Summary
Vi præsenterer en protokol til at dissekere hypofyse og forberede hypofyse koronale sektioner fra udvikle mus.
Abstract
Hypofysen eller hypofysen er en vigtig endokrine organ udskiller hormoner afgørende for homeostase. Det består af to kirtler med separat embryonale oprindelse og funktioner — neurohypophysis og adenohypophysis. Udvikle mus hypofyse kirtel er lille og delikat med en aflang oval form. En koronale del er foretrukket at vise både adenohypophysis og neurohypophysis i en enkelt skive af musen hypofysen.
Målet med denne protokol er at opnå ordentlig hypofyse koronale sektioner med velbevarede væv arkitekturer fra udvikle mus. I denne protokol beskriver vi i detaljer hvordan man kan dissekere og behandle hypofyse korrekt fra udvikle mus. Først, mus er fastsat af transcardial perfusion af formaldehyd før dissektion. Derefter anvendes tre forskellige dissekere teknikker for at opnå intakt hypofyse afhængigt af alder af mus. For føtal mus alderen embryonale dage (E) 17,5-18,5 og nyfødte op til 4 dage, er hele sella regioner herunder kilebenet, kirtel og trigeminus nerver dissekeret. For hvalpe er alderen postnatal dage (P) 5-14, hypofyse forbundet med trigeminus nerver dissekeret som helhed. For mus over 3 uger gamle, er hypofyse omhyggeligt dissekeret gratis fra det omgivende væv. Vi viser også hvordan man kan integrere hypofyse i en ordentlig orientering ved hjælp af det omgivende væv som vartegn for at opnå tilfredsstillende koronale sektioner. Disse metoder er nyttige i at analysere histologiske og udviklingsmæssige funktioner af hypofyse udvikle mus.
Introduction
Hypofysen eller hypofysen er en vigtig endokrine organ udskiller hormoner afgørende for homeostase1,2. Anatomisk, er hypofysen en '' to-i-én '' struktur bestående af neurohypophysis og adenohypophysis. Disse dele har forskellig embryonale oprindelse og funktion meget forskelligt. Neurohypophysis er afledt af neurale ectoderm og udskiller oxytocin og antidiuretisk hormon. Adenohypophysis stammer fra Rathkes pose og er ansvarlig for frigivelse af hormoner, herunder væksthormon, prolaktin, thyreoidea - stimulerende hormon, follikel - stimulerende hormon, luteiniserende hormon, adrenokortikotropt hormon, og melanocyte - stimulerende hormon3,4,5.
Hypofysen hviler på den dorsale overflade af sphenoid knoglen (sella turcica) mus kraniet og er fastgjort til gulvet i hjernen ved en skrøbelig stilk. Det er omgivet sideværts af trigeminus nerver og anteriorly af optiske chiasm6,7. Kirtlen har en aflang oval form med sin lange akse vinkelret hovedet. På sin dorsale overflade, kan neurohypophysis og adenohypophysis nemt afgrænses, med den tidligere besat den dorsale mediale region og den sidstnævnte strækker sig lateralt og ventrally. Under postnatal udvikling, størrelsen af hypofyse stiger hurtigt i den første måned efter fødslen8,9. Ikke desto mindre er mus hypofysen stadig meget lille i størrelse med en gennemsnitlig vægt på 1,9 mg og en lang-akse diameter på ~ 3 mm i voksen10, en lang-akse diameter på 2-2,5 mm på postnatal dag 21 (P21), og kun 1-1,5 mm på P0.
En koronale del er foretrukket at vise både adenohypophysis og neurohypophysis i en enkelt skive af musen hypofysen. Dog er nogle tekniske færdigheder kræves for at opnå tilfredsstillende koronale sektioner af hypofyse fra udvikle mus på grund af sin usædvanligt lille størrelse og forskellige anatomi. I denne video artikel viser vi, hvordan dissekere mus hypofyse og forberede hypofyse koronale sektioner på forskellige udviklingsfaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
C57BL/6 mus er avlet i specifikt patogenfrie betingelser. Alle dyr eksperimentelle metoder er i overensstemmelse med de retningslinjer, der er godkendt af Animal Care og etiske komité på anden militær medicinske universitet.
1. dissektion af Postnatal udvikling hypofysen
- udføre anæstesi: placere neonatal mus (P0 - P5) på knust is til at fremkalde hypotermi. For mus ældre end 5 dage gammel, indsprøjtes 5% urethan (30 µL/g kropsvægt) intraperitoneal for at fremkalde anæstesi. Vurdere svar for at hale/tå pinches. Gå videre, når musen ikke reagerer på de skadelige stimuli.
- Sikre musen i den liggende stilling (liggende på ryggen med ansigtet opad) ved forsigtigt taping af forepaws og hindpaws til en arbejdsflade, der er i stand til at blive fastgjort (dvs., Styrofoam) inde i en kemisk stinkskab.
- Udføre transcardial perfusion.
- Skære musen brystkasse med kirurgisk saks til at udsætte hjertet (og andre thorax organer).
- Sikre bankende hjerte med stumpe pincet og indsætte en 26G (0,45 mm) nål ind i venstre hjertekammer. Nålen er fastgjort til en 10 mL sprøjte fyldt med heparinized fosfatbufferet saltopløsning (PBS; suppleret med 5 mg/mL natriumnitrit og 10 U/mL heparin, pH 7,4, varm til 37 ° C før brug). Straks skæres højre atrium med fine saks og begynde at perfuse kroppen med de varme PBS, indtil væsken spændende højre atrium er klart.
Bemærk: Anslået 5-10 mL PBS er nødvendig for neonatal mus og 10-20 mL PBS for voksne mus. - Holde nålen på plads og skifte til en anden sprøjte fyldt med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, pH 7,4). Perfuse 10 mL og 20 mL af fiksativ for neonatal og P21 mus, hhv.
Forsigtig: PFA er giftigt. Det kan forårsage hud og respiratoriske irritationer og øjenskader. Bære handsker og arbejde under en kemisk hætte.
- Halshugge PFA-fast musen og skar kraniet knogle med saks.
- Forsigtigt løfte baghjernen fra bunden af kraniet med lille pincet. Ved det første tegn på sella turcica, stop løfte men hold baghjernen, skære hypofyse stilk og nerve fibre tilslutning til bunden af hjernen med fine sakse. Dette trin er afgørende for at sikre, at hypofysen ikke er løftet væk med hjernen.
- Derefter holde løfte hjernen og fjerne hele hjernen for at udsætte hypofysen fuldt ud. Skære hele sella regionen herunder hypofysen, lateral trigeminus nerver, og den under sphenoid knoglen med saks (ca 3 x 5 mm 2).
- Sætte dissekeret vævet ind i en 35 mm parabol eller et godt af en 6-godt plade med 2 mL koldt 4% PFA (pH 7,4). Løs væv ved 4 ° C i 40 min for P0 - P7 pituitaries, 1 h for P14 pituitaries, 1,5 h for P21 - P28 pituitaries og 3 h for voksen pituitaries.
- Yderligere dissociation af hypofyse
- vaske den faste væv med 10 mL PBS, 5 ændringer, 15 min. Neonatal hypofysen sammen med de omgivende væv og den under sphenoid knoglen kan forarbejdes direkte til dehydrering. Dog hypofyse fra mus ældre end 5 dage bør adskilles yderligere under et stereo mikroskop.
- Sætte den fast væv i en 35 mm skål indeholdende 1 mL PBS. P5 - P14 pituitaries, fjerne bindevæv membraner mellem nerver og knogler med fine pincet og saks og forsigtigt isolere hypofysen sammen med lateral trigeminus nerver som helhed, men forlader sella turcica. Isolerede kirtel og nerver er forbundet med bindevæv membraner med en " H "-indkvartering udseende ( figur 1B).
- For P21 og voksen pituitaries, fjerne nerver og bindevæv membraner omkring hypofysen og gratis kirtel fra det omgivende væv. Wrap den hypofyse væv med linse rengøring silkepapir og sætte det ind i en indlejring kassette.
Bemærk: Indpakning lille hypofysen med linse rengøring silkepapir hjælper med at forebygge potentielle tab af enheder og bevare vævet intakt i følgende paraffin-embedding procedure. Det kan ikke være nødvendigt at omkranse hypofysen, hvis det er forarbejdet i en lille flaske i proceduren cryo-indlejring.
2. Paraffin indlejring og Sectioning
- dehydrere modellerne i indlejring kassetter med 50%, 65%, 75% og 95% ethanol løsninger for 15 min. Efterfølgende dehydrere med 3 ændringer af ren ethanol, 3 min for P0 - P4 kirtler, 4 min til P5 - P14 kirtler, og 5 min til P21 og ældre kirtler. Klar med xylen, 3 ændrer, 3 min for P0 - P4 kirtler, 4 min til P5 - P14 kirtler, og 5 min til P21 og ældre kirtler. Infiltrere med smeltet paraffin voks, 3 ændringer, 7 min til P0 - P4 kirtler, og 8 min to gange efterfulgt af 6 min en gang til P5 og ældre kirtler.
Bemærk: De optimale parametre for væv behandling kan empirisk indstillet. For at opnå høj kvalitet dele, bør utilstrækkelig eller over dehydrering undgås. Det samme gælder for clearing væv ved hjælp af xylen. - Orientering når indlejring
- på en væv indlejring konsol system, fjerne modellen fra kassetten og læg det i en base mug halvt fyldt med smeltet paraffin voks. Ordentlig orientering af indlejring hypofysen er afgørende for tilfredsstillende koronale sektioner.
- For P21 og voksen hypofyse, Placer hypofysen med sin korte akse vinkelret på bunden overfladen af en base mug (sektionsplan). Bruge sphenoid knogler og trigeminus nerver som anatomiske landemærker for P0 - P4 og P5 - P14 pituitaries, henholdsvis. Orientere prøver med deres trigeminus nerver eller tværgående lamina af sphenoid knogler vinkelret på bunden overfladen af en base mug.
- Forsigtigt holde væv i den ønskede position med varmede fine pincet indtil voks bliver halvfast på en afkøling plade. Top op mold med smeltet paraffin voks. Tillad paraffin blok til afkøling indtil voks er fuldt størknede.
Bemærk: Hypofysen på embryonale dag 18,5 (E18.5) kan behandles på samme måde som neonatal hypofysen. Men pituitaries (Rathke ' s poser) yngre end E16.5 bør være integreret med hele hovedet og orienteret med sagittal akse (fra munden til nakkeknude) vinkelret på bunden overfladen af en base mug.
- Chill paraffin blok ved-20 ° C i 10-20 min og derefter skære den i tynde skiver (4 µm tykkelse foretrækkes) med en mikrotom. For at få tilfredsstillende koronale sektioner, finjustere placeringen af paraffinblokke ved skæring. Montere væv skiver på polylysine-belagt glas dias til at forhindre udstationering af skiver i følgende procedurer.
Bemærk: Alternativt prøver kan blive dehydreret i 15%, 30% (W/V) saccharose løsninger (i PBS) ved 4 ° C indtil de synker til bunds, indlejret i cryo-embedding sammensatte ved hjælp af metoden samme orientering, og hurtigt frosset på tøris. Derefter skæres de frosne væv blokke i skiver af 8-10 µm ved hjælp af en kryostaten. Morfologi af cryo-sektioner, men er ofte ringere end paraffin afsnit.
3. H & E farvning og immunfluorescens mærkning
- varm dias på en varme blokere ved 55 ° C og afvoksning med xylen, 2 ændringer, 4 min. hver. Dehydrere prøver med 95% ethanol to gange og 75% ethanol to gange, 3 min. Vaske dias med destilleret vand i 5 min. på en shaker.
- For H & E farvning, pletten sektioner i alun hæmatoxylin løsning i 6 min., skyl i runnING vand fra hanen i 2 min., differentiere med 0,2% ammoniak vand til 45 s, og igen skylles under rindende vand i 2 min. Derefter dehydrere sektioner med 95% ethanol til 1 min og farvning med eosin for 2 min. sekventielt dehydrere, klart, og montere.
- Immunofluorescens mærkning
- behandle afsnittene med methanol der indeholder 3% H 2 O 2 og 0,01% NaN 3 i 20 min. ved stuetemperatur til at inaktivere endogene peroxidases. Hente antigener ved kogning sektioner i hentning buffer (1 mM EDTA og 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) i en trykkoger i 2 min. Incubate sektioner med blokerende buffer (5% ged serum i PBS) for 30 min. ved 37 ° C.
- Ruger sektioner med kanin anti-væksthormon (GH) antistof (1:2, 000) eller kanin anti-glial fibrillære sure protein (GFAP) antistof (1:2, 000) fortyndet i blokerende buffer natten over ved 4 ° C.
- Inkuberes sektioner med sekundær antistof (ged anti-kanin IgG-HRP, 1: 300 i blokerende buffer) i 35 minutter ved 37 ° C.
- Forstærke de signaler ved hjælp af Biotinyl Tyramide (1:50 i Tris bufferet saltvand indeholder 0,3% H 2 O 2) i 15 min. ved stuetemperatur, og visualisere med Streptavidin-Alexa594 eller 488 (1: 300 i blokerende buffer, 30 min, 37 ° C).
- Counterstain kerner med DAPI (50 mg/L i PBS) i 5 min ved stuetemperatur.
Bemærk: Det kan ikke være nødvendigt at forstærke signalet ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning (TSA) system. Alternativt, et fluorescens-konjugeret sekundær antistof kan bruges til at visualisere signalet.
- Erhverve billeder ved hjælp af et fluorescens mikroskop udstyret med DAPI, Texas rød og FITC filter sæt, × 4/0,13 × 40/0,75 mål og 5,0 megapixelkamera. Bruge 360, 488 og 594 nm laser bølgelængder for billedbehandling DAPI, Alexa 488- og Alexa 594-farvede sektioner. Optimere laser power (0,8 blev anvendt generelt) og eksponeringstid til de ønskede niveauer for hver kanal. Fange billedet under kontrol af image erhvervelse software og overlay fluorescens billeder senere ved hjælp af billedbehandlingsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol udgør en metode til at dissekere hypofyse fra udvikle mus. For neonatal musen, hele sella regioner med hypofysen, trigeminus nerver og nedenunder sphenoid knoglen var dissekeret ud fra kraniet base. De små og sarte hypofysen forblev intakt i løbet af processen (figur 1A). For mus ældre end 5 dage, hypofyse knyttet til de laterale trigeminus nerver var så isolerede. Grov struktur af hypofysen isoleret fra P7 mus var velbevarede (figur 1B). For P21 mus, var størrelsen af hypofysen steget bemærkelsesværdigt sammenlignet med neonatal musen. Hypofysen blev succesfuldt isolerede med usynlige skader mens du fjerner dens omkringliggende væv (figur 1 c).
For at se den maksimale region af både adenohypophysis og neurohypophysis i en enkelt skive af hypofysen, foretrækkes en koronale sektion. Den dissekerede hypofyse blev ordentligt orienteret at opnå tilfredsstillende koronale sektioner. H & E farvning viste godt bevaret morfologi af både adenohypophysis og neurohypophysis i P0, P7 og P21 hypofyse (figur 2).
De forarbejdede skiver var også kompatibel med immunofluorescens mærkning. Som et eksempel, adenohypophysis og neurohypophysis viste særlige immunolabeling af GH og GFAP, henholdsvis (figur 3).
Figur 1: dissektion af postnatal udvikling hypofyse. Dorsale udsigt over dissekeret hypofyse og omkringliggende væv fra P0, P7 og P21 mus. A, forreste; Pedersen, posterior; L, venstre; Rasmussen, højre; SB, sphenoid knoglen; TN, trigeminusnerven; AH, adenohypophysis; NH, neurohypophysis. Skalere barer, 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: histologi af musen hypofyse. Repræsentant H & E farvning på hypofyse koronale sektioner fra P0, P7 og P21 mus. (A, Bog C) er lav forstørrelse udsigt over koronale pituitaries. (D, Eog F) er udvidelsen af de indrammede områder i (A, Bog C) henholdsvis. Skalere barer = 1 mm i (A, B og C); og 20 µm (D, E og F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant immunfluorescent farvning på hypofyse. (A) GH (red) var specielt udtrykt i adenohypophysis fra P7 mus. (B) Magnified billede af området indrammet i A. (C) GFAP (grøn) var specielt udtrykt i neurohypophysis fra P21 mus. (D) Magnified billede af området indrammet i C. kerner var plettet med DAPI (blå). Skalalinjen = 300 µm (A og C); og 30 µm (B og D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at udvikle murine pituitaries, har det været teknisk vanskeligt at opnå ordentlig koronale sektioner på grund af deres lille og skrøbelig funktioner og unikke anatomiske karakteristika6,8. Nogle forskningsgrupper således valgte midten af sagittal sektioner til at analysere morfologi af embryonale og neonatal hypofyse11,12. Midten af sagittal sektion af hypofysen er også i stand til at vise anterior, mellemliggende og posterior lapper i en enkelt skive, koronale sektion er meget foretrukne, da det kan vise en maksimal visning af disse tre lapper. Især for kvantificering studies, bestemmelse af volumen og område af hypofysen og tælle antallet af apoptotiske og prolifererende celler, er koronale sektioner overlegen i forhold til midten af sagittal sektioner med hensyn til deres repræsentant. Her præsenterer vi et nyttigt at dissekere hypofyse og forberede hypofyse koronale sektioner fra udvikle mus metode.
For at undgå at beskadige hypofyse under processen, har flere teknikker været brugt i denne protokol. Først, mus er fastsat af transcardial perfusion af formaldehyd før dissektion. Dette fiksativ ikke kun hjælper til at bevare orgel arkitekturen, men også fjerne røde blodlegemer, hvilket ofte resulterer i auto fluorescens13. For det andet er hele sella region dissekeret for at undgå at berøre hypofysen med nogen hårde-kirurgiske værktøjer. Det omgivende væv hjælpe at holde hypofysen i sin oprindelige holdning og også fungere som vartegn for indlejring orientering. Med disse metoder, kan mindre postnatal pituitaries fra yngre dyr dissekeret, samtidig med at reducere sandsynligheden for uønskede skader.
Dissektion procedure i denne protokol gælder også isolere murine hypofysen, der ikke er fastsat forud af perfusion. I så fald større forsigtighed bør træffes for at undgå uønskede skader og kirtlen bør også blive dissekeret så hurtigt som muligt.
Da udviklingslandene murine pituitaries er meget lille i størrelse, har det været meget svært at orientere dem ordentligt når indlejring. Denne protokol bruger trigeminus nerver eller sphenoid knogler som vartegn, gør det meget lettere orientering skridt. Korrekt orienterede pituitaries er afgørende for at opnå tilfredsstillende koronale sektioner.
I sammendrag leverer vi en forbedret hypofyse dissektion og embedding-protokollen, som er passende til mus på forskellige udviklingsfaser. Anvendelsen af disse procedurer kan opnå tilfredsstillende koronale sektioner af murine hypofyse anvendes til analyse af rutinemæssig histologi, immunhistokemi, i situ hybridisering og udviklingsmæssige forskning14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31201086, 31470759 og 31671219) og Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools/Equipment | |||
| Surgical scissors-straight | JinZhong | J21010 | can be purchased from other vendors |
| Fine scissors-strainght | JinZhong | WA1010 | can be purchased from other vendors |
| Blunt forceps | JinZhong | JD1020 | can be purchased from other vendors |
| Fine forceps | Dumont | RS-5015 | for isolation of the pituitary |
| 26G (0.45mm) needle | HongDa | for transcardial perfusion | |
| Syringe (1 mL) | BD | 300841 | can be purchased from other vendors |
| Syringe (10 mL) | BD | can be purchased from other vendors | |
| 35mm dish | Corning | 430165 | can be purchased from other vendors |
| Lens cleaning paper | ShuangQuan | can be purchased from other vendors | |
| Anatomical microscope | OLYMPUS | SZX-ILLB2-200 | can be purchased from other vendors |
| Embedding cassette | Thermo Fisher | 22-272423 | can be purchased from other vendors |
| Tissue embedding console system | KEDEE | KD-BM11 | can be purchased from other vendors |
| Microtome | Thermo Fisher | HM315R | can be purchased from other vendors |
| Superfrost-Plus slides | Thermo Fisher | 22-037-246 | can be purchased from other vendors |
| Cover glass | Thermo Fisher | 12-543 | can be purchased from other vendors |
| Fluorescence microscope | OLYMPUS | BH2-RFCA | can be purchased from other vendors |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Urethane | BBI | EB0448 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | for PBS |
| KCl | Sigma | P9541 | for PBS |
| Na2HPO4.12H2O | Sigma | 71650 | for PBS |
| K2HPO4 | Sigma | P2222 | for PBS |
| NaNO2 | Sigma | 237213 | |
| Heparin Sodium Injection | SPH | H31022051 | for perfusion saline |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Xylene | SCR | 10023418 | |
| Paraffin | Thermo Fisher | 8330 | |
| Hematoxylin | Sigma | H9627 | for H&E staining |
| Eosin Y | Sigma | E4009 | for H&E staining |
| rabbit anti growth hormone (GH) | National Hormone | for immunostaining | |
| antibody | Pituitary Program | ||
| Rabbit anti-mouse GFAP antibody | Sigma | G9269 | for immunostaining |
| Goat anti-rabbit IgG, HRP | Jackson | 111-035-003 | for immunostaining |
| TSA system | NEN Life Science Products | NEL700 | for immunostaining |
| Streptavidin, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | S32356 | for immunostaining |
| Anti-FITC Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A11090 | for immunostaining |
References
- Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P.
- Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
- Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
- Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
- Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
- Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
- Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
- Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
- Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
- Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
- Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
- Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
- Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
- Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).
