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Developmental Biology

विच्छेदन और राज्याभिषेक टुकड़ा माउस पिट्यूटरी ग्रंथि के विकास की तैयारी

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56356
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathophysiology, Second Military Medical University, 2Department of Cell Biology, Second Military Medical University

Summary

हम टुकड़े पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और चूहों के विकास से पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों को तैयार.

Abstract

पिट्यूटरी ग्रंथि या hypophysis एक महत्वपूर्ण अंत में स्रावी अंग स्रावी हार्मोन homeostasis के लिए आवश्यक है । यह अलग भ्रूण मूल और कार्यों के साथ दो ग्रंथियों के होते है-neurohypophysis और adenohypophysis । विकासशील माउस पिट्यूटरी ग्रंथि छोटे और नाजुक एक लंबी अंडाकार आकार के साथ है । एक राज्याभिषेक अनुभाग माउस पिट्यूटरी का एक टुकड़ा में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis प्रदर्शित करने के लिए पसंद है.

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य चूहों के विकास से अच्छी तरह से संरक्षित ऊतक वास्तुकला के साथ उचित पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए है । इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से वर्णन कैसे टुकड़े और प्रक्रिया पिट्यूटरी ग्रंथियों ठीक से चूहों के विकास से । पहला, चूहों विच्छेदन करने से पहले formaldehyde के transcardial छिड़काव द्वारा तय कर रहे हैं. तो फिर तीन अलग विदारक तकनीक चूहों की उम्र के आधार पर बरकरार पिट्यूटरी ग्रंथियों को प्राप्त करने के लिए लागू कर रहे हैं. भ्रूण के लिए चूहों आयु वर्ग के भ्रूण (ई) १७.५-१८.५ और नवजात अप करने के लिए 4 दिन, फन्नी हड्डी, ग्रंथि, और, सेलला सहित संपूर्ण क्षेत्रों में विच्छेदित कर रहे हैं । प्रसव दिन आयु वर्ग के पिल्ले के लिए (पी) 5-14, पिट्यूटरी नसों के साथ जुड़े हुए एक समग्र रूप से कीट ग्रंथियों. 3 सप्ताह से अधिक पुराने चूहों के लिए, पिट्यूटरी ग्रंथियों ध्यान से आसपास के ऊतकों से मुक्त विच्छेदित कर रहे हैं. हम यह भी प्रदर्शित कैसे एक उचित अभिविंयास में पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए स्थलों के रूप में आसपास के ऊतकों का उपयोग करके संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए एंबेड । इन पद्धतियों चूहों के विकास में पिट्यूटरी ग्रंथियों के ऊतकीय और विकासात्मक सुविधाओं का विश्लेषण करने में उपयोगी होते हैं ।

Introduction

पिट्यूटरी ग्रंथि या hypophysis एक महत्वपूर्ण अंत में स्रावी अंग स्रावी हार्मोन homeostasis1,2के लिए आवश्यक है । शारीरिक, पिट्यूटरी ग्रंथि एक ' ' दो में एक ' ' संरचना neurohypophysis और adenohypophysis से मिलकर है । इन भागों अलग भ्रूण मूल और समारोह बहुत अलग है । neurohypophysis तंत्रिका बाह्यत्वक और स्राव ऑक्सीटोसिन और एन्टिडाययूरेटिक हार्मोन से प्राप्त होता है । adenohypophysis Rathke की थैली से शुरू होता है और वृद्धि हार्मोन, प्रोलैक्टिन, थायराइड उत्तेजक हार्मोन, कूप उत्तेजक हार्मोन, luteinizing हार्मोन, adrenocorticotropic हार्मोन सहित हार्मोन की रिहाई के लिए जिंमेदार है, और melanocyte-उत्तेजक हार्मोन3,4,5.

पिट्यूटरी ग्रंथि माउस खोपड़ी के फन्नी अस्थि (सेलला turcica) की पृष्ठीय सतह पर टिकी होती है और एक नाजुक डंठल द्वारा मस्तिष्क की मंजिल से जुड़ी होती है. यह बाद में,6,7ऑप्टिक chiasm द्वारा, और पूर्वकाल में है । ग्रंथि अपनी लंबी धुरी सिर की है कि सीधा के साथ एक लंबी अंडाकार आकार है । इसके पृष्ठीय सतह पर, neurohypophysis और adenohypophysis आसानी से demarcated जा सकता है, पूर्व पृष्ठीय औसत दर्जे का क्षेत्र पर कब्जा और बाद में विस्तार और ventrally के बाद । प्रसव विकास के दौरान, पिट्यूटरी के आकार में तेजी से बढ़ जाती है जन्म के बाद पहले महीने में8,9. फिर भी, माउस पिट्यूटरी अभी भी एक औसत वजन के साथ आकार में बहुत छोटा है १.९ मिलीग्राम और एक लंबे समय के अक्ष व्यास ~ में 3 मिमी के वयस्क10, एक लंबी अक्ष व्यास 2-२.५ मिमी पर प्रसव दिन 21 (P21), और केवल 1-१.५ मिमी पर P0.

एक राज्याभिषेक अनुभाग माउस पिट्यूटरी का एक टुकड़ा में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis प्रदर्शित करने के लिए पसंद है. हालांकि, कुछ तकनीकी कौशल अपने असाधारण छोटे आकार और अलग शरीर रचना विज्ञान के कारण चूहों विकसित करने से पिट्यूटरी ग्रंथियों की संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं । इस वीडियो लेख में, हम प्रदर्शन कैसे माउस पिट्यूटरी ग्रंथियों टुकड़े करने के लिए और विभिंन विकास के चरणों में पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों तैयार करते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > C57BL/6 चूहों विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त शर्तों में पैदा कर रहे हैं । सभी पशु प्रायोगिक तरीके दूसरी सैंय चिकित्सा विश्वविद्यालय में पशु देखभाल और नीतिशास्त्र समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुपालन में हैं ।

< p class = "jove_title" > 1. प्रसव विकासशील पिट्यूटरी ग्रंथि

  1. के विच्छेदन संज्ञाहरण प्रदर्शन: कुचल बर्फ पर जगह नवजात चूहों (P0-P5) हाइपोथर्मिया प्रेरित करने के लिए । चूहों उंर के 5 दिनों से अधिक उम्र के लिए, सुई 5% urethane (30 & #181; L/शरीर के वजन के g/intraperitoneally संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए । पूंछ के लिए प्रतिक्रियाओं का आकलन/ केवल माउस के बाद आगे बढ़ना हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए निष्क्रिय है ।
  2. लापरवाह स्थिति में माउस को सुरक्षित (चेहरे ऊपर की ओर के साथ वापस पर झूठ बोल) धीरे से forepaws और hindpaws एक काम की सतह के लिए है कि सक्षम है पिन किया जा रहा है ( यानी , स्टायरोफोम) एक रासायनिक धुएं हुड के अंदर ।
  3. परफॉर्म transcardial छिड़काव.
    1. हृदय (और अन्य वक्ष अंगों) को बेनकाब करने के लिए सर्जिकल कैंची के साथ माउस ribcage काट.
    2. कुंद संदंश के साथ धड़कते दिल को सुरक्षित और बाईं निलय में एक 26G (०.४५ मिमी) सुई डालें. सुई एक 10 मिलीलीटर heparinized फॉस्फेट से भरा सिरिंज से जुड़ा हुआ है बफर खारा (पंजाब; पूरक के साथ 5 मिलीग्राम/एमएल सोडियम नाइट्राइट और 10 U/एमएल हेपरिन, पीएच ७.४, गर्म करने के लिए ३७ & #176; C उपयोग करने से पहले). तुरंत ठीक कैंची से सही atrium को काट लें और सही atrium के बाहर निकलने से द्रवित होने तक गर्म पंजाबियों के साथ शरीर को perfuse शुरू करें ।
      नोट: लगभग 5-10 एमएल पंजाबियों के लिए नवजात चूहों और वयस्क चूहों के लिए 10-20 मिलीलीटर पंजाब की जरूरत है.
    3. जगह में सुई रखने के लिए और एक और 4% paraformaldehyde (पीएफए, पीएच ७.४) से भरा सिरिंज के लिए बदल जाते हैं । Perfuse 10 मिलीलीटर और नवजात और P21 माउस के लिए निर्धारण के 20 मिलीलीटर, क्रमशः.
      सावधानी: पीएफए विषाक्त है । इसके कारण त्वचा और सांस में जलन, और आंख की क्षति हो सकती है । दस्ताने पहनते है और एक रासायनिक डाकू के तहत काम करते हैं ।
  4. Decapitate पीएफए-फिक्स्ड माउस और कैंची के साथ खुला खोपड़ी की हड्डी काट ।
    1. धीरे छोटे संदंश के साथ खोपड़ी के आधार से hindbrain उठा । सेलला turcica की पहली निशानी पर, उठाना बंद करो, लेकिन hindbrain पकड़, ठीक कैंची के साथ मस्तिष्क के आधार को जोड़ने पिट्यूटरी डंठल और तंत्रिका तंतुओं में कटौती. यह कदम यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पिट्यूटरी मस्तिष्क के साथ दूर नहीं उठाया है ।
    2. तो मस्तिष्क उठाने रखने और पूरे मस्तिष्क को हटाने के लिए पिट्यूटरी ग्रंथि पूरी तरह बेनकाब. पिट्यूटरी ग्रंथि, पार्श्व सेलला नसों सहित पूरे क्षेत्र में कटौती, और कैंची के नीचे फन्नी हड्डी के साथ (लगभग 3 x & #160; 5 मिमी 2 ).
  5. एक ३५ mm डिश या एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी प्लेट से युक्त 2 मिलीलीटर ठंड 4% पीएफए (पीएच ७.४) में विच्छेदित ऊतक डाल दिया । ऊतक को ठीक 4 & #176; ग के लिए ४० मिनट के लिए P0-P7 pituitaries, 1 ज फॉर P14 pituitaries, १.५ ज फॉर P21-P28 pituitaries, और 3 ज फॉर एडल्ट pituitaries.
  6. आगे पिट्यूटरी
    1. के पृथक्करण 10 मिलीलीटर पंजाबियों, 5 परिवर्तन, 15 मिनट प्रत्येक के साथ तय ऊतक धोने । नवजात पिट्यूटरी ग्रंथि अपने आसपास के ऊतकों और नीचे फन्नी हड्डी के साथ एक साथ निर्जलीकरण के लिए सीधे संसाधित किया जा सकता है । हालांकि, 5 दिनों से अधिक पुराने चूहों से पिट्यूटरी ग्रंथियों एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत आगे असंबद्ध होना चाहिए.
    2. 1 मिलीलीटर पंजाबियों युक्त ३५ मिमी पकवान में फिक्स्ड ऊतक डाल दिया । P5-P14 pituitaries के लिए, तंत्रिकाओं और ठीक संदंश और कैंची के साथ हड्डी के बीच संयोजी झिल्ली को हटा दें, और ध्यान से एक पूरे के रूप में पार्श्व में एक साथ पिट्यूटरी नसों के साथ, लेकिन सेलला turcica जा रहा है । पृथक ग्रंथि और नसों एक & #34 के साथ संयोजी झिल्ली से जुड़े हुए हैं; ज & #34;-प्रकटन की तरह (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 1b ).
      3. P21 और वयस्क pituitaries के लिए
    3. , तंत्रिकाओं और पिट्यूटरी के आसपास संयोजी झिल्ली को हटाने और आसपास के ऊतकों से ग्रंथि मुक्त । ऊतक कागज सफाई लेंस के साथ पिट्यूटरी ऊतक लपेटें और यह एक एंबेडिंग कैसेट में डाल दिया ।
      नोट: लेंस सफाई ऊतक कागज के साथ छोटे पिट्यूटरी लपेटन नमूनों की किसी भी संभावित नुकसान को रोकने और निंनलिखित तेल embedding प्रक्रिया में ऊतक अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है । यह क्रायो-embedding प्रक्रिया में एक छोटी बोतल में संसाधित है, तो पिट्यूटरी रैप करने के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है ।
< p class = "jove_title" > 2. आयल एंबेडिंग और अनुभागन

  1. निर्जलीकरण ५०%, ६५%, ७५%, और ९५% 15 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल के समाधान के साथ कैसेट एंबेडिंग में नमूनों । शुद्ध इथेनॉल के 3 परिवर्तन के साथ बाद में निर्जलीकरण, 3 P0 के लिए प्रत्येक मिन-पी 4 ग्रंथियों, P5-P14 ग्रंथियों, और 5 P21 के लिए प्रत्येक मिनट और पुराने ग्रंथियों के लिए प्रत्येक मिनट । xylene के साथ स्पष्ट, 3 परिवर्तन, 3 P0 के लिए प्रत्येक मिन-पी 4 ग्रंथियों, P5-P14 ग्रंथियों, और 5 P21 और पुराने ग्रंथियों के लिए एक मिनट के लिए प्रत्येक मिनट पिघला हुआ तेल मोम, 3 परिवर्तन, 7 P0 के लिए प्रत्येक मिनट-पी 4 ग्रंथियों, और 8 मिनट के साथ घुसपैठ P5 और पुराने ग्रंथियों के लिए एक बार 6 मिनट के बाद ।
    नोट: ऊतक प्रसंस्करण के लिए इष्टतम मापदंडों empirically समायोजित किया जा सकता है । उच्च गुणवत्ता वर्गों प्राप्त करने के लिए, अपर्याप्त या अधिक निर्जलीकरण से बचा जाना चाहिए । एक ही xylene.
    2. का उपयोग कर ऊतक समाशोधन के लिए सच है
  2. उंमुखीकरण जब एक ऊतक embedding कंसोल सिस्टम पर
    1. embedding, कैसेट से नमूना हटाने और यह एक आधार मोल्ड आधा पिघला हुआ तेल मोम से भरा में जगह है । एंबेडिंग पिट्यूटरी ग्रंथि के समुचित अभिविन्यास संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों के लिए आवश्यक है ।
      2. P21 और वयस्क पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए
    2. , अपनी छोटी धुरी के साथ पिट्यूटरी ग्रंथि की स्थिति एक आधार मोल्ड के नीचे सतह के लिए (धारा विमान). क्रमशः P0-पी 4 और P5-P14 pituitaries के लिए शारीरिक स्थलों के रूप में फन्नी हड्डियों और एक प्रकार का प्रयोग करें । ओरिएंट उनके एक आधार मोल्ड के नीचे की सतह के लिए सीधा फन्नी हड्डियों के आड़ा लेमिना या के साथ नमूनों ।
    3. धीरे गर्म ठीक संदंश के साथ वांछित स्थिति में ऊतक पकड़ जब तक मोम अर्द्ध एक ठंडा प्लेट पर ठोस हो जाता है । पिघला हुआ आयल मोम के साथ मोल्ड ऊपर । तेल ब्लॉक की अनुमति दें जब तक मोम पूरी तरह से जम गया है ठंडा करने के लिए ।
      नोट: भ्रूण दिवस १८.५ (ई 18.5) में पिट्यूटरी नवजात पिट्यूटरी के रूप में एक ही रास्ते में इलाज किया जा सकता है । लेकिन pituitaries (Rathke & #39; s पाउच) ई 16.5 की तुलना में छोटे पूरे सिर के साथ एंबेडेड किया जाना चाहिए और sagittal अक्ष (मुंह से occiput) के साथ सीधा एक आधार मोल्ड के नीचे की सतह के लिए ।
  3. चिल आयल ब्लॉक at-20 & #176; C 10-20 मिनट के लिए और फिर इसे पतले स्लाइस में काट लें (4 & #181; m मोटाई पसंद है) एक microtome के साथ । संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों पाने के लिए, ठीक धुन के दौरान आयल ब्लॉकों की स्थिति । polylysine-लेपित कांच स्लाइड पर ऊतक स्लाइस को निंनलिखित प्रक्रियाओं में स्लाइस की टुकड़ी को रोकने के लिए माउंट ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, नमूनों 15% में निर्जलित किया जा सकता है, 30% (डब्ल्यू/वी) सुक्रोज समाधान (पंजाब में) पर 4 & #176; सी जब तक वे नीचे, क्रायो में एंबेडेड-एंबेडिंग यौगिक एक ही अभिविंयास विधि का उपयोग कर, और जल्दी से सूखी बर्फ पर जमे हुए । फिर जमे हुए ऊतक ब्लॉकों में कटौती 8-10 & #181; m एक cryostat का उपयोग कर के स्लाइस में । क्रायो की आकृति विज्ञान-वर्गों, तथापि, अक्सर आयल वर्गों के लिए अवर है ।
< p class = "jove_title" > 3. ज & #38; ई धुंधला और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग

  1. हीट ब्लॉक पर स्लाइड ५५ & #176; सी और dewax के साथ xylene, 2 परिवर्तन, 4 मिनट प्रत्येक । निर्जलीकरण के साथ नमूनों ९५% दो बार और ७५% इथेनॉल दो बार, 3 मिनट प्रत्येक । एक शेखर पर 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ स्लाइड धो लो ।
  2. H & #38; ई धुंधला, फिटकिरी hematoxylin समाधान में वर्गों के लिए 6 मिनट के लिए, runn में कुल्ला दागआईएनजी 2 मिनट के लिए नल का पानी, ४५ एस के लिए ०.२% अमोनिया पानी के साथ अंतर, और 2 मिनट के लिए पानी चलाने में पुनः कुल्ला । तो 1 मिनट और 2 मिनट के लिए eosin के साथ दाग के लिए ९५% इथेनॉल के साथ वर्गों निर्जलीकरण । क्रमिक रूप से निर्जलीकरण, स्पष्ट, और माउंट ।
  3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग
    1. वाले अनुभागों का इलाज 3% H मेथनॉल 2 O 2 और ०.०१% नण 3 के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूचनाको अंतर्जात । (1 मिमी EDTA और 1 mm Tris-HCl, pH ७.४) में 2 मिनट के लिए एक दबाव कुकर में अनुभागों को उबालने के द्वारा प्रतिजनों पुनः प्राप्त करें । (पंजाब में 5% बकरी सीरम) अवरुद्ध बफर के साथ वर्गों की मशीन 30 मिनट के लिए ३७ & #176; C.
    2. खरगोश विरोधी वृद्धि हार्मोन (GH) एंटीबॉडी के साथ गर्मी वर्गों (1:2000) या खरगोश विरोधी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) एंटीबॉडी (1:2000) बफर अवरुद्ध में पतला पर रातोंरात 4 & #176; C.
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन वर्गों (बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी-एचआरपी, 1:300 बफर अवरुद्ध में) ३५ मिनट के लिए ३७ & #176; C.
    4. Biotinyl Tyramide (1:50 में Tris बफर खारा युक्त ०.३% एच 2 हे 2 ) का उपयोग कर संकेतों को बढ़ाना कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए, और Streptavidin-Alexa594 या ४८८ के साथ कल्पना (1:300 अवरुद्ध बफर में, 30 मिनट, ३७ & #176; C).
    5. Counterstain कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए DAPI के साथ नाभिक (५० mg/ नोट: यह Tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) प्रणाली का उपयोग कर संकेत बढ़ाना आवश्यक नहीं हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी संकेत कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. DAPI, टेक्सास रेड, और FITC फिल्टर सेट से सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण, & #215; 4/0.13 से & #215; 40/0.75 उद्देश्य और ५.० मेगापिक्सेल कैमरा । इमेजिंग DAPI, alexa ४८८ के लिए ३६०, ४८८, और ५९४ एनएम लेजर तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें-, और alexa ५९४-सना हुआ वर्गों, क्रमशः । अनुकूलन लेजर शक्ति (०.८ आम तौर पर इस्तेमाल किया गया था) और प्रत्येक चैनल के लिए वांछित स्तर के लिए जोखिम समय । छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के नियंत्रण के तहत छवि पर कब्जा और बाद में छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति छवियों ओवरले ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल चूहों को विकसित करने से पिट्यूटरी ग्रंथियों टुकड़े करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है. नवजात चूहे के लिए, पूरे सेलला पिट्यूटरी ग्रंथि, और नीचे फन्नी हड्डी युक्त क्षेत्रों खोपड़ी आधार से बाहर विच्छेदित किया गया । छोटे और नाजुक पिट्यूटरी ग्रंथि (चित्र 1a) प्रक्रिया के दौरान बरकरार रहे । 5 दिनों से अधिक उम्र के चूहों के लिए, पार्श्वी के साथ जुड़ी हुई पिट्यूटरी नसों को फिर अलग किया गया । P7 माउस से पृथक पिट्यूटरी ग्रंथि की सकल संरचना अच्छी तरह से संरक्षित किया गया था (चित्र 1b). P21 माउस के लिए, पिट्यूटरी ग्रंथि के आकार उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी कि नवजात चूहे की तुलना में. इसके आसपास के ऊतकों (चित्रा 1C) को हटाने के दौरान पिट्यूटरी ग्रंथि को सफलतापूर्वक अदृश्य क्षति के साथ अलग किया गया था ।

पिट्यूटरी का एक स्लाइस में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis के अधिकतम क्षेत्र को देखने के लिए, एक राज्याभिषेक अनुभाग पसंद है. विच्छेदित पिट्यूटरी ग्रंथि ठीक से संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए उंमुख थे । ज & #38; ई धुंधला P0, P7, और P21 पिट्यूटरी ग्रंथियों (चित्रा 2) में दोनों adenohypophysis और neurohypophysis की अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान दिखाया.

प्रोसेस्ड स्लाइस भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग के साथ संगत थे । उदाहरण के रूप में, adenohypophysis और neurohypophysis ने GH और GFAP की विशिष्ट immunolabeling दिखाई, क्रमशः (चित्र 3) ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रसव के विच्छेदन पिट्यूटरी ग्रंथियों का विकास. P0, P7, और P21 चूहों से विच्छेदित पिट्यूटरी ग्रंथियों और आसपास के ऊतकों के पृष्ठीय विचार । एक, पूर्वकाल; P, पीछे; L, वाम; R, right; शादाब, फन्नी वाढ; तमिलनाडु, आह, adenohypophysis; एनएच, neurohypophysis । स्केल बार्स, 1 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस पिट्यूटरी ग्रंथियों के प्रोटोकॉल. प्रतिनिधि ज & #38; P0, P7, और P21 चूहों से पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों पर ई धुंधला । (A, B, और C) राज्याभिषेक pituitaries के कम आवर्धन दृश्य हैं । (D, E, और F) में क्रमश: (A, B, और C) में फ़्रेम किए गए क्षेत्रों का इज़ाफ़ा होता है । स्केल सलाखों = 1 मिमी में (ए, बी, और सी); और 20 µm (D, E, और F) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिनिधि immunofluorescent पिट्यूटरी ग्रंथियों पर दाग । (क) GH (red) विशेष रूप से P7 चूहों से adenohypophysis में व्यक्त किया गया था. (ख) ए में फंसा क्षेत्र की छवि बढ़ाया (ग) GFAP (हरा) विशेष रूप से P21 चूहों से neurohypophysis में व्यक्त किया गया था । (घ) C. नाभिक में फंसाया क्षेत्र की छवि बढ़ाया DAPI (नीला) के साथ दाग थे । स्केल बार = ३०० µm (A और C); और 30 µm (बी और डी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

murine pituitaries के विकास के लिए, यह तकनीकी रूप से उनके छोटे और नाजुक सुविधाओं और अद्वितीय शारीरिक विशेषताओं6,8के कारण उचित राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो गया है । कुछ अनुसंधान समूहों इस प्रकार मध्य sagittal वर्गों के लिए भ्रूण और नवजात पिट्यूटरी11,12की आकृति विज्ञान का विश्लेषण चुना. हालांकि पिट्यूटरी के मध्य sagittal अनुभाग एक स्लाइस में पूर्वकाल, मध्यवर्ती, और पीछे पालियों को दिखाने में भी सक्षम है, राज्याभिषेक खंड अत्यधिक पसंद है क्योंकि यह इन तीन पालियों का अधिकतम दृश्य दिखा सकता है । विशेष रूप से, ठहराव अध्ययन के लिए, इस तरह की मात्रा और पिट्यूटरी ग्रंथि के क्षेत्र के निर्धारण और अपोप्तोटिक और proliferating कोशिकाओं की संख्या की गिनती के रूप में, राज्याभिषेक वर्गों मध्य sagittal वर्गों के लिए अपने प्रतिनिधि के संदर्भ में बेहतर कर रहे हैं. यहाँ, हम एक विधि टुकड़े पिट्यूटरी ग्रंथियों के लिए उपयोगी है और चूहों के विकास से पिट्यूटरी राज्याभिषेक वर्गों को तैयार करने के लिए प्रस्तुत करते हैं ।

प्रक्रिया के दौरान पिट्यूटरी ग्रंथियों को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए, कई तकनीकों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है । पहला, चूहों विच्छेदन करने से पहले formaldehyde के transcardial छिड़काव द्वारा तय कर रहे हैं. यह निर्धारण न केवल अंग वास्तुकला के संरक्षण में मदद करता है, लेकिन यह भी लाल रक्त कोशिकाओं है जो अक्सर ऑटो प्रतिदीप्ति13में परिणाम को दूर करने के लिए । दूसरा, पूरे सेलला क्षेत्र किसी भी हार्ड सर्जिकल उपकरणों के साथ पिट्यूटरी ग्रंथि को छूने से बचने के लिए विच्छेदित है । आसपास के ऊतकों को अपनी मूल स्थिति में पिट्यूटरी ग्रंथि रखने के लिए और भी उंमुखीकरण embedding के लिए स्थलों के रूप में काम करने में मदद । इन तरीकों के साथ, छोटे प्रसव pituitaries छोटे जानवरों से अवांछित नुकसान की संभावना को कम करने whilst विच्छेदित किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल में विच्छेदन प्रक्रिया भी murine पिट्यूटरी है कि पूर्व छिड़काव द्वारा तय नहीं किया गया है अलग करने के लिए लागू है. उस स्थिति में, किसी भी अवांछित क्षति से बचने के लिए अधिक सावधानी बरती जानी चाहिए और ग्रंथि को यथासंभव शीघ्रता से विच्छेदित भी किया जाना चाहिए ।

के बाद से विकासशील murine pituitaries आकार में बहुत छोटे हैं, यह बहुत मुश्किल हो गया है उंहें ठीक से मालूम जब एंबेडिंग । इस प्रोटोकॉल स्थलों के रूप में, और अभिविंयास कदम बहुत आसान बना रही है फन्नी हड्डियों का उपयोग करता है । ठीक उंमुख pituitaries संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।

संक्षेप में, हम एक बेहतर पिट्यूटरी विच्छेदन और embedding प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो विभिन्न विकास चरणों में चूहों के लिए उपयुक्त है. इन प्रक्रियाओं के आवेदन murine पिट्यूटरी ग्रंथियों की संतोषजनक राज्याभिषेक वर्गों को नियमित प्रोटोकॉल, immunohistochemistry के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए प्राप्त कर सकते हैं, सीटू संकरण में , और विकासात्मक अनुसंधान14.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ऑफ चाइना (३१२०१०८६, ३१४७०७५९ और ३१६७१२१९) और शंघाई नेचुरल साइंस फाउंडेशन (12ZR1436900) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight JinZhong J21010 can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght JinZhong WA1010 can be purchased from other vendors
Blunt forceps JinZhong JD1020 can be purchased from other vendors
Fine forceps Dumont RS-5015 for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle HongDa for transcardial perfusion
Syringe (1 mL) BD 300841 can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL) BD can be purchased from other vendors
35mm dish Corning 430165 can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper ShuangQuan can be purchased from other vendors
Anatomical microscope OLYMPUS SZX-ILLB2-200 can be purchased from other vendors
Embedding cassette Thermo Fisher 22-272423 can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system KEDEE KD-BM11 can be purchased from other vendors
Microtome Thermo Fisher HM315R can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides Thermo Fisher 22-037-246 can be purchased from other vendors
Cover glass Thermo Fisher 12-543 can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope OLYMPUS BH2-RFCA can be purchased from other vendors
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Urethane BBI EB0448
NaCl Sigma S9625 for PBS
KCl Sigma P9541 for PBS
Na2HPO4.12H2O Sigma 71650 for PBS
K2HPO4 Sigma P2222 for PBS
NaNO2 Sigma 237213
Heparin Sodium Injection SPH H31022051 for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Ethanol SCR 10009218
Xylene SCR 10023418
Paraffin Thermo Fisher 8330
Hematoxylin Sigma H9627 for H&E staining
Eosin Y Sigma E4009 for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH) National Hormone for immunostaining
antibody Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody Sigma G9269 for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP Jackson 111-035-003 for immunostaining
TSA system NEN Life Science Products NEL700 for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher S32356 for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488 Thermo Fisher A11090 for immunostaining

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References

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Cao, D., Ma, X., Zhang, W. J., Xie, Z. Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland. J. Vis. Exp. (129), e56356, doi:10.3791/56356 (2017).

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