma almofada de aquecimento de uso geral em fogo baixo. Ratos são conhecidos para reduzir a temperatura corporal de 1 ° C, quando, sob anestesia geral19. Não abandone o rato até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
Nota: A evidência anedótica de nosso grupo de pesquisa informa que imediatamente após a recuperação da anestesia de isoflurano, ratos começam a comer e por isso é importante ter seu alimento e água disponíveis para eles durante a recuperação. Embora temos observado esse comportamento, repetida anestesia geral não provoca um aumento significativo nos alimentos ingestão ou corpo peso 1,9.
Representative Results
Este método de anestesia para o rato e o posicionamento e a contenção do membro hind na vivo imagem µCT facilita a aquisição de alta qualidade imagens adequadas para a análise da microarquitetura de tíbia. Posicionamento adequado do membro hind rato envolve sendo totalmente estendido a perna e o pé inteiro e tornozelo contido em espuma (figura 1A), resultando em uma imagem adquirida de qualidade suficiente para análise do (microarquitetura trabecular e cortical Figura 1B). Colocação de insuficiente e contenção do membro hind (Figura 1) podem resultar em imagens com artefatos de movimento (Figura 1), enquanto uma cauda que não é totalmente removida da varredura do campo de visão (Figura 1E) irá interferir com raio-x atenuação pelas amostras digitalizadas (Figura 1F) e alterar as medições de densidade mineral (DTM) BMD e tecido. Qualquer um desses erros de posicionamento resultará em uma varredura de má qualidade que não deve ser mais analisada. Alcançar imagens de baixa qualidade irão alterar a quantificação da rede trabecular fina e estrutura cortical do membro hind e produzirão dados inadequados ou inconclusivos14.
Figura 1. Imagens representativas de colocação do membro hind rato e correspondentes imagens adquiridas da tíbia proximal em secção transversal.
(A) colocação apropriada do membro hind rato com o tornozelo amarrado em espuma, perna estendida e cauda se afastou de tíbia fornece qualidade de imagem suficiente em (B) seção transversal da tíbia trabecular e cortical microarquitetura. (C) colocação imprópria do membro hind rato com a perna não totalmente estendido e tornozelo não está completamente contido em espuma pode resultar em artefatos de movimento (D), vistos como estrias em secção transversal. (E) objetos interferindo com o campo de visão, tais como a cauda que não se afastou de tíbia (F) interfere com atenuação de raios-x da tíbia e pode resultar em BMD alterado e DTM medições, embora não visualmente evidente. O canto inferior esquerdo no painel F mostra uma parte da cauda, no campo de visão, que interferiu com o feixe de raios-x que posteriormente passou a tíbia. Linhas pontilhadas vermelhas nos painéis da esquerda indicam a seção transversal apresentada nos painéis da direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1. Isoflurano anestésico unidade Isoflurano anestésica unidade criada para fornecer 3-4% de isoflurano dissolvido em O2 em uma taxa de fluxo contínua de 1-2 L/min para a indução da anestesia geral. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 2. Garantindo a profundidade da anestesia. Pedais reflexos de medida por beliscar os dedos do pé do rato recebendo contínua inalado anestésico através de uma máscara facial ou cone de nariz. A resposta de dor é mais evidente quando a perna é ligeiramente estendida. Pitadas de muito fortes ou o uso de pinças ou grampos pode induzir dano tecidual e, portanto, não deve ser usado. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 3. Tela captura da visão da câmera monitorização fisiológica feed live. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 4. Rato, deitado em posição supina na base do scanner de fibra de carbono. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 5. Pé do rato contido em um tubo de espuma maleável direito. Pé direito do rato é contido em um tubo de espuma maleável com os dedos, estendendo-se fora do tubo (não retratado aqui). O tubo de espuma é contido em um suporte plástico (por favor consulte a Tabela de materiais/equipamento específico para informações mais detalhadas). Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 6. Rato, fixado em posição com a perna direita estendida direto. O pé esquerdo e caudo é gravado longe da perna direita (em direção ao tronco), os quadris estão garantidos e o torso de rato é envolto em vet-envoltório (azul) para limitar a perda de calor. Clique aqui para baixar esta figura.
Discussion
Este protocolo fornece os telespectadores com a primeira orientação detalhada para a anestesia adequada, colocação e retenção do rato durante na vivo µCT digitalização do membro hind. Essas diretrizes permitem que os utilizadores na vivo µCT sistemas de digitalização para obter alta resolução e imagens de alta qualidade da tíbia que pode ser processado para a quantificação da microarquitetura óssea 3-dimensional. Passos críticos no protocolo necessário para assegurar o correcto posicionamento e restrição envolvem a anestesia adequada de rato, bem como estendendo o membro posterior, longe de todas as outras estruturas críticas até é tenso, mas não em uma posição natural. Para resultados de imagem ideais, é imperativo que o rato ser anestesiada para um nível de relaxamento completo, e que reflexos palpebrais e pedais são perdidos. Além disso, deve abranger também a digitalização perna e o pé inteiro e tornozelo devem ser contidos em espuma. Os métodos descritos acima para obter um posicionamento da perna digitalização irão garantir que: 1) membros posteriores dos ratos dentro de um estudo são consistentemente orientados na mesma direção, permitindo assim que o feixe de raio-x para passar a mesma área de cada perna, pois ele gira ao redor da amostra; 2) movimento ambas voluntário e involuntário do membro hind não ocorrerá, assim, minimizando o potencial de artefatos de movimento interferir com a qualidade das imagens adquiridas; 3) obstruções de objetos (ou seja, a cauda) são impedidas, minimizando assim o potencial para efeitos de volume parcial produzir medidas imprecisas BMD e DTM. Estas orientações podem ser modificadas para cada rato individual, como a taxa de metabolismo de isoflurano e posicionamento pode variar dependendo da estirpe e corpo de tamanho 22. O mais comum na vivo varredura as máquinas é projetadas para pequenos modelos animais (ou seja, ratos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia) e terá fases animais intercambiáveis para permitir a exploração de diferentes tamanhos de animais. Portanto, podem acomodar uma ampla gama de peso corporal.
Embora na vivo µCT digitalização licenças para o rato ser reposicionado e verificados novamente se as imagens que adquiriu a partir da digitalização inicial são de má qualidade, repetida digitalização irá expor o rato a doses adicionais de radiação e isoflurano anestesia para um período prolongado de tempo. Exposição de radiação repetidas mensal de 600 mGy focada para a tíbia de ratos durante quatro meses não causa efeitos adversos ao osso microarquitetura em comparação com o membro contralateral do posterior 1, mas isto não verificar a segurança de duas varreduras repetidas em sucessão imediata. Outras limitações da técnica descrita incluem a necessidade de estender o membro posterior tenso com forças aplicadas a ele para mantê-lo ainda, que podem invocar algumas mudanças na estrutura óssea. Enquanto a severidade da contenção do membro hind durante a digitalização vai depender de cada objectivo da investigação, estudos prévios do nosso laboratório envolvendo mensal repetidas na vivo µCT imagem de um membro posterior resultaram em uma diferença na cortical microarquitetura parâmetro, excentricidade, em comparação com o membro posterior contralateral que não passam por extensão repetida, estabilização e digitalização 1. Excentricidade é uma medida da forma elíptica do osso cortical e alterações em resposta a alterou a carga. Portanto, quando usar este método de posicionamento e de restrição do membro hind para repetidas na vivo µCT de imagem, consideração deve ser feita quando avaliar e interpretar alterações aos parâmetros de microarquitetura de carga.
Enquanto as orientações acima foram fornecidas para a geração de imagens e análise do tecido ósseo, pequenos ajustes no protocolo devem ser feitos quando a imagem de tecidos moles do membro hind. Especificamente, a maneira em que o membro posterior é estendido a partir do tronco e contido deve ser tomada em conta, como o atual procedimento deforma a orientação do tecido mole (músculo, tecido adiposo) em posicionamento anormal para a duração da verificação. Portanto, quando extrapolando este modelo para uso em imagens dos tecidos moles do membro hind, alguns ajustes devem ser feitos com a técnica de contenção para reduzir ou eliminar as alterações no posicionamento dos tecidos em relação um ao outro.
Além disso, as orientações foram escritas especificamente com base nas experiências do nosso grupo de pesquisa, no entanto, eles podem ser modificados para acomodar outros scanners µCT comercialmente disponíveis na vivo . Outros métodos sugeridos para posicionar e restringir o membro posterior podem estar disponíveis pelo fabricante do µCT na vivo , sistema de digitalização. Mais comercialmente disponível na vivo unidades µCT listam de poliestireno expandido, polipropileno e tubos plásticos com cera dental para segurar um saliente do pé como aceitáveis materiais e métodos para imobilizar a perna de digitalização. No entanto, o método apresentado neste protocolo fornecer mais controlado e consistente de posicionamento e contenção da perna digitalizada e, consistentemente produz imagens de alta qualidade. As diretrizes apresentadas no presente método requerem equipamento especializado necessário para a anestesia do rato, como um vaporizador, tubos, máscaras, câmaras de indução e oxigênio. Embora o equipamento esteja associado com um custo um pouco maior, em comparação com anestésicos injetáveis, permite que os pesquisadores a capacidade de rapidamente e precisamente induzir anestesia em profundidades específicas da consciência, que fornece uma vantagem sobre a alternativa métodos.
Usando as diretrizes descritas no presente método vídeo, pesquisadores utilizando tecnologias de alta resolução na vivo µCT para investigar a sua intervenção de interesse será capaz de corretamente e consistentemente orientar e conter um membro posterior de ratos para alta imagem de raio x de qualidade. Isso fornecerá um continuum em matéria de aquisição de imagens na vivo µCT e servir como um passo para otimizar a consistência e a precisão dentro de estudos e permitir comparações entre estudos na literatura. Da mesma forma, estes protocolos e métodos podem ser expandidos para uso em outras espécies de roedores, incluindo ratos, apesar de algumas mudanças serão necessárias 2,10. Por exemplo, o apoio do pé no tubo de espuma pode incluir o tornozelo para minimizar a possibilidade de movimento da perna durante a verificação. Além disso, o pé completo vai caber no suporte da espuma. Assim, os dedos não se estendem do final do titular como fazem ao fixar o pé de um rato. Além disso, o corpo do rato não exige a mesma contenção com fita como o rato. Um cone de nariz menor pode ser usado para a manutenção de anestesia em ratos durante a verificação. Se um cone de nariz menor não estiver disponível, podemos garantir uma luva de nitrilo sobre o cone de nariz disponível e faça uma pequena incisão no porta-luvas para proporcionar um espaço que pode caber o nariz do rato para fornecer anestesia, mantendo uma vedação em volta do nariz.
Enquanto a tíbia proximal é o site principal da investigação de alterações no rato da microestrutura óssea, orientações para o posicionamento adequado e consistente de outros sites esqueléticos como o fêmur e vértebras lombares devem ser investigadas e estabelecidas para consistência na literatura. No entanto, quando a realização de futuras pesquisas envolvendo a imagem das vértebras lombares, considerações devem ser feitas como imagem da coluna vertebral fornece a exposição à radiação para os tecidos e órgãos circundantes.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem pesquisa financiamento de um subsídio de descoberta do NSERC (#05573) e a Fundação do Canadá para a inovação (#222084) para financiamento na vivo micro-CT. W.E. Ward é uma cadeira de pesquisa do Canadá em osso e desenvolvimento muscular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Animal Health | 108737 | |
| Vaporizer | Dispomed | 990-1091-3SINEWA | |
| Scavengers/Charcoal Filters | Dispomed | 985-1005-000 | |
| Micro-CT Scanner | Bruker microCT | SkyScan 1176 | |
| Dental wax | Kerr Dental Laboratory | 623 | |
| Foam (Backer Rod) | Rona | CF12086 | 1”x10’ |
| Plastic tube | Bruker microCT | SP-3010 | |
| Carbon-fiber bed | Bruker microCT | SP-3002 | |
| Vet Wrap/Bandage | Dura-Tech | 17473 | |
| Ophthalmic Gel | OptixCare | 006CLC-4256 | Antibiotic-free |
| Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 |
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