Summary
Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.
Abstract
A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase. É constituída por duas glândulas com funções e origens embrionárias distintas — a neuro-hipófise e a adenohipófise. A desenvolvimento do mouse hipófise é minúsculo e delicado com uma forma oval alongada. Uma secção coronal é preferida para exibir tanto a adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse.
O objetivo do presente protocolo é conseguir a adequada da hipófise secções coronais com arquiteturas de tecido bem preservado de desenvolver ratos. Neste protocolo, descrevemos em detalhe como dissecar e processo hipófises corretamente de desenvolvimento de ratos. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Em seguida, três diferentes técnicas de dissecação são aplicadas para obter intactas as glândulas pituitárias, dependendo da idade dos ratos. Para ratos fetais entre embrionários dias (E) 17,5-18.5 e neonatos acima de 4 dias, as regiões de sella inteira, incluindo o osso esfenoide, glândulas e nervos trigêmeo são dissecadas. Para filhotes idade pós-natal dias (P) 5-14, as glândulas pituitária conectados com os nervos trigêmeo são dissecados como um todo. Para ratos mais de 3 semanas de idade, as glândulas pituitária são cuidadosamente dissecadas de graça os tecidos circundantes. Também exibimos como incorporar as glândulas pituitária em uma orientação correta usando os tecidos circunvizinhos como Marcos para obter satisfação secções coronais. Esses métodos são úteis na análise de características histológicas e do desenvolvimento das glândulas pituitária no desenvolvimento de ratos.
Introduction
A glândula pituitária ou hipófise é um importante órgão endócrino secreção de hormônios essenciais para a homeostase1,2. Anatomicamente, a glândula pituitária é uma estrutura ' dois-em-um ' da neuro-hipófise e a adenohipófise. Estas peças têm a função e diferentes origens embrionárias muito diferentemente. A neuro-hipófise é derivada do ectoderma neural e segrega ocitocina e hormônio antidiurético. A adenohipófise origina-se de bolsa de Rathke e é responsável para a liberação de hormônios, incluindo o hormônio do crescimento, prolactina, hormônio estimulante da tireoide, hormônio folículo estimulante, hormônio luteinizante, hormônio adrenocorticotrófico, e melanócito – estimulante hormônio3,4,5.
A glândula pituitária baseia-se na superfície dorsal do osso esfenoide (sella turcica) do crânio do mouse e é ligada ao pavimento do cérebro por um frágil caule. Está rodeada lateralmente pelos nervos trigêmeo e anteriormente pelo quiasma óptico6,7. A glândula tem uma forma oval alongada com seu longo eixo perpendicular a isso da cabeça. Em sua superfície dorsal, a neuro-hipófise e a adenohipófise podem facilmente ser demarcadas, com a primeira ocupando a região dorsal medial e o último estendendo lateralmente e ventralmente. Durante o desenvolvimento pós-natal, o tamanho da hipófise aumenta rapidamente no primeiro mês após o nascimento de8,9. Não obstante, a hipófise de rato ainda é muito pequena em tamanho, com um peso médio de 1,9 mg e long-eixo de ~ 3 mm de diâmetro em adulto10, um diâmetro de eixo longo de 2-2,5 mm no pós-Natal dia 21 (P21) e apenas de 1-1,5 mm em P0.
Uma secção coronal é preferida para exibir ambos adenohipófise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise do mouse. No entanto, algumas habilidades técnicas são necessárias para obter a satisfação secções coronais de glândulas pituitárias de desenvolver ratos devido ao seu tamanho extremamente pequeno e anatomia distinta. Neste artigo de vídeo, demonstramos como dissecar as glândulas pituitárias de rato e preparar secções coronais da hipófise em diferentes estágios de desenvolvimento.
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Protocol
camundongos C57BL/6 são criados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. Todos os métodos experimentais animais estejam em conformidade com as diretrizes aprovadas pelo Comitê de ética na Universidade de medicina militar de segundo e cuidado Animal.
1. dissecação de pós-natal desenvolvendo hipófise
- realizar anestesia: Coloque gelo picado para induzir hipotermia neonatais ratos (P0 - P5). Para os ratos mais de 5 dias de idade, injete intraperitonealmente uretano 5% (30 µ l/g de peso corporal) para induzir anestesia. Avalie respostas para toe cauda pitadas. Prossiga somente depois que o mouse não está respondendo aos estímulos nocivos.
- Segura o mouse na posição supina (deitado na parte de trás com face para cima) gravando suavemente as dianteiras e composto para uma superfície de trabalho que é capaz de ser fixado (ou seja, isopor) dentro de uma coifa química.
- Executar a perfusão transcardial.
- Cortar a caixa torácica de rato com uma tesoura cirúrgica para expor o coração (e outros órgãos torácicos).
- Segura o coração a bater com fórceps rombudo e insira uma agulha 26G (0,45 mm) no ventrículo esquerdo. A agulha está ligada a uma seringa de 10 mL, preenchida com solução salina heparinizada tamponada de fosfato (PBS; suplementado com nitrito de sódio 5 mg/mL e 10 U/mL heparina, pH 7,4, aquecer a 37 ° C antes do uso). Imediatamente cortar o átrio direito com uma tesoura bem e começam a perfundir o corpo com o PBS quente até o fluido sair do átrio direito é claro.
Nota: Aproximado de 5-10 mL de PBS é necessária para os ratos Neonatais e 10-20 mL de solução Isotónica de ratos adultos. - Manter a agulha no lugar e mudar para outra seringa preenchida com paraformaldeído 4% (PFA; pH 7,4). Perfundir 10 mL e 20 mL de fixador para neonatal e P21 mouse, respectivamente.
Atenção: O PFA é tóxico. Pode causar irritações respiratórias, pele e lesões oculares. Use luvas e trabalhar sob uma capa química.
- Decapitar o mouse PFA-fixo e abriram o osso do crânio com uma tesoura.
- , Levante suavemente o rombencéfalo da base do crânio com uma pequena pinça. Ao primeiro sinal da Sela túrcica, paragem de levantamento, mas mantenha o rombencéfalo, cortar a haste hipofisária e fibras nervosas conectando à base do cérebro com uma tesoura bem. Esta etapa é fundamental para garantir que a hipófise não é levantada longe com o cérebro.
- , Então, continuar levantando o cérebro e remover o cérebro inteiro para expor a glândula pituitária totalmente. Cortar a região toda sella, incluindo a glândula pituitária, laterais nervos trigêmeo e as por baixo do osso esfenoide com tesoura (aproximadamente 3 x 5 mm 2).
- Colocar o tecido dissecado em um prato de 35mm ou um bem de uma placa de 6 contendo 2 mL frio 4% PFA (pH 7,4). Fixar o tecido a 4 ° C por 40 min para P0 - P7 pituitaries, 1h para P14 pituitaries, 1,5 h para P21 - P28 pituitaries e 3h para adultos pituitaries.
- Outras dissociação da hipófise
- lava o tecido fixo com 10 mL de PBS, 5 mudanças, 15 min cada. A glândula pituitária neonatal juntamente com seus tecidos circundantes e o abaixo do osso esfenoide podem ser processados diretamente à desidratação. No entanto, as glândulas pituitárias de ratos mais de 5 dias deve ser dissociadas mais sob um microscópio estéreo.
- Colocar o tecido fixo em um prato de 35 mm, contendo 1 mL de PBS. Para P5 - P14 pituitaries, retire as membranas conectivos entre os nervos e os ossos com pinça fina e tesoura e isolar cuidadosamente a glândula pituitária, juntamente com nervos laterais do trigêmeo como um todo, mas deixando a Sela túrcica. A glândula isolada e os nervos estão ligados por membranas conjuntivo com uma " H "-como a aparência ( figura 1B). Pituitaries de
- para P21 e adulto, remova os nervos e membranas conectivos ao redor a hipófise e livre a glândula os tecidos circundantes. O tecido da hipófise, enrole com papel de tecido de limpeza de lentes e colocá-lo dentro de um estojo de encastre.
Nota: A hipófise minúscula de embrulho com papel de tecido de limpeza de lentes ajuda a evitar qualquer possível perda de espécimes e preservar a integridade do tecido o seguinte procedimento de incorporação de parafina. Pode não ser necessário embrulhar a hipófise se é processado em uma pequena garrafa no procedimento cryo-incorporação.
2. Incorporação e Set Sectioning de parafina
- desidratar os espécimes em incorporação cassettes com soluções de etanol 50%, 65%, 75% e 95% por 15 min cada. Posteriormente desidrate com 3 alterações de etanol puro, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Claro com xileno, 3 mudanças, 3 min para P0 - P4 glândulas, 4 min para P5 - P14 glândulas e 5 min cada para P21 e glândulas mais velhas. Infiltrar-se com cera de parafina derretida, 3 alterações, 7 min cada para P0 - P4 glândulas, e 8 min duas vezes seguido por 6 min uma vez para P5 e glândulas mais velhas.
Nota: Os parâmetros ideais para processamento do tecido podem ser empiricamente ajustados. Para obter as seções de alta qualidade, desidratação insuficiente ou superior deve ser evitada. O mesmo é verdadeiro para limpar o tecido usando xileno. - Orientação ao incorporar
- sobre um tecido de incorporar o sistema do console, retirar a amostra da gaveta e colocá-lo em um molde base half-filled com cera de parafina derretida. Orientação adequada da glândula pituitária de encastre é essencial para satisfazer secções coronais.
- Para P21 e adulto as glândulas pituitárias, posicione a glândula pituitária, com seu eixo curto perpendicular à superfície inferior de um molde base (o plano de corte). Use esfenoide ossos e nervos trigêmeo como pontos de referência anatômicos para P0 - P4 e P5 - P14 pituitaries, respectivamente. Orientar os espécimes com seus nervos trigêmeo ou lâmina transversal dos ossos esfenoide perpendiculares à superfície inferior de um molde base.
- Pressione cuidadosamente o tecido na posição desejada com a pinça bem aquecida até que a cera se torne semi-sólido em uma placa de resfriamento. Encha o molde com cera de parafina derretida. Permitir que o bloco de parafina esfriar até que a cera é totalmente solidificada.
Nota: A hipófise no dia embrionário 18,5 (E18.5) pode ser tratada da mesma forma como a hipófise neonatal. Mas os pituitaries (Rathke ' malotes s) mais jovem que E16.5 deve ser encaixado com a cabeça inteira e orientada com o eixo sagital (da boca ao occipício) perpendicular à superfície inferior de um molde base.
- Chill o bloco de parafina a-20 ° C por 10-20 min e depois cortá-la em finas fatias (4 µm de espessura é preferencial) com um micrótomo. Para obter secções coronais satisfatórias, ajuste a posição dos blocos de parafina durante o corte. Montar as fatias de tecido em lâminas de vidro revestido polylysine para evitar o desprendimento de fatias nos procedimentos a seguir.
Nota: Alternativamente, as amostras podem ser desidratadas em 15%, 30% (P/V) de soluções de sacarose (em PBS) a 4 ° C até que eles descem para o fundo, incorporado em crio-incorporação composto usando o mesmo método de orientação e rapidamente congelado em gelo seco. Os blocos de tecido congelado corte em fatias de 8-10 µm usando um criostato. A morfologia da cryo-seções, no entanto, é muitas vezes inferior a secções de parafina.
3. H & E coloração e imunofluorescência rotulagem
- quente os slides em um calor bloqueiam a 55 ° C e dewax com xilol, 2 trocas, 4 min. Desidrate as amostras com o dobro de etanol a 95% e 75% de etanol duas vezes, 3 min cada. Lave os slides com água destilada por 5 min num agitador.
- Para H & E mancha, mancha as seções na solução de alúmen hematoxilina por 6 min, enxaguar em runnágua da torneira ing por 2 min, diferenciar-se com água de amônia de 0,2% para 45 s e re-enxaguar em água corrente por 2 min. Então desidrata-se as seções com etanol a 95% por 1 min e mancha com eosina por 2 min. sequencialmente desidratam, limpar e montagem.
- Imunofluorescência rotulagem
- trata as seções com metanol contendo 3% H 2 O 2 e 0,01% NaN 3 por 20 min em temperatura ambiente para inactivar peroxidases endógenas. Recuperar a antígenos por ebulição seções no buffer de recuperação (EDTA 1 mM e 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) em uma panela de pressão por 2 min. Incubar as secções com tampão de bloqueio (5% de soro de cabra em PBS) por 30 min a 37 ° C.
- Incubar seções com anticorpo anti-hormônio (GH) (1:2, 000) ou anticorpo proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) (1:2, 000), diluídas em tampão de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
- Seções com anticorpo secundário (cabra anti-coelho IgG-HRP, 1: 300 em tampão de bloqueio), incubar durante 35 minutos a 37 ° C.
- Amplificar os sinais usando Biotinyl Tyramide (01:50 em solução salina tamponada de Tris contendo 0,3% H 2 O 2) durante 15 minutos à temperatura ambiente e Visualizar com Streptavidin-Alexa594 ou 488 (1: 300 no bloqueio de buffer, 30 min, a 37 ° C).
- Counterstain os núcleos com DAPI (50 mg/L em PBS) durante 5 min à temperatura ambiente.
Nota: Pode não ser necessário amplificar o sinal usando o sistema de amplificação de sinal de Tyramide (TSA). Alternativamente, um anticorpo secundário conjugado fluorescência pode ser usado para visualizar o sinal.
- Adquirir imagens usando um microscópio de fluorescência equipado com DAPI, Texas Red e conjuntos de filtros FITC, × 4/0,13 × 40/0.75 objectivos e câmera de 5.0 megapixel. Use o 360, 488 e 594 nm laser comprimentos de onda para imagiologia DAPI, Alexa 488 - e seções manchadas de 594 Alexa, respectivamente. Otimizar a potência do laser (0.8 foi usado geralmente) e tempo de exposição para os níveis desejados para cada canal. Capturar a imagem sob o controle do software de aquisição de imagem e sobrepor as imagens de fluorescência posteriormente usando o software de processamento de imagem.
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Representative Results
Este protocolo apresenta um método para dissecar as glândulas pituitárias de desenvolver ratos. Para o mouse neonatal, as regiões de sella inteira que contém a glândula pituitária, os nervos trigêmeo e parte de baixo osso esfenoide foram dissecados para fora da base do crânio. A glândula pituitária pequena e delicada permaneceu intacta durante o processo (figura 1A). Para os ratos mais de 5 dias, as glândulas pituitária anexadas aos nervos trigêmeo laterais foram então isolado. A estrutura bruta da glândula pituitária isolada de rato foi bem preservado o P7 (figura 1B). Para o mouse de P21, o tamanho da glândula pituitária foi aumentado notavelmente comparada com a do rato neonatal. A glândula pituitária foi com êxito isolada com dano invisível ao remover seus tecidos circundantes (Figura 1).
Para exibir a região de máxima da Adenohipofise e neuro-hipófise em uma única fatia da hipófise, uma secção coronal é preferencial. As glândulas pituitária dissecadas foram devidamente orientadas para conseguir satisfazer secções coronais. H & E coloração mostrou bem preservada a morfologia da Adenohipofise e neuro-hipófise em P0, P7 e P21 hipófises (Figura 2).
As fatias processadas também eram compatíveis com imunofluorescência rotulagem. Como exemplo, a adenohipófise e a neuro-hipófise mostrou immunolabeling específico de GH e GFAP, respectivamente (Figura 3).
Figura 1: dissecação de pós-natal em desenvolvimento hipófises. Vista dorsal para dissecado as glândulas pituitárias e tecidos circunvizinhos de ratos P0, P7 e P21. A, anterior; P, posterior; L, à esquerda; R, certo; SB, osso esfenoide; TN, nervo trigêmeo; AH, adenohipófise; NH, neuro-hipófise. Escala de barras, 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: histologia das glândulas pituitárias de rato. H representante & E manchas nas secções coronais pituitária de ratos P0, P7 e P21. (A, Be C) são vistas de baixa ampliação de pituitaries coronais. (D, Ee F) são respectivamente o alargamento das áreas enquadrados em (A, Be C). Barras de escala = 1 mm em (A, B e C); e 20 µm (D, E e F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: coloração imunofluorescente representativo sobre as glândulas pituitárias. (A) GH (vermelho) foi especificamente expresso na adenohipófise de ratos P7. (B) Magnified imagem da área enquadrada em r. (C) GFAP (verde) foi especificamente expresso na neuro-hipófise de ratos P21. (D) Magnified imagem da área enquadrada em C. núcleos estavam manchadas com DAPI (azul). Barra de escala = 300 µm (A e C); e 30 µm (B e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para o desenvolvimento de murino pituitaries, tem sido difícil tecnicamente obter as seções coronais adequadas, devido a suas características de pequenas e frágil e características anatômicas únicas6,8. Alguns grupos de pesquisa assim escolhi meados-sagital seções para analisar a morfologia do embrionário e neonatal na hipófise11,12. Embora a meados-sagital da hipófise também é capaz de mostrar anterior, intermediária e posteriores lobos em uma única fatia, seção coronal é altamente preferida como pode mostrar vista máxima para estes três lobos. Em particular, para estudos de quantificação, tais como a determinação do volume e área da glândula pituitária e contando o número de apoptose e proliferação de células, secções coronais são superiores às secções médio-sagitais em termos de seu representante. Aqui, apresentamos um método útil para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.
Para evitar danificar as glândulas pituitária durante o processo, várias técnicas têm sido utilizadas neste protocolo. Primeiro, os ratos são fixos por perfusão transcardial de formaldeído antes da dissecação. Este fixador não só ajuda a preservar a arquitetura do órgão, mas também para remover células vermelhas do sangue que muitas vezes resultam em auto fluorescência13. Em segundo lugar, a região inteira sella é dissecada para evitar tocar a glândula pituitária com qualquer ferramenta duro-cirúrgica. Os tecidos circundantes ajudam a manter a glândula pituitária na sua posição original e também servir como pontos de referência para a incorporação de orientação. Com estes métodos empregados, menores pós-natal pituitaries de animais mais jovens podem ser dissecados enquanto reduzindo a probabilidade de danos indesejáveis.
O procedimento de dissecação neste protocolo é igualmente aplicável para isolar murino pituitária que não tenha sido previamente fixada por perfusão. Nesse caso, mais cautela deve ser tomada para evitar danos indesejáveis e a glândula também deve ser dissecada tão rapidamente quanto possível.
Desde pituitaries murino em desenvolvimento são muito pequenos em tamanho, tem sido muito difícil para orientá-los adequadamente ao incorporar. Este protocolo usa os nervos trigêmeo ou ossos esfenoide como Marcos, tornando as etapas de orientação muito mais fácil. Pituitaries corretamente orientados são essenciais para conseguir satisfazer secções coronais.
Em resumo, nós fornecemos uma dissecação da hipófise melhorada e incorporação protocolo, que é apropriado para ratos em diferentes estágios de desenvolvimento. Aplicação destes procedimentos pode obter satisfação secções coronais de murino glândulas pituitária deve ser usado para análise de rotina histologia, imuno-histoquímica, hibridação in situ e no desenvolvimento da pesquisa14.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelas concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (31201086, 31470759 e 31671219) e a Fundação de ciência Natural de Shanghai (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
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